DEUXIÈME PARTIE

REMARQUES GÉNÉRALES SUR LA BIOLOGIE DES LEVURES DU VIN ET LEUR ROLE DANS LA VINIFICATION

Caractères morphologiques des cellules.

Presque toutes les races de Levures isolées au cours de cette étude peuvent être rangées dans les trois types : ellipsoideus, cerevisiae et pastorianus caractérisés respectivement par des cellules elliptiques, ovoïdes ou allongées en forme de saucisse. Toutefois, quelques races sont constituées par des cellules nettement plus longues que celles du S. ellipsoideus et plus courtes que celles des races type pastorianus. Elles ont été groupées dans un type intermédiaire appelé type ellipsoideo-pastorianus.

Les races type cerevisiae sont rares, celles des types pastorianus et ellipsoideo-pastorianus plus fréquentes et celles du type ellipsoideus de beaucoup les plus répandues.

Généralement, plusieurs races des différents types se développent, côte à côte, dans les vins en fin de fermentation. Dans le Muscadet nantais, par exemple, sur cinq races isolées, deux appartiennent au type ellipsoideus (Races Nos4et5), deux autres au type pastorianus (Races N°8 1 et 2) et la cinquième au type ellipsoideopastorianus.

Mais les races d’un certain type isolées d’un même vin ont beaucoup plus d’analogies entre elles qu'avec celles du même type mais provenant d’un autre vin. Les deux précédentes races de pastorianus sont formées de cellules assez ressemblantes, par contre, elles diffèrent nettement des races type pastorianus isolées du vin de Sauvignon. Celles-ci, également très ressemblantes entre elles, sont bien distinctes des races type paslorianus isolées des vins de Mont.

Ces remarques nous amènent à conclure, qu’au point de vue de la morphologie cellulaire, les groupes des races de chacun des types ellipsoideus, cerevisiae, ellipsoideo-pastorianus et pastorianus sont assez spéciaux pour chaque vin.

Le tableau ci-après reproduit les résultats de nos observations.

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La sporulation.

Presque toutes les races précédentes possèdent la propriété de sporuler d’une manière remarquablement constante. Une seule est restée asporogène après les tentatives d’enrichissement en ascospores, par chauffage de la culture sur Gorodkowa, à 50-550.

La sporulation, d’une manière générale, est abondante et rapide. Les ascospores, placées dans un milieu nutritif, germent aisément et constituent un matériel de choix pour l’étude des phénomènes sexuels du genre Saccharomyces.

Toutes les observations suivantes ont été faites sur des cultures obtenues sur milieu de Gorodkowa, à température constante. Ces précautions ont permis de comparer les vitesses respectives de sporulation des diverses races. Cultivées à 259, sur Gorodkowa, 33 souches sur 62 sporulent en quatre jours et certaines d’entre elles, notamment les races de S. Sauvignon N°$ 1,2, 4, S. Vouvray-Bourg Nos 1 et 2, S. Saumur N°$ 1 et 2, S.Vouvray 1936 N° 1, renferment, déjà, de nombreux asques 48 heures après l’ensemencement. Parfois, la proportion d’asques représente 95% de l’ensemble des cellules.

16 autres races ont sporulé au bout de 8 jours.

8 autres exigèrent 20 jours de culture.

2 autres ne sporulèrent que faiblement et seulement au bout de 45 jours.

Les tentatives d’enrichissement en ascospores, par chauffage de la culture sporulée, à 55°, nous permirent de découvrir des ascospores sur les races de S. Pouilly-ordinaire N°3 et Mont N°1 qui, d’abord, apparaissaient comme deux races asporogènes. Seule la race de S. Mont N° 4, signalée plus haut, est restée asporogène, même après chauffage de la culture sporulée, sur tous les milieux usuels : Gorodkowa, tranches de carotte ou bloc de plâtre.

La culture sur milieux biologiques, entraîne une diminution du pouvoir sporogène chez toutes les races et, parfois, une disparition totale à plus ou moins longue échéance. Notamment, les races de S.Sauvignon N° 1, S. Bourgueil N° 2, S. Mont N° 9, ont perdu la faculté de sporuler après quatre ans de culture, sur moût de bière gélosé.

Nombre d’ascospores par asque. — Dans toutes les races sporulant abondamment, les asques renferment généralement de 3 à 4 ascospores.

Pour les races sporulant plus difficilement, le nombre d'asques à deux ascospores domine.

Quelques races de Saccharomyces type pastorianus présentent quelques cellules géantes, allongées en forme de saucisse et pouvant atteindre jusqu’à 30 u.

Les asques correspondants peuvent renfermer de 8 à 12 ascospores. Toutefois, dans ce cas, on peut supposer qu’une seule cellule représente, en réalité, un article. Cette anomalie pourrait être rapprochée d’un phénomène analogue observée par GUILLIERMOND (29, g] chez l'Eremascus fertilis. Dans ce champignon, sur un filament terminal, six articles successifs ont produit de nombreux asques, sans que se forment les membranes de séparation.

HANSEN a déjà signalé des asques à 8 ascospores chez certaines races de pastorianus, isolées de bières troubles ; mais les races du type pastorianus recueillies dans les vins de Sauvignon, font fermenter assez activement les jus sucrés et produisent des vins clairs. Elles ne sont donc pas assimilables aux races décrites par HANSEN.

Forme et dimensions des ascospores. — Toutes les races, à l’exception de la race Pouilly-ordinaire N° 3, ont des ascospores de forme identique : elles sont sphériques et lisses. Celles de la race Pouilly-ordinaire N°3 sont souvent elliptiques ou réniformes. Pour beaucoup d'espèces de Levures, la forme de l’ascospore fournit un caractère dichotomique précieux. Dans le genre Debaryomyces, les ascospores sont sphériques et rugueuses ; dans le genre Wäillia elles portent un rebord saillant, comme celui d’un chapeau, ou bien elles sont munies d’un anneau externe, ressemblant à l’anneau de la planète Saturne. Dans le cas des Levures du vin, la forme de l’ascospore n'apporte aucun caractère dichotomique particulier. Au contraire, l’uniformité d'aspect montre l’homogénéité de tout le groupe des races décrites.

Les dimensions peuvent varier d’une race à l’autre. Dans presque toutes les races, il existe une proportion importante d’ascospores mesurant de 3 à 3,5u. Mais pour certaines races les dimensions varient du simple au double. Particulièrement dans les races

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S. Quincy N° 2 et 3, S.Vouvray-Barre N° 1, S.Muscadet N°$ 1 et 2, de S. Vouvray 1936 N° 1, on rencontre à la fois des ascospores de 2,5u et d’autres de 4,5u et même 5. Deux ascospores géantes peuvent se trouver dans un même asque, mais une ou deux naines accompagnent souvent une troisième de grosse taille. En général, les ascospores occupent presque complètement le volume de l’asque, mais, dans certains cas, une ou deux naines sont accolées à la paroi interne, tandis que presque tout le volume interne reste inoccupé.

Les phénomènes de parthénogénèse, qui se manifestent chez certaines races, semblent responsables de la formation des ascospores naines et nous avons remarqué que la proportion d’ascospores de 3 à 3,5u était plus grande chez les races ayant une sexualité régulière.

Keuis et SarAwA [72, b] ont montré que les cultures äérivant de cellules asexuelles gardaient encore la propriété de sporuler mais le pouvoir sporogène des souches-filles était plus faible que celui de la souche initiale. Par des prélèvement successifs, ils ont cherché à obtenir des souches asporogènes. Ils n’aboutirent jamais à un tel résultat. Les deux savants tchèques remarquèrent, d’autre part, que, dans les souches-filles, les ascospores étaient plus petites que dans la souche initiale.

Mais d'importantes découvertes ont été faites sur la sexualité des Levures, depuis les Travaux de Kruïis et SATAwWA. On verra plus loin que, contrairement à ce que l’on pensait à cette époque, dans le genre Saccharomyces, les phénomènes sexuels ne se traduisent pas fatalement par une conjugaison des ascospores deux à deux. Une importante proportion d’entre elles germent, directement, en donnant naissance à de petites cellules qui, très souvent, se fusionnent, deux à deux, pour former des zygospores identiques à celles qui résultent des conjugaisons d’ascospores (1). Le terme de cellules asexuelles ne peut donc pas s'appliquer à toutes celles qui dérivent du bourgeonnement direct des ascospores, mais, seulement, à celles, d’entre elles, qui sont vraiment incapables de se conjuguer deux à deux. Cette restriction nous a amené à reprendre l'étude de la parthénogénèse chez les Levures du vin.

(1) Kruis et SATAWA les premiers ont signalé des conjugaisons s’effectuant aux dépens des cellules deux à deux, mais le phénomène a été précisé par les travaux de WINGE.

En utilisant la méthode du raccourcissement du cycle évolutif, décrite plus loin, au chapitre de la sexualité, nous avons montré que la parthénogénèse existait réellement. Enfin, grâce au micromanipulateur, nous avons pu prélever des cellules issues du bourgeonnement direct de certaines ascospores et étudier leur devenir.

Nos recherches ont porté surtout sur les races de S. Vouvray 1936 N° I'et S. Muscadet nantais N° 4. Dans la première, la parthénogénèse était déjà à peu près complètement installée au moment des observations, mais le dépôt des cellules jeunes sur bloc de plâtre provoquait, au bout de 48 heures, une abondante sporulation. En comparant les souches-filles à la souche initiale, nous n’avons pas constaté de diminution sensible dans la proportion des asques formés. Les asques issus des cellules parthénogénétiques ne renfermaient qu’une ou deux ascospores, le plus souvent de petite taille (2,5 u). Mais cette loi n’est pas exacte au sens absolu. En effet, certaines étaient de taille normale (3 à 3,5u) et parfois de taille géante (4,5 à 5u).

La race S. Muscadet N° 4, très sporogène, est caractérisée par une abondante formation de zygospores, au moment de la germination des ascospores. A l’aide du micromanipulateur de DE FoNT- BRUNE, nous avons trié et placé en goutte de moût de bière liquide, sous chambre à huile, une dizaine d’asques. Au moment de la germination, les ascospores de deux d’entre eux ont bourgeonné, directement, sans phénomènes sexuels. Leurs souches-filles ont sporulé normalement, en produisant des ascospores de taille normale. Certaines ascospores, en germant, ont donné naissance à des zygospores identiques à celles de la souche initiale.

Enfin, une dernière série d'observations a été faite sur d’autres races de Levures faiblement sporogènes. Dans ce cas, les souchesfilles, dérivant du bourgeonnement direct d’ascospores, avaient un pouvoir sporogène plus faible que celui de la souche initiale. Les derniers résultats sont conformes à ceux de KRuIS et SATAWA.

En conclusion, il semble que, si la parthénogénèse entraîne une diminution progressive du pouvoir sporogène des Levures, ainsi que l’apparition d’ascospores naines, Ces modifications ne sont pas immédiates. Elles se font par étapes el leur importance, d’une culture à la suivante, dépend beaucoup des races envisagées.

L'état diploïde des cellules se rétablissant normalement, grâce

aux phénomènes sexuels au moment de la germination des ascospores, semble nécessaire pour qu’à la fin du cycle évolutif une nouvelle sporulation se déclenche régulièrement. La parthénogénèse entraîne, chez les races peu sporogènes, une diminution rapide du pourcentage d’asques formés et l'apparition d’ascospores atrophiées au moment de la sporulation. Pour les races très sporogènes, la dégénérescence est plus lente. Elles semblent d’abord passer par une phase intermédiaire, pendant laquelle elles restent très sporogènes, mais forment, souvent, des ascospores dimorphes.

Remarques biologiques et cytologiques sur la sexualité des levures du vin.

Les recherches de GUILLIERMOND ont montré que, chez les Levures, suivant les espèces, les phénomènes sexuels peuvent se produire à deux stades très différents du cycle évolutif. Pour celles des genres Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Zygopichia, Debaryomyces, ils se manifestent immédiatement avant la sporulation. Certaines cellules végétatives, transformées en gamètes, se fusionnent, deux à deux, en donnant des zygospores dans lesquelles les ascospores prennent naissance. Dans le genre Nadsonia, étudié par NaDpsoN [58], les phénomènes sont analogues, mais les deux noyaux de la zygospore forment un dicaryon au lieu de se fusionner et émigrent dans un bourgeon produit par la zygospore. Après caryogamie, le bourgeon devient un asque.

Par contre, pour les espèces des genres Saccharomycodes, Saccharomyces, Hansenula, la sporulation se fait directement, sans sexualité. Placées dans des conditions d’inanition, par exemple sur bloc de plâtre humide, les cellules végétatives deviennent granuleuses, accumulent du glycogène et se transforment en asques, renfermant généralement de une à quatre ascospores. La sexualité se produit au moment de la germination des ascospores. Dans un milieu nutritif, comme le moût de bière, celles-ci germent assez rapidement et se fusionnent deux à deux, ou bourgeonnent, isolément, en donnant naissance à de petites cellules, qui, comme les ascospores, se conjuguent, bientôt, deux à deux.

Le noyau des Levures étant très petit, il n’est pas possible de compter le nombre des chromosomes avec certitude, mais il est très

vraisemblable d'admettre que, comme pour les autres Ascomycètes, la réduction chromatique s’accomplit au cours des deux premières mitoses de l’asque. Les phénomènes sexuels divisent donc les Levures en deux groupes. Les espèces des genres Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Zygopichia, Debaryomyces, Nadsonia, ont une phase diploïde réduite à la zygospore ; elles forment un premier groupe. Par contre, les espèces des genres Saccharomycodes, Saccharomyces, Hansenula, doivent être rangées dans un second groupe. Pour elles, la diplophase commence à la zygospore et se continue pendant tout le cycle de développement, jusqu’à la sporulation.

Ces faits étant établis d’une manière très sommaire, nous allons maintenant les examiner en détail.

L'étude de la sexualité des Levures a nécessité de longues recherches, dont nous avons déjà brièvement retracé l’histoire, au début de ce travail.

En 1901, simultanément, BARKER [3] en Angleterre et Guic- LIERMOND {29, c] en France découvrirent, dans deux espèces différentes, une Conjugaison isogamique, se produisant à l’origine de l’asque.

A la même époque, GUILLIERMOND [29, a], pour la première fois, caractérisait nettement le noyau des Levures et décrivait, dans l’asque du Schizosaccharomyces octosporus, deux mitoses analogues à celles des asques des autres Ascomycètes. Ces importants résultats mirent en évidence les liens de parenté unissant les Levures aux Ascomycètes et particulièrement aux Ascomycètes inférieurs.

Dans le cas du Schizosaccharomyces octosporus comme dans ceux des Schizosaccharomyces pombe et mellacei, étudiés par Guir- LIERMOND, la conjugaison est isogamique car elle s'effectue entre deux cellules gamètes de même taille. Mais elle peut être hétérogamique et se produire entre une cellule adulte et son bourgeon en voie de formation. Tout le contenu du bourgeon émigre vers la cellule adulte qui deviendra l’asque. Le premier exemple de conjugaison hétérogamique a été signalé par GUILLIERMOND [29, i] chez le Zygospichia Chevalieri, rapporté d'Afrique occidentale par la mission Chevalier. Enfin, dans toutes les espèces précédentes, à côté des asques dérivant de conjugaison iso- ou hétérogamiques, il en existe d’autres se formant uniquement par parthénogénèse.

En étudiant les genres Torulaspora et Schwaniomyces, Guii- LIERMOND a décrit des espèces chez lesquelles la parthénogénèse était totale. Les cellules se transforment directement en asques, après avoir formé des petits tubes au moyen desquels elles cherchent à copuler sans y parvenir.

Le mode de sexualité des Levures à sporulation directe est moins apparent que le précédent, car il ne se produit qu'au moment de la germination des ascospores. Son étude exige un ensemencement des asques sur un milieu nutritif, en chambre de Van Tieghem et Le Monnier. Jusqu'à une époque assez récente, il resta ignoré de la plupart des mycologues. En 1903, sur le Saccharomyces Johannisbergensis II, GuizriERMoND [29, e, f] découvrit des conjugaisons se produisant entre ascospores deux à deux. Il montra d’autre part que ces copulations étaient accompagnées de carÿyogamie et présentaient, par conséquent, la valeur d’un véritable acte sexuel. Mais, à cette époque, on ne connaissait pas de phénomènes analogues chez les autres Ascomycètes inférieurs et les résultats de GUILLIERMOND, en apparence aberrants, furent d’abord critiqués par DANGEARD [16] puis Kniep [38]. Par la suite, en étudiant des espèces de Levures très variées, MARCHAND [49], NÉGRONI [59], CapiraiN [8] et RENAUD [57, a] retrouvèrent, fréquemment, ce mode de sexualité et confirmèrent les premières observations de GUILLIERMOND.

Dans le cas du Saccharomycodes Ludwigii, les copulations se font toujours entre les ascospores deux à deux. Mais dans toutes les autres races, à côté des ascospores se conjuguant normalement, deux à deux, beaucoup d’autres bourgeonnent isolément en donnant naissance à de petites cellules qui, pendant longtemps, ne retinrent pas l'attention. On expliquait simplement par la parthénogénèse les cas de bourgeonnement isolés. Cette interprétation était fausse. KRuIS et SATAWA [40, a] puis WiNGE [85] et GuILLIERMOND [29, n] ont suivi plus attentivement le devenir des petites cellules issues des germinations directes d’ascospores. Ils ont constaté qu’elles se fusionnaient bientôt, deux à deux, pour produire des zygospores identiques à celles que forment les ascospores en copulant. Les observations de ces auteurs ont un caractère général. A l'exception du Saccharomycodes Ludwigit qui se comporte comme une espèce complètement diplobiontique, toutes les autres espèces à sporula-

tion directe présentent fréquemment une haplophase de quelques cellules allant de la germination de l’ascospore jusqu’à la formation de la zygospore. Chez Hansenula Saturnus, étudié par Mile MANUEL [48, a], l'haplophase est encore plus importante. Par leur sexualité, les Levures des genres Saccharomycodes, Saccharomyces, Hansenula, se distinguent donc des Ascomycètes inférieurs. Par contre, comme l’a fait remarquer GUILLIERMOND, elles ont un cyele de développement qui les apparente aux Exoaseées du type Taphrina epiphylla, étudiées par Mille WiEeBEN [84]. Ces Champignons forment à la surface des feuilles parasitées des asques comparables à ceux des Saccharomyces. Les phénomènes sexuels sont analogues dans les deux cas. La seule différence notable apparaît dans la comparaison des diplophases. Alors que chez les Exoascées la zygospore donne naissance à un mycelium dicaryotique, les cellules dicaryotiques n'ont pas encore été caractérisées nettement dans les espèces de Saccharomyces actuellement connues.

Étude des phénomènes sexuels. Races hybrides.

En chambre de Van Tieghem et Le Monnier, en utilisant le moût de bière comme milieu de culture, nous avons étudié la sexualité de toutes les races isolées des différents vins du Val de Loire. Les observations étaient facilitées par une germination rapide des ascospores et par une multiplication cellulaire active. Nous n’avons jamais constaté de phénomènes sexuels se produisant immédiatement avant la sporulation. Toutes les races sporulent, directement, par transformation des cellules végétatives en asques, lorsque le milieu s’appauvrit ou qu’elles sont placées dans des conditions d'inanition. Aucune d'elles n'appartient donc aux genres Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Zygopichia, Debaryomyces ou Nadsonia. Dans toutes les races à l'exception de deux — une étant asporogène et l’autre parthénogénétique — les ascospores, en germant, se conjuguent deux à deux ou bourgeonnent isolément, en äonnant naissance à de petites cellules haploïdes, qui se fusionnent, bientôt, en formant des zygospores identiques à celles que produisent les ascospores en copulant. Les conjugaisons, dans toutes les races, peuvent également se produire entre une ascospore et un des

bourgeons auxquels elle a donné naissance. Toutes les races sont donc homothalliques. Les zygospores bourgeonnent aussitôt et les nombreuses générations de bourgeons diploïdes apparus se transforment, à nouveau, directement en asques, lorsque l’aliment est épuisé. Nos résultats confirment donc complètement ceux de KruIS et SATAWA, WINGE et GUILLIERMOND. Ils montrent la grande généralité de ce mode de sexualité qui mérite d’être considéré comme un des caractères fondamentaux du genre Saccharomyces (Voir fig. 23).

WIiNGE et LAUSTEN [86, c], sur divers Saccharomyces isolés de la fermentation panaire, ont montré que les conjugaisons entre ascospores peuvent aussi se produire lorsque celles-ci proviennent de races différentes. Dans ce cas, la copulation donne une hétérozygote qui bourgeonne normalement en produisant une nouvelle race hybride. Mile MANUEL (1) a isolé, à l’aide du micromanipulateur de DE FONTBRUNE, deux ascospores de races de Saccharomyces différentes. La première ascospore provenait du Saccharomyces Muscadet nantais n° 4, la seconde du Saccharomyces Pouilly-Fumé No 5. Placées, côte à côte, en chambre à huile, dans une goutte de moût liquide, elles se sont fusionnées rapidement, en donnant naissance à une hétérozygospore bourgeonnant normalement. Les importantes découvertes de WINGE et LAUSTEN s'appliquent donc, également aux Saccharomyces isolés du vin. Elles montrent que, dans la nature, lorsque dans un mélange de races de Saccharomyces des ascospores germent côte à côte, de nouvelles races apparaissent par hybridation. Les phénomènes sexuels jouent donc un rôle considérable dans l’évolution des espèces de Saccharomyces qui composent la microflore des Levures du vin.

La Parthénogénèse. — L'existence de conjugaisons s’effectuant, indifféremment, soit entre les ascospores deux à deux, soit entre les premières cellules-filles issues du bourgeonnement direct, nous a amené à préciser, à nouveau, le rôle de la parthénogénèse, auquel on avait tout d’abord attribué une beaucoup trop grande importance. En effet, une question se posait : dans les races de Saccharomyces où se produit normalement le mode de sexualité précédent,

(1) Observation inédite.

ne peut-il pas exister des ascospores germant isolément et donnant naissance à des cellules qui se multiplient jusqu’à la formation des asques, sans Conjugaisons, par parthénogénèse ?

La race de S. Vouvray 1936 No 2 était particulièrement favorable à l'étude de ce problème. Ce Saccharomyces sporule abondamment sur milieu de Gorodkowa ou sur bloc de plâtre. Quelques

Fig. 23. — 1, 2, 3, 4 et 5. Diverses étapes des phénomènes sexuels observés sur un asque à trois ascospores. 1 : asque à trois ascospores ; 2: deux ascospores se sont fusionnées, la troisième a formé un bourgeon; 3 : la troisième ascospore a formé deux nouveaux bourgeons ; 4 : deux des bourgeons issus de la troisième ascospore se sont fusionnés ; 5 : le troisième bourgeon s’est fusionné avec l’ascospore. E:

jours après l’ensemencement, 90% des cellules végétatives sont sporulées. Les asques renferment de une à quatre ascospores, ceux à deux étant les plus nombreux. Sur goutte pendante de moût gélosé, en chambre de Van Tieghem et Le Monnier, les asques se gonflent et présentent une déhiscence précoce et les ascospores s’écartent presque toujours l’une de l’autre au lieu de rester étroitement accolées, comme dans la plupart des autres espèces. La ger-

Thèse Renaud. 9

mination se traduit par un bourgeonnement direct de l’ascospore au moins 99 fois sur 100. Jamais, dans les cultures sur chambre humide, nous n’avons rencontré les phénomènes sexuels habituels. Afin de multiplier les observations, nous avons fait des ensemencements sur divers milieux, en tubes à essai, en partant de vieilles cultures abondamment sporulées et nous avons suivi le début de la germination sur de nombreux prélèvements examinés entre lame et lamelle. Par cette méthode, nous n'avons trouvé que deux Zygospores. ,

Toutefois, on pouvait supposer que la conjugaison survenait plus tardivement et, comme il est pratiquement impossible de suivre d’une manière rigoureuse, toute une colonie en chambre humide, depuis l’ascospore mère jusqu’à l’apparition de nouveaux asques, nous avons utilisé une autre méthode, due à GUILLIERMOND, et qui permet d'obtenir expérimentalement, côte à côte, les deux stades extrêmes, du cycle de développement. La culture sporulée est placée d’abord sur moût de bière liquide pendant 12 heures, puis ensuite transportée sur plâtre avec toutes les précautions aseptiques nécessaires. Le séjour de la Levure sur moût provoque le gonîflement des asques et le début du bourgeonnement, puis son transport sur plâtre, dans des conditions d’inanition, déclenche une sporulation immédiate (Voir fig. 24). Il se produit un raccourcissement du cycle évolutif dont les deux stades extrêmes apparaissent placés côte à côte. Les ascospores gonflées et les premières cellules résultant du bourgeonnement se transforment aussitôt en asques. Or, l’étude de ce développement raccourci nous a permis de constater que tout le cycle de la Levure s’accomplit sans sexualité : il y a donc parthénogénèse.

D'autre part, cette race de Saccharomyces, après sporulation sur gélose de Gorodkowa, montra un dimorphisme très accentué dans la grosseur des ascospores. Nous avons déjà signalé ce phénomène au chapitre de la sporulation. Les unes, de petite taille mesurent environ 2,5 u, les autres plus grosses, mesurent environ 4,5 u. Nous avons procédé à des mensurations d’ascospores obtenues par raccourcissement du cycle de développement dans les conditions précédentes. En général l’asque ne renferme qu'une ou deux ascospores et elles sont petites. Néanmoins la règle n’est pas absolue et l’on en rencontre qui mesurent 4,5 u. La parthénogénèse paraît

être responsable du dimorphisme constaté dans la grosseur des ascospores.

Deux autres Saccharomyces isolés, l'un du vin de Mont, l’autre du Muscadet nantais, nous ont fournis des exemples de parthénogénèse aussi nets. Dans le premier, quelques conjugaisons se forment encore, soit entre les ascospores deux à deux soit entre les premières

Fig. 24. — Phénomènes de Parthénogénèse chez le S. ellipsoideus Vouvray 1936 No 2.

A. 1 à 5 : déhiscence de divers asques au début de la germination.

B. Germination parthénogénétique d’ascospores, sur goutte pendante de moût gélosé en chambre de Van Tieghem et Le Monnier.

C. 1 à 5 : sporulation de cellules parthénogénétiques ; des ascospores se sont gonflées et ont émis des bourgeons pendant un séjour de 12 heures sur moût de bière. L'ensemble est porté sur plâtre: ascospores et bourgeons se transforment en asques.

cellules provenant du bourgeonnement direct, mais dans le second, déjà signalé au début de ce chapitre, la sexualité semble avoir complètement disparu.

Dans le genre Saccharomyces, il existe donc des races où la parthénogénèse prédomine de beaucoup et d’autres où elle est complètement installée (1).

(4) GUILLIERMOND a signalé, en 1904, un cas de parthénogénèse totale sur une souche de Saccharomycodes Ludwigii.

A la suite de nos recherches sur la parthénogénèse, nous écrivions en 1937 [67, d) : « Il est possible que l’on trouve un jour d’autres races, chez lesquelles il reste encore des vestiges de la sexualité disparue, se traduisant par des essais infructueux d'union entre les ascospores ou entre les cellules haploïdes issues du bourgeonnement direct, comme il en existe dans certaines espèces de Zygosaccharomyces devenues parthénogénétiques. Mais jusqu'ici, nous n’avons jamais rencontré de telles formes ».. Quelques mois plus tard, en étudiant des Levures isolées de divers levains chinois, FANG SiN-FANG [24] a décrit un cas très net de régression sexuelle se traduisant par des essais infructueux de copulation entre ascospores en voie de germination.

Anomalie de la sexualité due à un état dicaryotique de la zygcspore. — La race de S. Pouilly-ordinaire n° 5, par certaines anomalies de sa sexualité, présente un intérêt spécial.

Les ascospores ensemencées en chambre humide de Van Tieghem et Le Monnier peuvent se fusionner, deux à deux, et former ainsi des zygospores qui bourgeonnent en produisant des cellules diploïdes, mais le plus souvent elles germent isolément : de petites cellules haploïdes apparaissent. Ce sont celles-ci qui se conjuguent en formant des Zzygospores aux dépens desquelles naissent des cellules diploïdes. Les cellules haploïdes issues des ascospores germant isolément ne sont pas toujours en nombre pair. Lorsque les conjugaisons se produisent, il en reste qui ne peuvent se fusionner faute de partenaire et vont continuer leur bourgeonnement haploïde. Supposons pour fixer les idées qu’une ascospore ait donné naissance à trois cellules haploïdes a, b, c et que la conjugaison s'opère entre a et b ; il reste une cellule haploïde c. Souvent cette dernière produit deux bourgeons d et e, avant que ne survienne une nouvelle copulation. Si celle-ci se fait entre d et c, il reste encore une cellule e qui pourra se comporter comme précédemment la cellule c et continuer le phénomène. Parfois, il arrive que le milieu de culture soit épuisé avant que les zygospores aient cessé de se former. Dans ces conditions, l’état de la culture est le suivant : les premières ZYSOSPOres apparues ont produit des cellules diploïdes qui sporulent ; les dernières zygospores n’ont pas encore bourgeonné, mais si la fusion nucléaire s’est réalisée, elles se transforment en asques, exactement

comme les cellules diploïdes précédentes ; enfin il reste dans la Culture quelques cellules haploïdes telles que la cellule e qui, après repiquage sur un milieu jeune, vont se fusionner.

Le développement de cette Levure, assez délicat à suivre, n'offre, cependant, jusqu'ici, rien d’anormal et ressemble un peu à celui du S. paradoxus que GUILLIERMOND [29, n] a décrit récemment.

Fig. 25. — Développement d’une zygospore ensemencée en goutte pendante. 1. Une petite cellule haploïde est en voie de formation; 2 et 3, de nouvelles cellules haploïdes se forment, tandis que, sur le côté opposé, apparaissent de grosses cellules diploïdes (figurées en hachures) ; 4 et 5, des cellules haploïdes se conjuguent et les cellules diploïdes croissent rapidement ; a à g zygospores en voie de formation, fixées au picroformol et colorées à l’hématoxyline ferrique, montrant un dicaryon.

Mais si, en chambre humide, on suit la germination d’un grand nombre de zygospores, on constate des anomalies très rares mais très curieuses. Certaines zygospores bourgeonnent aussitôt et forment d’abord de petites cellules haploïdes et se comportant comme telles, puis apparaissent d’autres cellules plus grosses qui sont diploïdes (Voir fig. 25).

Les premières se conjuguent entre elles, produisent de nouvelles zygospores qui bourgeonnent en donnant des cellules diploïdes

tandis que les secondes continuent leur bourgeonnement diploïde qui se terminera par la formation d’asques. Le phénomène est très rare et ne peut être observé que si l’on suit la germination d’un grand nombre de zygospores.

L'étude cytologique de la formation des zygospores va nous donner l'explication de ce résultat, en apparence paradoxal. Dans certaines races de Saccharomyces, comme le S. Johannisbergensis II et le S. paradoxus, la formation des zygospores n’est pas toujours accompagnée de caryogamie. Parfois celle-ci ne se produit que plus tardivement, précédant ainsi, immédiatement, la division nucléaire. Ces faits ont été mis en évidence par GUILLIERMOND [29, À], dès 1911. Il arrive ainsi que les deux noyaux de la zygospore restent à l’état de dicaryon et se divisent simultanément pour envoyer deux noyaux-fils dans le bourgeon : c’est alors dans ce dernier qu'ils se fusionnent. Il y a une ébauche de dicaryon, comme il s’en produit chez les Ascomycètes supérieurs. Or, l'examen des zygospores de la Levure S. Pouilly-ordinaire N° 5, après fixation au picroformol et coloration à l’hématoxyline ferrique, nous a permis de retrouver, sur quelques-unes d’entre elles, cette tendance à la formation d’un dicaryon. Dès lors, on doit admettre que les zygospores dicaryotiques transportées sur un milieu frais, à un moment où leurs deux noyaux haploïdes ne sont pas encore fusionnés, peuvent donner naissance d’abord, par suite des conditions nouvelles du milieu, à de petites cellules haploïdes qui proviennent de la division de ces noyaux et sont capables de se conjuguer. La caryogamie se produit ensuite dans la première zygospore et les cellules diploïdes apparaissent. L'étude cytologique, montre en effet des zygospores où les noyaux ne sont pas encore fusionnés et se divisent isolément en se dirigeant vers les cellules-filles en voie de formation. Cette dissociation du dicaryon de certaines zygospores dicaryotiques placées dans des conditions particulières apparente la race de S. Pouilly-ordinaire N°0 5 aux Exoascées du type Taphrina epiphylla.

Mise en évidence d'un vérilable dicaryon dans un Saccharomyces isolé du vin. — L'étude cytologique des zygospores de divers Saccharomyces isolés du vin nous a permis de mettre en évidence la présence d’une phase dicaryotique, au début de la diplophase, dans la race de S. Quincy N° 6.

Cette race, par ses caractères morphologiques et sexuels montre, une étroite parenté avec la race de S. ellipsoideus d'HANSEN, Toutefois la multiplication cellulaire est un peu particulière. En général, au cours du bourgeonnement, les cellules-filles restent accolées aux cellules initiales suivant le mode de bourgeonnement habituel, mais parfois elles s’en écartent en restant en liaison par un isthme étroit et assez long, surtout visible sur les préparations cytologiques. La sporulation est abondante sur milieu de Gorodkowa à la température de 250. Les asques renferment des ascospores rondes au nombre de 1, 2, 3, 4 par asque et leur taille, en général, est de 3,9 u. Les ascospores germent très vite sur moût gélosé et, en chambre de Van Tieghem et Le Monnier, montrent les phénomènes sexuels habituels.

Mais l'intérêt remarquable de ce S. ellipsoideus réside surtout dans les phénomènes cytologiques qui accompagnent cette sexualité. Après fixation au picroformol et coloration à l’hématoxyline ferrique, on constate que, pour un grand nombre de zygospores, la caryogamie ne se réalise pas immédiatement après la fusion cellulaire. Les deux noyaux s’assemblent pour former un dicaryon puis se divisent, simultanément, en direction du premier bourgeon en voie de croissance par une sorte de mitose conjuguée, dont nous étudierons un peu plus loin les détails. (Voir fig. 26).

Lorsque le dicaryon du premier bourgeon est formé, le plus souvent, les deux noyaux se fusionnent. Mais, parfois, la caryogamie n’a pas lieu et le dicaryon paraît nettement individualisé. On trouvera, à la fin de notre travail, deux remarquables photographies qui illustrent ces résultats. (Voir PI. VII, photos 1 et 2).

Dans d’autres cas, le dicaryon peut s'étendre à la deuxième cellule ainsi qu’à la troisième et, assez souvent, dansles préparations cytologiques, nous avons observé des chaînes de deux ou trois cellules binuclées. Il est plus rare d'observer, à la fois, sur une même chaîne, les cellules dicaryotiques et la zygospore qui leur a donné naissance car, au moment de l’étalement sur lame, la fragmentation de la culture est presque inévitable. Nous avons, néanmoins, réussi à obtenir une zygospore réunie à une chaîne de deux cellules-filles dicaryotiques. La tendance à la formation d’un dicaryon, caractérisée par la présence de zygospores dicaryotiques, semble assez fréquente chez les Levures du genre Saccharomyces. Nous l'avons

rencontrée dans la Levure de S. Pouilly-ordinaire N° 5, elle avait déjà été signalée par GUILLIERMOND sur la Levure de Johannisbéerg II et sur le S. paradoxus. Toutefois, la présence d’un dicaryon nettement installé dans les cellules de la diplophase n'avait jamais été décrite et nos résultats prennent un intérêt particulier, lorsqu’on les rapproche de ceux obtenus, par Mile WieBEN [84], sur les Exoascées du type Taphrina epiphylla. Nous avons vu que le

Fig. 26. — A. Zyÿgospore dicaryotique — Division du dicaryon vers la première cellule-fille en formation. B. Zygospore dicaryotique et dicaryon nettement individualisé sur les deux cellules-filles.

C. Zygospore dicaryotique réunie à une chaîne de deux cellules-filles à dicaryon.

cycle de développement des Levures du genre Saccharomyces présentait de grandes analogies avec celui de ces champignons. Toutefois, les zygospores de Taphrina epiphylla donnent toujours naissance à un mycélium dicaryotique, tandis que pour les Saccharomyces actuellement connus, la phase dicaryotique est toujours réduite à la zygospore. La seule différence vraiment notable apparaît done dans la confrontation des diplophases. Mais cette différence s’atténue beaucoup avec la race de S. Quincy N° 6. La présence de zygospores produisant des générations de cellules dicaryotiques au début de la diplophase, rend les cycles de développement tout à fait homologuables et l'hypothèse de GUILLIERMOND, relative au rapprochement des Levures du genre Saccharomyces et des Exoascées reçoit, par ces résultats, une confirmation complète.

A la suite de nos recherches sur la sexualité, nous voyons que :

a) Les races de Levures qui composent la microflore du vin forment un groupe extrêmement homogène au point de vue de la sexualité. A l'exception de quelques-unes, chez lesquelles nous avons montré que la parthénogénèse était totalement installée, toutes les autres présentent les mêmes phénomènes sexuels. Les ascospores en germant se conjuguent deux à deux ou bourgeonnent isolément, en produisant de petites cellules qui se fusionnent, bientôt, deux à deux. Les zygospores provenant de cette union sont identiques à celles que forment les ascospores en copulant.

Ce mode de sexualité en raison de sa généralité mérite d’être considéré comme un des caractères fondamentaux des Levures du vin.

b) Toutes les Levures de vin sont homothalliques.

c) Les ascospores de races différentes peuvent également se conjuguer deux à deux, exactement comme si elles dérivaient d’un même asque et appartenaient par conséquent à une même race. De cette union, une race hybride apparaît. Grâce au micromanipulateur, de nouvelles races peuvent donc être créées, expérimentalement, sous le microscope.

d) La présence de zygospores dicaryotiques montre une tendance à la formation du dicaryon chez certaines races de Saccharomyces.

Dans la race de S. Quiney N° 6, nous avons rencontré un véritable dicaryor, nettement installé dans les premières cellules de la diplophase et ce résultat apporte une confirmation à l’hypothèse de GUILLIERMOND sur le rapprochement des Levures du genre Saccharomyces et des Exoascées du type Taphrina epiphylla.

La division du noyau chez les Levures au cours du bourgeonnement. Mise en évidence d’un centrosome et de la mitose.

On sait que le noyau des Levures a été mis en évidence par GUILLIERMOND [29, a] en 1901. Cet auteur a montré que sa structure était analogue à celle des noyaux ordinaires rencontrés chez les autres Champignons et, notamment, les Ascomycètes supé-

rieurs. Depuis cette époque, de nombreux cytologistes ont cherché à préciser son mode de division pendant le bourgeonnement ; presque tous ont admis que cette division s'effectue par un processus d’amitose et si l’idée d’une mitose a été soutenue par quelques auteurs, comme SWELLENGREBEL [82] 1905, FUHRMANN [26] 1906, Mac Kärer [46] 1927, aucun d’eux n’a apporté de preuves acceptables en faveur de cette opinion. GUILLIERMOND à admis que, lors de la sporulation, le noyau se divise toujours par une mitose et, dès 1914, dans l’asque du Schizosaccharomyces octosporus, il a décrit une mitose comparable à celle des Ascomycètes supérieurs et qu’il a retrouvée, plus tard, dans l’asque d’une autre Levure : Nematospora Corylit (1). Le problème de la division nucléaire au cours du bourgeonnement a été récemment remis à l’ordre du jour par GUILLIERMOND [29, n], d'une part, en 1936 et BaADIAN [2], d’autre part, en 1937. En étudiant le bourgeonnement du S. paradoxus, le premier a observé des figures qui l’amènent à admettre que cette division s’effectuerait par une mitose comparable à celle des Ustilaginales. BADIAN, par contre, a décrit des phénomènes très différents. Pour cet auteur, le noyau des Levures aurait une structure très primitive, il serait dépourvu de membrane et constitué seulement par deux chromosomes qui se diviseraient longitudinalement pendant la mitose.

Notre étude a porté sur plusieurs races de Saccharomyces isolés du vin et plus particulièrement sur la race de S. Quincy N° 6, car, sur elle, nous suivions en même temps les phénomènes cytologiques de la sexualité décrits plus haut. Nous avons essayé la plupart des fixateurs usuels, mais, sur ce matériel, c’est la fixation au picroformol avec coloration à l’hématoxyline ferrique qui nous a donné les meilleurs résultats. La réaction nucléale de FEULGEN, qui a permis des recherches si intéressantes sur le noyau des autres végétaux et particulièrement les végétaux supérieurs, ne semble pas convenir pour l'étude de la mitose sur un matériel aussi petit que les Levures. En tout cas, elle donne des figures beaucoup moins claires que celles que nous avons obtenues par la méthode précédente. Nos fixations ont été faites sur des cellules jeunes ayant un cytoplasme dense et de petites vacuoles. Cette précaution,

(1) Ces résultats ont été retrouvés, récemment, par Mile MANUEL (48, c).

comme l'a fait remarquer GUILLIERMOND [29, d] est nécessaire pour avoir de bons résultats dans la cytologie des Levures.

Les noyaux au repos sont assez rares dans les cultures jeunes bourgeonnant activement. Mais, néanmoins, pour obtenir le maximum de divisions au moment de la fixation, nous procédions de la manière suivante. La culture était d’abord rajeunie par séjour de 18 heures sur moût liquide à la température du laboratoire (16 à 180) puis, placée à l'étude à 250, pendant une demi-heure.

Les noyaux au repos montrent une structure identique à celle qui a déjà été décrite par GUILLIERMOND. De forme sphérique, ils sont limités extérieurement par une membrane colorable et renferment un nucléoplasme achromatique dans lequel se distinguent un nucléole et de la chromatine disposée en un fin réseau, montrant, par places, de petits granules chromatiques. Parfois, cette chromatine est surtout disposée au voisinage de la membrane nucléaire. Au début du bourgeonnement, dans la zone nucléaire située en face du bourgeon, on distingue un centrosome extrêmement net, qui apparaît sous forme d’un petit grain coloré et entouré d’une plage claire (fig. 27,2). Le réseau chromatique est localisé en arrière du centrosome, le plus souvent au voisinage du nucléole plus ou moins confondu avec les mailles du réseau. Dans certains cas cependant, le nucléole et le réseau chromatique sont localisés dans des régions nucléaires nettement distinctes (fig. 27,3). À un stade plus avancé, le noyau prend une forme plus elliptique, il fait hernie dans la direction du bourgeon et le centrosome se divise. L'un des deux centrosomes résultant de cette division reste dans la cellule où il devient difficile à reconnaître, tandis que le second émigre vers le bourgeon à la base duquel il apparaît, toujours sous forme d’un grain coloré, entouré d’une auréole claire. Parfois, il est possible d’apercevoir un filament qui le relie au noyau en traversant l’isthme de communication de la cellule et de son bourgeon (fig. 27,3). Un peu plus tard, les chromosomes se forment aux dépens du réseau chromatique et se répartissent au voisinage de la membrane (fig. 27,4). Assez fréquemment, et particulièrement dans les préparations insuffisamment différenciées, ils paraissent agglomérés sur un côté de noyau en présentant l’aspect d’un bloc confus, en forme de croissant. À ces différents stades, que nous considérons comme se rattachant à la prophase, en succède un autre qui correspond à la

métaphase : la membrane nucléaire se résorbe et le fuseau achromatique apparaît (fig. 27, 5 et 6). Parfois le fuseau a une pointe plus accusée dans le sens du bourgeon et, de ce fait, il affecte une forme conique, qui semble traduire une sorte d’attraction se manifestant, en direction du bourgeon, dès que la membrane nucléaire a disparu. Ensuite, les chromosomes, souvent agglomérés en masse au milieu du fuseau, se divisent et forment quatre agrégats, groupés par deux de part et d’autre du plan équatorial (fig. 27, 7 et 9). Dans les cellules allongées en forme de saucisse, on remarque des figures d’anaphase très étalées (fig. 27, 10), analogues à celles que MAIRE [47] a décrites chez les Basidiomycètes. Dans ce cas, les chromosomes sont mieux individualisés et leur nombre apparaît nettement supérieur à 4.

Par suite du bourgeonnement, les figures de mitoses que nous décrivons sont sensiblement différentes de celles rencontrées par GUILLIERMOND, dans l’asque du Schizosaccharomyces octosporus. Beaucoup de figures d’anaphases sont, notamment, déformées par le passage des groupes de chromosomes à travers l’isthme étroit qui fait communiquer le bourgeon avec la cellule initiale. Les figures 27-11, 27-12, 27-13 représentent des télophases dans lesquelles l’un des centrosomes est encore très apparent. Enfin la figure 27-14, montre les deux noyaux résultant de la division venant de se reconstituer. Dans beaucoup de cas, le nucléole disparaît dès la métaphase, mais parfois, on le retrouve accolé au fuseau, à un stade plus avancé de la mitose (fig. 27, 13). Les figures de cette mitose étant très petites et les chromosomes se trouvant souvent réunis en agrégats confus il semble impossible de songer à compter leur nombre avec certitude. Toutefois, dans la race de Saccharomyces en question, celui-ci est au moins égal à 8 (fig. 27,4).

Nos recherches ne nous permettent donc pas de confirmer celles de BaprAN. Elles prouvent que la structure du noyau des Levures est identique à celle des noyaux des Ascomycètes supérieurs. Elles nous amènent bien à constater que ce noyau se divise par une mitose. Mais les phénomènes observés n'ont rien de comparable à ceux décrits par BADIAN. Au contraire, ils prouvent que les conclusions de cet auteur sont erronnées. La mitose que nous avons décrite ressemble assez aux mitoses des autres Ascomycètes, ainsi qu’à celles observées par VEN [89] chez les Ustilaginales.

Diverses phases de la mitose au cours du bourgeonnement des Levures.

Fig. 27. — 1. Structure du noyau au repos. On remarque, nettement visibles, la membrane externe et le nucléole.

2. Début de la prophase. Un centrosome apparaît dans l’aire claire en face le bourgeon. En arrière, on remarque le réseau chromatique et le nucléole entre les mailles du réseau

3. Stade plus avancé de la prophase. Le centrosome s’est divisé, l’un es deux résultant de cette division est passé dans le bourgeon, il est relié du noyau par un filament, l’autre apparaît en haut sur le côté gauche. Nucléole et réseau chromatique sont situés dans des territoires différents.

4. Fin de la prophase. Le noyau est devenu elliptique, Les chromosomes sont individualisés, le nucléole est encore visible au milieu.

5. 6. 7. Métaphases. Les chromosomes sont restés en agrégats confus de chaque côté du fuseau sur le plan équatorial. Les centrosomes sont très nets, dans la figure 7 le fuseau a une forme cônique, à la base on remarque le nucléole qui a persisté.

8. 9. Anaphases. Les chromosomes se sont divisés, mais sont restés en agrégats et constituent 4 masses (2 de chaque côté du plan équatorial). La figure 8 représente une anaphase dans une zygospore.

10. Fin d’anaphases. Dans une cellule allongée en forme de saucisse. Les chromosomes sont mieux individualisés que dans les figures précédentes ; remarquer le centrosome en direction du bourgeon.

11. 12. 13. Télophases. Sur la figure 13 remarquer le nucléole qui a persisté le long du fuseau achromatique.

14. Les deux noyaux, provenant de la division, sont maintenant formés.

Enfin, au cours de cette étude, nous avons nettement mis en évidence l'existence d’un centrosome.

Remarques sur les caractères biochimiques des Levures du vin.

La fermentation des principaux sucres. — L'étude des caractères biochimiques, comme celle des phénomènes sexuels, met en évidence les analogies étroites existant entre toutes les races de Levure isolées du vin.

Toutes, sans distinction, font fermenter activement le glucose, le fructose et le mannose. Toutes également font fermenter le saccharose après un temps de latence d'environ 24 heures. Seule la race de S. Pouilly-ordinaire N° 1 attaque c2 dernier sucre avec plus de difficultés. Dans ce cas particulier, la fermentation ne se déclare qu’au bout de 40 heures en chambre de Van Tieghem, et au bout de 4 jours en tube de STRUYCK. STEINER [79] a isolé des vins suisses et décrit sous le nom de S. Rouxii une race de Saccharomyces qu'il considérait comme dépourvue d’invertase. Mais Mme STELLING- DEKKER [80] a repris l’étude de cette Levure et obtenu des résultats différents : la fermentation du saccharose serait faible mais nette. Le S. Rouxit se comporte sensiblement comme le S. Pouillyordinaire N° 1. Toutes les Levures du vin renferment donc de l’mvertase. Elles font également toutes fermenter le maltose. A la température de 18°, en chambre de Van Tieghem, le temps de latence est d’une vingtaine d'heures pour les plus actives. La fermentation débute tardivement avec les S. type pastorianus N°S1 et2 isolés du vin de Sauvignon. Les premières bulles de gazicarbonique n'apparaissent qu’au bout de 36 heures pour le premièr et au bout de 40 pour le second.

La fermentation du raffinose se produit également dans tous les cas, mais elle est toujours faible et limitée. Elle se décèle beaucoup plus facilement par la méthode de la chambre de Van Tieghem que par celle du tube de Struyck. Seules, les races $S.Bourgueil N° 2 et Sauvignon N° 1 attaquent ce sucre avec plus de difficultés. À la température du laboratoire, le temps de latence était de 30 heures pour la première et de 40 heures pour la seconde. Aucune race ne fait fermenter le lactose. La fermentation du galactose est toujours

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