LES MICROBES DES NODOSITÉS ET L'AIR ATMOSPHÉRIQUE

Nous venons de voir que le bacille des légumineuses est un microbe essentiellement aérobie. Pour nous faire une idée nelte de ses besoins d'oxygène, prenons deux ballons plats à deux tubu-

lures munis d’une couche de quelques millimètres de gélose de même composition que celle qui nous a déjà servi. Ensemençonsles etplaçons-les en dérivation surle courant d’air dépouillé d'azote combiné qui circule sur d’autres cultures, après les avoir fait précéder d’un tube en U rempli de ponce imbibée de potasse, pour absorber l’acide carbonique de cetair. Isolons maintenant l’atmosphère des deux vases à l’aide de deux pinces à vis placées sur les caoutchoucs des deux extrémités. La masse d'air ainsi confinée est munie d’un manomètre à mercure formé d’un tube en U presque capillaire, gradué.

L'appareil reste fermé pendant huit jours, à une température moyenne de 23-240, Au bout de ce temps on fait une prise d’air à l’aide d’une trompe de Schlæsing; on la mesure dans une éprouvette de Schlæsing, et on étudie sa composition.

Ces manipulations terminées, on a renouvelé l'atmosphère des cultures à l’aide de la trompe que l’on faisait fonctionner assez longtemps pour entraîner l’acide carbonique dissous. Puis on l’a isolée de nouveau et, 64 heures après, on a recommencé la même opération afin de se rendre compte de l'absorption d'oxygène dans une culture en plein développement.

Une troisième analyse a été faite 24 heures après la seconde.

Voici les résultats en volume rapportés à 100 du gaz, à la pression 760 et à 0°.

NATURE DES GAZ 1re ANALYSE 2e ANALYSE 3° ANALYSE Acide carbonique Arret 20,7 18,7 8,04 OxPLENE NES RETE EEEE 1,8 3,16 13,41 AZOTEI- M ATSON EEE EE 71,5 78,14 78,55 Acide carbonique + oxygène... 22,5 21,86 21,45

Les chiffres de ce tableau montrent combien le bacille des légumineuses est avide d'oxygène. En 24 heures, une culture d’une surface totale d'environ 27 décim. carrés absorbe le tiers du volume d'oxygène contenu dans une atmosphère confinée de 5 1., soit 330 c. c.

Considérons maintenant les chiffres de la quatrième ligne horizontale ; ils sont tous supérieurs au nombre 21 qui représente la teneur normale de l’air en oxygène; cela veut dire que le rapport de l'acide carbonique à l’oxygène est toujours supé-

rieur à 1‘. À côté d’une combustion complète qui se traduirait par la mise en liberté d’un volume d’acide carbonique égal au volume d'oxygène absorbé, il y a une dislocation plus ou moins avancée de la molécule de saccharose. Les produits intermédiaires de cette dislocation ne sont pas constitués par des acides volatils ou fixes, puisque le milieu conserve sa réaction alcaline ; ils ne peuvent être que des corps plus ou moins oxydés, quelques-uns volatils, dont la présence se révèle par l’odeur caractéristique des cultures. Les milieux liquides qui se chargent peu à peu de tous ces produits de la combustion du sucre, deviennent de plus en plus impropres à la culture du microbe, si on ne prend pas la précaution de les en débarrasser. Voilà une autre raison qui explique la supériorité des cultures peu profondes et de grande surface, au point de vue de la fixation de l’azote atmosphérique.

Ce n’est pas tout, nos chiffres comportent encore un enseiguement : on conçoit que les hydrates de carbone soient épuisés rapidement par un dégagement aussi abondant d’acide carbonique. Évaluons, en effet, la quantité de carbone mise en liberté au moment de notre dernière prise d'air, c’est-à-dire après 12 jours d'expérience. Cela est très facile, connaissant le volume de l'atmosphère confinée et la quantité de saccharose introduite dans la culture.

On trouve ainsi que sur 1,347%,3 de carbone introduits dans la culture sous forme de saccharose, 1,055%r,6 sont mis en liberté à l'état d'acide carbonique.

Ces chiffres nous prouvent qu’une culture du bacille des nodosités, âgée de 16 à 20 jours, dans laquelle la liqueur de Fehling ne révèle plus trace de sucre réducteur après inversion préalable, a perdu la presque totalité du carbone que le saccharose y avait

1. Ce rapport n’est pas, en réalité, aussi éloigné de l’unité que l’indiquent les calculs ; on ne tient pas compte en effet de l’azote fixé; on sait cependant que toute diminution d’azote libre se traduit par une augmentation apparente de CO2+0; mais la différence entre les nombres 79 et 77,5 fournis par la première analyse, ne provient pas tout entière de l’appauvrissement de l’atmosphère en azote, car s’il en était ainsi, au bout de huit jours, dans une atmosphère confinée de 51.. nous obtiendrions un gain d'azote de 70 milligr. Or, en 16 jours, dans un courant d’air continu, nous n'avons pas obtenu ce résultat, à beaucoup près, L’excès d’acide carbonique dégagé sur l’oxygène absorbé se traduit d’ailleurs par une augmentation constante de pression, indépendante des oscillations barométriques.

apporté. Mais, en échange, il s’y est produit un gain d'azote, et fl s’y est formé une mucosité si abondante que les milieux liquides servant à la cullure, en couche mince, sont presque solidifiés.

Dans la fermentation visqueuse des jus sucrés, quelque chose de semblable se produit; mais l’analogie est toute superficielle. La matière visqueuse provient d’une sorte de transformation isomérique du sucre; avec le bacille des nodosités on assiste à une combustion presque parfaite du saccharose; la mucosité qu’il fabrique nous apparaît donc comme une substance digne d'attention; lorsqu'elle se forme abondamment, il y a fixation d'azote ; lorsqu'elle est absente ou peu abondante, on ne constate pas degain &’azote dans les cultures. C'est ce rapprochement que je voulais mettre en relief : les faits nous l'imposeront encore plus d’une fois dans le cours de ce travail.

D’après tout ce qui précède, nous voyons que le bacille des légumineuses est un microbe essentiellement aérobie; lazote atmosphérique ne joue dans sa vie qu’un rôle très effacé; une fraction très petite seulement est mise en jeu.

M. Laurent a cependant constaté la formation de colonies dans une atmosphère d’azole pur; celte observation semble en contradiction avec les faits que nous venons d’exposer, et elle mérite d’être étudiée.

Prenons pour cela des tubes à essai ordinaires, et soudons une tubulure à étranglement à l'extrémité fermée; étirons l’autre extrémité de facon à obtenir une tubulure semblable à la première; celle-ci est légèrement inclinée sur l’axe du tube pour permettre de le pencher lorsqu'il contient quelques centimètres cubes de gélose. Grâce à ce dispositif, on peut placer ces tubes les uns à la suite des autres sur un courant d'azote préparé en faisant agir le nitrite de potassium sur le chlorure d’ammonium, en solution concentrée; le gaz est débarrassé des produits nitreux et de l’'ammoniaque par des flacons laveurs remplis de potasse et d'acide sulfurique. Les tubes sont adaptés encore bouillants sur l'appareil purgé d'air par le dégagement de Pazote.

Puis on attend une demi-heure; au bout de ce temps, la gélose est solide et froide; on l’ensemence avec deux ou trois gouttes d’une dilution copieuse de bacilles, et quelques minutes après, on ferme les deux extrémités à la lampe sur le courant

no es

d'azote. On ensemence ensuite les autres tubes les uns après les autres, et on les scelle à la flamme de la même manière.

Ces cultures ont été conservées à la température de la chambre avec des témoins préparés de la même façon, mais remplis d'air. Au bout de 5 jours ceux-ci donnent une culture abondante; les autres ne présentent pas de développement visible à l'œil nu; on en sacrifie un et on prend avec une pipette une goutte de la dilution qui surnage pour l’ensemencer dans un tube ouvert; celui-ci se couvie de colonies au bout de 3 jours.

Au bout de 15 jours on ouvre deux autres tubes sur lesquels on ne constate pas non plus trace de développement ; on s’en sert pour ensemencer des tubes ordinaires; les germes conservés à l'abri de l’air pendant 15 jours poussent encore énergiquement.

On a refait la même expérience avec une nouvelle série de 4 tubes préparés de la même façon; ils ont fourni les mêmes résultats.

Le bacille des légumineuses ne pousse donc pas dans une atmosphère d’azote pur; M. Laurent n’a sans doute observé la formation de colonies que parce que son azote, obtenu par l'oxydation du cuivre porté au rouge, renfermait encore des traces d'oxygène.

IIT

INFLUENCE DE LA RICHESSE DES MILIEUX EN AZOTE COMBINÉ ET EN SACCHAROSE SUR LA FIXATION DE L’AZOTE LIBRE.

Jusqu'ici, nous nous sommes bornés à étudier la fixation de l’azote libre dans des cultures de composition à peu près constante. Deux éléments exercent une action prépondérante sur le résultat final: l’azote combiné et le saccharose ; faisons varier l’un et l’autre, et cherchons quelle est l'influence de ces variations sur le gain d’azote.

Dans ce but, mettons en culture 5 ballons plats renfermant 50 c. c. de bouillon de haricots préparé comme plus haut ; comme

l’eau du robinet est suffisamment alcaline par elle-même, on supprime le bicarbonate de soude; on supprime également le chlorure de sodium qui, à la dose de 5 0/00, paralyse le développement du microbe. Ces ballons contenaient avant l’expérience :

AZOTE SACCHAROSE No ARE L1n8,6 48,75 lee CREER 2 ES Nr OS 200) PRET 9 2251) ES RSR 9 3 Observations sur les cultures. — Le n° 1 se trouble fortement dans les

24 heures. Les nos 2 et 3 se développent plus lentement; les microbes forment une membrane adhérente au fond du vase, visible dès le 2e jour; la mucosité se développe presque aussi rapidement que dans le no {, dont le bouillon est complètement figé au bout de 8-9 jours.

Il n’en est pas de même pour les nos 4 et 5; la membrane de fond ne devient visible qu’au 4e jour, elle apparaît comme une toile d’araignée dont les mailles irrégulières sont réunies par une membrane extrêmement fine. Examinée au microscope avec un grossissement de 50, on la voit striée; dans toutes les directions, de tubes uniformément colorés, lorsqu'on se sert de colorants basiques ; si on fait agir modérément l’alcool, ces tubes s’éclaircissent, et l'on distingue nettement dans leur intérieur de petits bacilles noyés dans une enveloppe de mucosité. Ces tubes présentent des renflements et des étranglements sur tout leur parcours. Nous aurons encore l’occasion de les observer daus d’autres circonstances.

Cette membrane s’épaissit lentement, et au bout du vingt et unième jour de culture, au moment où l’on met fin à l'expérience, le liquide surnageant est tout à fait dépourvu de viscosité, le microbe présente pes d'un bacille qui prend bien la couleur. |

La culture n° 1 a été arrêtée au dix-neuvième jour; elle présente tous les caractères des cultures dans lesquelles on constate une fixation abondante d'azote.

Les cultures n° 2 et 3 présentent des formes ramifiées et des formes en poires; à part ce caractère, elles ressemblent à la première, comme aspect, elles ont duré respectivement 21 et 22 jours.

Voici lesrésultats concernant l’azote et le sucre restant, fournis par l’analyse; les n° 5 et 6 ne figurent pas dans ce tableau; on y retrouve tout le sucre primitif à un décigramme près, etle gain d'azote y a été nul.

LR LE A +4 + LA À

Æ Te

Azote final. Azote gagné. Sucre restant. Sucre consommé. Rapport de l'azote gagné au sucre consommé,

no4 23mer7 A9mer{ Ogr ÿAl 1209mgv SES n02 22 ,6 12 ,8 O0 ,803 41196 RE n03 9 8 13 0 ,870 1379,4 > 1

Eu égard à la durée des cultures, ces résultats sont à peu près identiques ; ils concordent avec ceux qui nous ont été fournis par les premières expériences, le rapport de l’azote gagné au sucre consommé oscille toujours aux environs de 1/100.

Ces chiffres nous montrent en outre que le gain d’azote est indépendant de l'aspect morphologique du microbe; la culture n° À ne renferme pas de formes ramifiées, les deux autres contiennent un mélange de bacilles simples et de formes ramifiées, ou en poires. Le développement de celles-ci a été cependant plus lent au début; le retard augmente avec la dose de saccharose; à partir de 4,5 0/0, le bacille se multiplie encore, mais la culture reste pauvre; la mucosité ne se'forme pas, et il n’y a pas d'azote fixé. Avec 5 et 6 0/0 de sucre, on observe seulement une légère prolifération de microbe.

Calculons maintenant la relation qui existe entre le sucre initial et l’azote fourni au microbe avant l'expérience.

Nous avons les trois rapports suivants :

116 66 n° À Te RAT Etre 17500 — 10 000 e 98. = 49 + 20000 — 10000 98 43 n° 3 —

Si nous prenons la moyenne, nous obtenons le rapport 1/200 en chiffres ronds, ce qui veut dire que les cultures qui fournissent le meilleur rendement au point de vue de la fixation de l’azote doivent renfermer, au début, une partie d’azote combiné pour 200 de saccharose ; la limite inférieure du sucre étant 2 0/0 et la limite supérieure 4 0/0.

Reprenons maintenant la même expérience en laissant con-

stante la dose de saccharose et en introduisant des doses varébles

d'azote combiné.

PAS en

Cet élément est représenté dans les cultures par les chiffres AGmer,6, A3mer,3, Omer, 9, (Gmer 6, 37mr,3.

ils sont entre eux comme les nombre 5, 4, 3, 2, 1; chaque culture avait recu 18,5 de saccharose; les quatre premières se sont montrées à peu près aussi actives les unes que les autres au point de vue de la fixation de l’azote libre; ie n° 4 s’est développé plus lentement que les trois autres; le n° 5 a donné une membrane de fond, mince et résistante, mais pas de mucosité ni d’azote fixé : sa teneur en azote initial est insuffisante. Nous sommes donc conduit à assigner comme limite minimum à l'azote combiné dans les bouillons de culturelechiffre de 7 milligrammes pour 50 c.c. de liquide; la limite maximum étant naturellement fixée à 15"er environ par les rapports que nous avons établis plus haut.

Voilà les chiffres; quelles conclusions pouvons-nous en tirer? Ceux qui représentent la limite maximum de saccharose et le minimum d'azote combiné offrent beaucoup d’intérêl. Dans les deux cas, lorsque ces chiffres sont dépassés ou ne sont pasalteints, il n’y a plus de gain d’azote dans les cultures; le développement se fait mal et la mucosité est toujours absente. Cette substance ne se rencontre jamais non plus dans les cultures où le bouillon atteint plusieurs centimètres d'épaisseur et, dans ces conditions, l'analyse ne révèle aucun enrichissement en azote.

Comme nous avons montré, d'autre part, que la mucosité ne résulte pas d’une modification allotropique du sucre, nous sommes conduit à la regarder comme un composé azoté élaboré par le bacille des légumineuses. Dans la série des transformations auxquelles le saccharose est soumis, il se forme des composés capables de s’unir à l’azote atmosphérique, grâce à l'énergie mise en jeu par la dislocation de la molécule de sucre.

Le même phénomène doit se passer dans les tubercules radicaux; cependant, on ne trouve pas de mucosité dans ces formations. Une goutte d’une émulsion faite avec le contenu d’une nodosité possède la fluidité d’une goutte d'eau, et s’étale avec facilité sur une lame de verre. Au contraire, la moindre parcelle d’une culture sur gélose, prise avec un fil de platine, donne une consistance visqueuse à la goutte d’eau daus laquelle on la délaye, et s'étend difficilement sur le verre.

Faut-il en conclure que le bacille des légumineuses ne produit pas de mucosité lorsqu'il se développe dans le tissu des

Did

racines ? Celte supposition ne semble pas probable, lorsqu'on voit un fragment de pulpe de nodosité donner sur gélose sucrée une quantité appréciable de cette substance au bout de 24 heures à la température de 24-259. Si on ne constate pas sa présence dans les tubercules, c’est sans doute parce qu’elle est entraînée par la sève à mesure qu’elle se produit, et c'est probablement elle qui sert de trait d'union entre le microbe et la plante.

Dès que les nodosités apparaissent sur les racines des légumineuses cultivées dans du sable stérile, celles-ci traduisent l’action bienfaisante de leurs hôtes par une reprise très nette de la végétation, succédant à une période de souffrance due à la privation temporaire d’aliment azoté.

MM. Hellriegel et Wilfarth !, qui ont observé les premiers ces phénomènes, en ont donné une description très nette :

« Ainsi les cultures de légumineuses, en présence de solutions nutritives pourvues de nitrates depuis leur sortie de terre jusqu'à leur récolte, c’est-à-dire jusqu’à l'épuisement des nitrates fournis, ont continué à croître sans aucune interruption visible, tandis que la végétation des cultures privées d'azote tomba pour ainsi dire, par bonds successifs, à trois époques différentes, non moins claires que frappantes.

« Dans la première période qui comprend les trois ou quatre premières semaines de leur existence, pendant lesquelles les

jeunes plantes sont alimentées évidemment par la réserve nutri-

tive de la semence, la croissance fut active et normale. A cette période en succéda une-autre d'interruption complète et d’arrêt dans la production. Les jeunes plantes perdirent leur fraîche couleur verte; on voyait les vieilles feuilles périr par résorption, tandis que celles qui étaient nouvellement formées poussaient visiblement plus petites que les premières et fort misérables.

« Enfin, à ce moment, les pois se comportèrent exactement comme les graminées végétant dans un sol privé d'azote et depuis longtemps affamées. La durée de cette période fut très variable pour chaque plante : chez les unes elle ne fut que de quelques jours, et chez les autres elle persista pendant plusieurs semaines, Puis la troisième période suivit presque sans transition; les plantes reverdirent, et, recommençant à assimiler, eurent une bonne végétation jusqu’à la fin. »

1, Untersuchungenuber die Stickstoffnährung, Berlin, 1888.

Re T 1 ÿhEe

Ces observations établissent clairement que la reprise de la végétation coïncide avec l'apparition des nodosités sur les racines; mais MM. Hellriegel et Wilfarth ne disposaient d'aucune preuve matérielle qui leur permit de donner une démonstration rigoureuse de ce fait. L'étude des cultures pures du baalle des nodosités ne fit que l’embrouiller davantage; ce microbe se montrait incapable de fixer de l'azote libre dans les milieux artificiels; tout au plus se développait-il un peu dans les milieux dépourvus d'azote combiné, mais toujours sans gain d'azote appréciable. C'est sur la plante seule qu’il y avait développement, avec fixation d’azote qui, disait-on, entrait dans les tissus des bacilles pour les constituer; c’est cet azote des bacilles qu'utilisait la plante, et les nodosités devenaient ainsi de véritables organes de réserve. Telle était l'opinion de MM. Beyerinck, Prazmowski', Frank et Laurent.

Les résultats que nous avons obtenus au point de vue de la fixation de l’azote donnent, de l’observation très exacté de MM. Hellriegel et Wilfarth, une explication aussi simple que satisfaisante. Le bacille fabrique, dans certaines conditions de nutrition hydrocarbonée et azotée, une sève muqueuse et azotée que le végetal utilise.

Les caractères physiques de cette mucosité concordent bien avec le rôle que nous lui attribuons : c’estune substance colloïde, diffusible dans l’eau et susceptible, par conséquent, de servir d’aliment à un organisme vivant; mais quels sont les caractères de cette solution muqueuse ? C’est ce dont on peut se faire une idée en cherchant comment elle traverse les membranes ou les cloisons poreuses.

Une culture de 50 c. e., renfermant 26 milligrammes d’azote, étendue de deux fois son volume d’eau distillée, a été filtrée à travers une bougie Chamberland, sous une pression de 20 c. de mercure; la bougie plongeait de 2 c. dans l’eau distillée; la filtration se faisait de l’intérieur vers l'extérieur. Elle a duré 24 heures. La quantité d’azote passée à travers la bougie est de 2M8r6, soit 1/10 de l’azote total,

Une deuxième expérience a été faite avec une culture de 50 c. c. étendue également de deux fois son volume d’eau, mais

1. Landwirthsch. Versuchstat., XXXNIH, — Bot, Centralbl., XXXIX,

md à SEE

ce liquide a été placé cette fois dans un dialyseur cylindrique en papier parcheminé.

L'appareil a été soumis à l’action d’un courant d’eau ordidaire pendant 48 heures, et pendant 36 heures à l'action de l’eau distillée renouvelée toutes les 8 heures, Au boutde ce temps, OmrG d'azote sur 1346 ont passé à travers la membrane. Le contenu du dialyseur a conservé toute sa viscosité et son homo généité.

On a repris cette expérience avec une culture de 100 c. ce. étendue cette fois de 8 fois son volume d’eau distillée.

Dans le même laps de temps et dans les mêmes conditions que tout à l'heure, le liquide a perdu 86,5 d'azote; avant l'expérience il en renfermait 32,04 ; un quart environ de l’azote total avait donc traversé la membrane. Le liquide avait perdu toute sa viscosité ou à peu près; les microbes formaient un dépôt aggloméré au fond du dialyseur.

Cette dernière expérience prouve que la culture renferme, à côté de l'azote immobilisé dans le corps des microbes, un composé quaternaire capable de diffuser à travers les membranes. Cette matière azotée diffuse d'autant mieux qu’elle est plus étendue; dans les nodosités elle est donc entrainée facilement par la sève, et c'est pour cette raison qu'on ne la rencontre jamais dans ces organes ‘.

Il peut sembler surprenant que dans ces conditions le microbe qui la produit ne l'utilise pas, et que nous ayons pu voir notre culture n° 5 (p. 18), qui renfermait au début de l'expérience guer,3 d'azote combiné, ne donner qu’un faible développement sans aucun gain d'azote après 21 jours de durée. On pourrait croire & priori qu'il suffise de fournir une trace d’alimerit azoté, pour amorcer la culture et permettre au bacille de s’alimenter en fabriquant son protoplasme aux dépens de l’azote libre, et en consommant les hydrates dé carbone qu'on lui a offerts.

1, Le hasard n’a permis cependant de la rencontrer une fois dans des tubercules de pois tardifs, quiétaient encore en pleine végétation au mois de novembre dernier. À la suite d’un. abaissement assez brusque de la température, l’assimilation par la plante s’est ralentie, et la production de mucosité a été supérieure à la consommation; elle s’est accumulée dans les tubercules, dont la pulpe très pâteuse, déposée dans une goutte d’eau sur une lame de verre, rend le liquide très visqueux,

Cette observation confirme, d’une manière éclatante, les déductions que j'avais déjà formulées,

09 le

L'expérience montre pourtant qu’il n'en est rien. Dans une culture pauvre en azote combiné, le développement est pénible; les microbes se multiplient, mais ils perdent leur activité vis-àvis de l’azote libre; ils ne consomment pas d’hydrate de carbone ou ils en consomment très peu. Ils n'élaborent pas de mucosité visible, et n’utilisent pas les quantités insaisissables qu’ils pourraient fabriquer, car ils ne poussent pas.

Les corps quaternaires qui constituent la mucosité doivent donc nous apparaître comme des produits d’élaboration microbienne, analogues à l'alcool ou à l’acide lactique, qui sont inattaquables par les cellules qui les ont produits, mais nutritifs pour d’autres organismes.

De ce que les bacilles vivent péniblement dans les milieux contenant de faibles quantités d’azote combiné, comme dans notre expérience n° 5 (p. 18), nous pouvons inférer qu'ils ne se développeront pas dans des milieux privés d'azote. Cette conclusion esten contradiction avec les observations de MM. Franck, Prazmowski et Laurent, mais elle est d'accord par contre avec les résultats de M. Beyerinck, qui a vu le développement des cultures s'arrêter sur gélose renfermant du sucre et des sels, dès que la petite quantité d'azote assimilable est épuisée.

Il y a donc lieu de vérifier ces résultats contradictoires. J’ai pris pour cela deux ballons plats lavés à plusieurs reprises avec de l’acide sulfurique concentré, puis avec de l’eau ordinaire et avec de l’eau distillée, quatre ou cinq fois, pour en enlever toute trace de matière azotée.

Chacun de ces ballons a reçu 50 c. c. de la solution suivante, faite avec de l’eau distillée et des corps chimiquement purs.

Eau distlléers SEE Ent Eee 1,000 Saccharose set eine RE RER RE 20 Phosphate de potassium.............. . 1 GChlofure de/sodium ANR : 1

Sulfateide Ter LES Re

Sulfate de magnésie Chlorure de zinc

css soso sets traces

sons

soso ssss

Les deux ballons, bouchés avec des tampons d’amiante, ont été stérilisés à 120° et ensemencés avec une dilution assez riche

d'une culture âgée sur gélose, faite avec de l’eau distillée stérile. Les cultures étaient parcourues par un courant d’air débarrassé de tout composé azoté par la méthode employée plus haut.

Au bout de huit jours les solutions sont limpides comme au début de l'expérience.

Le contenu d’un vase, examiné au microscope après coloration par le bleu de méthylène, ne montre que quelques bacilles irréguliers, plus ou moins recourbés et prenant mal la couleur; examinés en goutte suspendue, ces bacilles se montrent immobiles.

Ensemencée sur gélose, une goutte du liquide de culture donnait un développement luxuriant au bout de 3 ou #4 jours.

Le second ballon a été laissé en expérience ; mais on a arrêté la circulation d'air et on a supprimé toute communication avec l’atmosphère ambiante. Après 28 jours la solution est toujours limpide; l'examen microscopique et la culture d’épreuve ont donné les mêmes résultats que la première culture.

La conclusion est nette : la semence avait conservé toute sa vitalité pendant 28 jours ; mais on n’a pas observé, même au microscope, la moindre prolifération de cellules.

Il nous reste, pour terminer l’examen des expériences faites plus haut, à étudier la nature du pseudo-mycélium que l’on observe dans les nodosités, tout à fait au début de leur développement. Dans une coupe fraîche de jeunes tubercules, cette formation présente l’aspect de tubes réfringents non cloisonnés, irréguliers ; ils décrivont dans lesjeunes cellules un trajet sinueux et semblent traverser les cloisons sans solution de continuité *,

M. Beyerinck les considère comme les restes des filaments nucléaires désagrégés par l’infection microbienne.

M. Prazmowski en a vu sortir des coccobacilles très fins; il les regarde comme une forme transitoire du bacille des légumineuses qui en dérive par voie endogène. Aux yeux de M. Laurent ils ont la même signification; mais pour lui les microbes ne prennent pas naissance par voie endogène; ils se forment par bourgeonnement comme les formes-levures qui se montrent sur

4. Voir à ce sujet les deux belles planches du Mémoire de M. Laurent (ces Annales, t. V). +

le mycélium de certaines espèces de champignons microscopiques. M. Prillieux ‘ affirme que ce sont des trainées d'une mucosité analogue à celle qui se forme dans les cultures.

En rapprochant les observations de MM. Prazmowski et Prillieux des faits que nous avons établis, on peut expliquer la production de ces tubes d’une façon simple. Lorsque le microbe envahit les tissus des jeunes racines, il progresse surtout par voie de multiplication; il élabore aussitôt cette substance glaireuse dans laquelle il reste englobé, et c’est ainsi que s'édifient les tubes irréguliers qui affectent l’aspect d’un mycélium et conservent leur apparence organisée tant que les vaisseaux ne se sont pas formés dans les jeunes tubercules; mais lorsque la circulation de la sève se fait régulièrement dans ces organes, la mucosilé est entraînée, et les coccobacilles, débarrassés de leur enveloppe, s’allongent et se ramifient. |

.Si l’on fait une préparation avec la pulpe d’un jeune tubercule à peine visible à l'œil nu, on ne trouve en effet que des coccobacilles; cette pulpe ne renferme jamais de fragments mycéliens, parce que la substance qui les constitue se diffuse

immédiatement dans le suc cellulaire et dans la goutte d’eau que

l’on dépose sur la lame de verre.

Si ces tubes étaient formés par un être vivant, ils résisteraient comme tous les microorganismes à ce mode de préparation. Ils ne résistent pas mieux aux manipulations qu’exigent les tissus pour les coupes en séries; on ne peut les soumettre à d’autres méthodes de coloration que celles que l’on emploie pour le protoplasme vivant. (Laurenr, /. c.)

.Nous trouvons page 16 une autre preuve de cette interprétation, c’est la formation de tubes analogues dans les cultures qui renferment une dose exagérée de saccharose; la seule différence qu'ils présentent avec le pseudo-mycélium consiste dans une question de volume. Colorés par la fuchsine de Ziehl], ils ont l’aspect de gros tubes opaques qui sillonnent dans toutes les directions la fine membrane qui se forme après eux au fond du vase de culture. Si on décolore convenablement à l'alcool, ces tubes deviennent plus transparents, et l'on peut distinguer nettement les coccobacilles qui les remplissent (fig. 4, pl. D).

1, Comptes rendus, t. CXI, p. 926.

du.

Les nitrates et les sels ammoniacaux constituent des aliments pour les microbes des nodosités, comme l'ont établi MM. Frank, Prazmowski, Beyerinck et Laurent.

Le développement est cependant assez médiocre dans les

solutions purement minérales, additionnées de 1 0/00 de sulfate d'ammonium, même placées en couche mince dans des ballons plats ; les microbes se déposent en cercle dans les parties déclives, et forment une légère couche pulvérulente, facile à mettre en suspension. Laliqueurne prendjamaisune consistance visqueuse; le saccharose se retrouve presque intact au bout de quinze jours.

Si on remplace le sel ammoniacal par de l’azotate de sodium à poids égal, il se forme au bout de quinze jours une membrane de fond, et ie liquide prendune légère viscosité.

La supériorité de l'azote nitrique sur l’azote ammoniacal s’observe également dans un bouillon formé d’une décoction de terre additionnée de 3 0/0 de saccharose et de 1 0/00 de sulfate d’'ammonium ou de nitrate de sodium.

Dans le milieu nitré, le développement se fait régulièrement; il se forme une membrane assez épaisse; le liquide devient visqueux ; le saccharose est consommé, et les cultures accusent un léger gain d'azote au bout de 30 jours.

Dans le bouillon ammoniacal on observe seulement, pendant les 4 premiers jours, un dépôt pulvérulent; puis à partir de cette époque, on voit poindre à la surface de ce dépôt quelques z00glées sphériques, d’une couleur blanche, adhérant très peu au fond du vase et s’étirant par la moindre agitation en longs filaments visqueux ; ces flocons augmentent peu à peu de volume et se fondent les uns dans les autres ; ils sont constitués par un long bacille vacuolaire qui donne des cultures ordinaires sur gélose, Quelque temps après l'apparition des zooglées, on voit se former une légère membrane; le liquide prend une consistance un peu visqueuse; mais, après 30 jours de culture, le saccharose a très peu diminué et le gain d’azote est nul.