MILIEUX DE CULTURE

sérum, de leur isolement sur plaques. Il nous faut donc exposer brièvement ce que c'est qu'une culture.

Un milieu de culture peut être liquide ou solide; il doit renfermer les principes nutritifs nécessaires poui* le microorganisme que l'on veut étudier ; il doit, d'autre part, être « stérile i, c'esl-à-dire privé de tout germe. Delà sorte, seul le microbe ensemencé se développe. Les milieux doivent être presque toujours neutres ou légèrement alcalins pour répondre aux besoins de la généralité des microbes.

MM. Thoinot et Masselin donnent des milieux de culture la classification suivante (1) :

1° Milieux liquides : bouillons, liquides minéraux et végétaux (peu employés) ; liquides organiques naturels (lait, urine, humeur aqueuse, sérum, liquide allantoïdien, liquide de l'hydrocèle) ;

2* Milieux solides : transparents (gélatine, gélose); semitransparents (sérum) ; opaques (pomme de terre).

Les éléments nutritifs du bouillon, de la gélatine et de la gélose sont représentés par le suc de la viande, des peptones et du chlorure de sodium. Le bouillon est le milieu de culture liquide par excellence ; c'est avec lui que M. Pasteur a fait ses plus grandes découvertes. Voici comment on le prépare :

Les viandes de bœuf, de veau et de poule sont les meilleures à en^)loyer. On mélange 500 grammes de viande hachée et débarrassée des os, de la graisse et des aponévroses, avec 1000 grammes d'eau distillée; on laisse macérer pendant vingt-quatre heures à froid. Après ce temps, on filtre sur un linge mouillé, et au bouillon ainsi obtenu on ajoute une quantité d'eau suffisante pour que le tout donne une quantité de

(1) Thoinot et Masselin, Précis de microbie, Paris, 1889, p. 34.

1000 grammes. On ajoute 5 grammes de sel marin et 40 grammes de peptone Chapoteau, on fait bouillir pendant une heure à 100 degrés, on filtre de nouveau sur un linge, on alcalinise le bouillon, on le porte à l'autoclave pendant dix minutes à 115 degrés, on le laisse reposer jusqu'au lendemain afin que la graisse se solidifie à la surface, on décante, on verse dans un ballon préalablement stérilisé et bouché à l'ouate, on reporte de nouveau à l'autoclave à + ^^5 degrés pendant un quart d'heure et le bouillon est dès lors parfait et stérile.

Pour solidifier le milieu, on ajoute 10 pour 100 de gélatine extra-fine (gélatine peptone), ou 10 grammes de gélose, qui est le produit colloïde retiré d'une algue par Payen. Les Allemands ont donné à cette algue le nom d'agar-agar.

P#ur solidifier la gélose, il vaut mieux placer les tubes dans la position inclinée, qui favorise les cultures en surface, en strie, auxquelles la gélose se prête mieux.

€ La gélose a sur la gélatine un grand avantage; on peut l'exposer à la température de l'étuve (37 à 41 degrés) sans qu'elle se liquéfie, comme le ferait la gélatine, qui fond audessus de-f- 18 degrés. Le seul reproche qu'on puisse lui faire, c'est qu'elle est toujours légèrement louche; cependant un peu d'habitude et d'adresse fait obtenir un produit presque transparent.

€ On peut ajouter à la gélatine et à la gélose de la glycérine, du glycose, de la leucine, de la dextrine, comme le font MM. Nocard et Roux pour cultiver la tuberculose » (Thoinot et Masselin, p. 46).

L'ensemencement d'un microbe se fait dans un ballon ou dans un tube à essai, contenant du bouillon, de la gélatine ou de l'agar.

Pour faire le triage des germes, on emploie la méthode des

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cultures sur plaques, qui rend de grands services et dont nous aurons souvent occasion de parler au cours de nos descriptions.

On commence par liquéfier trois tubes de gélatine en les exposant à une température variant entre 30 et 35 degrés. On ensemence le premier avec la substance à examiner et on

FiG. 5. — Appareil destiné à solidifier la gélatine sur les plaques de verre.

t, trépied dont les pieds sont pourvus de vis; a, plaque de verre avec uu niveau d*eau, n; c, cloche; p, plaque de verre sur laquelle on a versé la gélatine (Cornil et Babes).

agite le tube de façon que les germes se mélangent à toute la masse de la gélatine. On ensemence le deuxième tube de la même façon en recueillant trois gouttelettes du premier ainsi préparé avec une aiguille à boucle. On ensemence enfin le

troisième avec six gouttelettes puisées dans le second avec Taiguille à boucle. On étale la gélatine de chacun de ces tubes sur une plaque de verre préalablement stérilisée; on dispose les plaques de gélatine sur une planchette à niveau pour que la solidification s'effectue suivant une surface unie; si Ton opère en été, la planchette est placée au-dessus d'un réfrigérateur, pour faciliter la solidification de la gélatine. Les trois plaques de gélatine ainsi confectionnées sont mises dans une chambre humide deKoch où on les laisse jusqu'au développement des germes. Grâce à cette niéihode dite des dilutionsy si la matière inoculée est riche en microbes, on évite la formation sur la plaque de colonies trop nombreuses et trop rapprochées.

L'aspect des cultures varie pour un même microbe suivant les milieux ensemencés ; donc autant de milieux de culture divers, autant de caractères différents pour un même microbe.

Les cultures sur milieux solides facilitent enfin l'isolement des germes. Si, après avoir ramolli à une douce température un tube de gélatine, on l'ensemence et on l'étalé ensuite sur une plaque de verre, la gélatine ainsi étalée se solidifie; chaque germe inoculé se développe isolément pour son compte, en donnant une colonie particulière qui ne se confond pas avec les voisines. En semant une de ces colonies sur un milieu quelconque, on est sûr d'obtenir une culture pure du microbe qu'elle représente.

Les milieux doivent être absolument stérilisés, avons-nous dit, et pour cela toute la verrerie qui servira de contenu est au préalable bouchée à l'ouate et portée à 170 degrés pendant une heure dans le four à flamber. Lorsque ces vases ont été remplis par les liquides nutritifs, ils sont exposés à l'autoclave sous pression à la vapeur humide, dont la température varie entre 100 et 131 degrés. On prive ainsi de tout germe le

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contenu et le contenant. Le milieu peut être ainsi maintenu indéfiniment stérile, grâce au tampon d*ouale qui ferme le vase. On sait en effet que Touate laisse filtrer Tair, mais ne donne pas passage aux microbes de Tatmosphère.

Les milieux organiques naturels, tels que le lait, Turine, rhumeur aqueuse, le purin, le liquide allantoldien , le liquide de Thydrocèle et de Tascite, peuvent servir aussi de milieu de culture.

Le laity avant de servir de milieu de culture, doit ôtre parfaitement stérilisé. Pour cela, on peut employer deux procédés différents. Le premier consiste à porter le lait pendant un quart d'heure à Tautoclave à.+ H5 degrés. On laisse reposer, et lorsque les matières grasses sont remontées à la surface du liquide , on va au fond du vase recueillir avec une pipette stérilisée toute p,g, g^ la partie liquide, en prenant bien soin de ne pas ^"^"ja^***®"*^ entraîner de particules graisseuses. Le lait est ensuite déposé dans des ballons Pasteur (fig. 6). On l'épure de la façon suivante : les ballons, placés à Tétuve à 37 degrés, sont examinés au bout de quarante-huit heures; on s'assure qu'il ne s'est pas développé de moisissures dans le liquide. On examine même une gouttelette du lait au microscope, pour s'assurer qu'il ne contient pas de micro-organismes. On peut même, pour plus de sûreté, ensemencer un tube de bouillon avec une goutte de lait et porter ce tube à Tétuve; si, au bout de vingt-quatre heures, le bouillon est resté stérile, on peut être assuré de la purelé du lait.

Le lail, porté à une haute température, est modifié dans sa composition. Aussi M. Duclaux a-t-il conseillé, pour recueillir le lait, un second procédé, qui est le suivant :

On prend des tubes à essai bouchés à Touale el préalablement stérilisés. < Pour y introduire du lait, on lave bien le pis de la vache, et, quand les premiers mouvements de mulsion ont bien nettoyé les parois du canal, on enlève doucement, avec une pince, le bouchon de coton qui ferme le tube, et Ton dirige dans l'intérieur le liquide qui s'écoule, en ayant soin de tenir ce tube tout près de la mamelle, sans pourtant la toucher. On ne peut éviter qu'une portion du lait ne coule à l'extérieur du tube ; cela est sans importance, et il vaut mieux le perdre que de chercher aie recueillir. On remet le bouchon qu'un aide a gardé à l'extrémité de la pince, et l'on reporte le tout au laboratoire.

< On doit préparer ainsi plusieurs tubes; quelques-uns s'altèrent, cela est inévitable, avec une manipulation aussi délicate, mais il y en a toujours un grand nombre qui restent inaltérés, si Ton a bien opéré (1). »

L'urine peut servir de milieu de culture. On sait que M. Pasteur a cultivé tout d'abord dans ce liquide la bactéridie charbonneuse.

L'urine recueillie est filtrée, alcalinisée, stérilisée et portée ensuite dans les ballons Pasteur.

L'humeur aqueuse est un milieu excellent pour les cullures en cellules.

On se la procure de la façon suivante : on extirpe l'œil d'un animal; on cautérise un point de la cornée avec l'extrémité d'une baguette de verre préalablement passée à la flamme; en ce point cautérisé, on introduit l'extrémité effilée et stérilisée d'une pipette Pasteur. L'humeur aqueuse monte par capillarité, et Ton peut aider son ascension en pressant sur le globe oculaire.

(1) Duclaux, Annales de rinstitut agronomique, 1882, p. 24.