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Les 50 c. c. de décoction de terre qui constituaient les ‘ milieux de culture renfermaient 0"s'79 d’azote total provenant du sol ; le bouilloa nitré ne donnait plus de coloration à la diphénylamine à la fin de l'expérience : le milieu ammoniacal se colorait très nettement au réactif de Nessler.

L'ammoniaque, même en présence de quelques traces d’azote organique, constitue donc un aliment très médiocre pour les microbes des nodosités ; ceux-ci poussent aussi bien dans de l’eau de terre pure additionnée de quelques millièmes de saccharose.

Is se multiplient également dans de la terre stérilisée et dépourvue de nitrates, mais il semble qu'ils soient incapables d'enrichir la terre en azote. Voici les résultats que j'ai obtenus en cullivant les microbes des nodosités dans 50 grammes de terre sur le fond d’un vase à deux tubulures, constamment traversé par un courant d'air lent. Cette terre avait été préalablement lavée pour la débarrasser des nitrates.

L'analyse de l’azote total a fourni les chiffres suivants pour un gramme de terre bien desséchée à 100°.

Lerre ayant l'expérience. #70 mener eee 7m8r05 Terre ensemencée avec le bacille des légumineuses... 6mgr5

Cette culture a duré trois mois, le bacille avait conservé au bout de ce temps toutes ses propriétés ; il n’a pas donné de gain d’azote; mais on ne peut pas considérer ce résultat comme définitif : l'échantillon de terre qui m’a servi a été pris dans l’enclos de l’Institut Pasteur; c’est plulôt un véritable terreau. Un sol, pour s’enrichir en azote sous l’influence des microbes, doit réaliser d’autres conditions; on les connaît suffisamment maintenant pour qu’il soit nécessaire d’y insister plus longuement.

De tout ce qui précède, on peut conclure que ces microbes peuvent vivre dans le sol; on les trouvera surtout très nombreux dans les sols riches en matières organiques, puisque les nitrates, loin de paralyser leur développement, peuvent au besoin leur servir d'aliments.

Les botanistes et les agronomes sont cependant unanimes à constater que les nodosités sont plus nombreuses et plus grosses sur les racines des légumineuses qui poussent dans les terres pauvres. Ils attribuent ce fait à l’action des nitrates; dans les

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sols fertiles où cet engrais suffit à assurer largement l’alimentation azotée de la plante, celle-ci peut se passer du secours des microbes et résiste à leur envahissement.

Les mêmes observations peuvent se faire avec des plantes cultivées dans des solutions nutritives stériles. Il y a même plus : quelques auteurs ont remarqué que les tubercules radicaux exercent une influence contrariante sur le développement des légumineuses en présence des nitrates

On a interprété ces faits de la façon suivante : les légumineuses renferment un composé capable de se combiner aux nitrates, et d'empêcher ensuite le développement du bacille des nodosités. (Laurenr, loc. cit.) Celui-ci assimilerait également les nitrates aux dépens de la plante, et par suite la gênerait dans son développement. (Nosse, loc. cit.)

Nous allons essayer à notre tour d’élucider la question ; mais auparavant, nous devons établir encore quelques faits nouveaux.

ACTION DES RACINES DES LÉGUMINEUSES SUR LES FORMES: LIBRES DES MICROBES DES NODOSITÉS j

Les microbes des nodosités sont très mobiles; pour observer leurs mouvements, il suffit d'examiner, en goutte suspendue, une culture sur gélose âgée de 4-5 jours, à la température de 25° environ. On les voit doués d’un mouvement de translation très rapide, qu'ils conservent très longtemps en chambre humide. Au-dessus de 25°, la mobilité est beaucoup moins générale; on ne l’observe plus à 30°, ni au-dessous de 15°.

Le bacille des légumineuses est donc capable d’obéir promptement à des actions chimiotaxiques.

A l’origine de mes recherches, j'ai fait un grand nombre d’inoculations sur des plantes végétant en solutions stériles, dans le but de vérifier la nature du microbe que j'avais isolé des

4. Nosse. Versuchsstationen, 1896. — SonriBaux. Agriculture pratique, 1897. t. I, n° 923.

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tubercules. Je n'ai pas tardé à remarquer que ceux-ci se forment toujours, non pas sur les racines anciennes, mais sur les portions de racines qui se sont développées après l'introduction des bacilles dans les solutions nutritives. Cette particularité attira tout de suite mon attention. Essayons d'en découvrir la cause.

Pour montrer que ce sont les extrémités des racines qui attirent les microbes des nodosités, prenons 5 jeunes plants de pois que l’on.a fait germer en milieu stérile. Ils ont deux ou trois feuilles, et leurs racines principales ont en moyenne 15 centimètres de long. Coupons ces racines de façon à supprimer larégion des poils absorbants, etintroduisons-lessur unelongueur d'environ 5-6 centimètres dans une dilution de culture pure du microbe des nodosités, contenue dans une poche de collodion hermétiquement fermée avec un tampon de la même substance, et bien lavée dans de l’eau distillée, Le liquide de la dilution est identique à la solution nutritive dans laquelle on fait pousser les plantes.

Les résultats de cette expérience sont les suivants: toutes les fois que la portion de racine principale enfermée dans la poche de collodion donne naissance à des racines latérales, celles-ci sont couvertes de tubercules, la première n’en porte jamais, malgréla section qu'on y a pratiquée. Il semble donc que les parties jeunes des racines et plus particulièrement les régions pilifères attirent seules les microbes, et que l'infection de la plante soit provoquée par une substance quelconque qui diffuse à travers les membranes, à la façon par exemple de la sécrétion acide des poils absorbants.

L'action attractive des régions pilifères peut encore être mise en évidence de la façon suivante : Faisons germer quelques pois à l’abri des microbes et transplantons-les dans la terre, bien arrosée, lorsqu'ils portent trois ou quatre feuilles; au bout de trois semaines environ, ils ont donné trois ou quatre nouvelles feuilles; arrachons-les et examinons leurs racines ; celles qui étaient formées avant le repiquage ne portent aucun tubercule; toutes celles qui se sont développées dans le sol en sont pourvues.

Ceci étant établi, il y a lieu de se demander quelle est la substance qui entre en jeu dans ce phénomène de chimiotaxie:

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Les hydrates de carbone s'imposent à l'attention en raison de la place si importante qu’ils tiennent dans l’histoire des microbes des nodosités. De plus, on les rencontre dans la sève de tous les végétaux.

On n'a pas montré jusqu'ici, du moins à ma connaissance, qu'il s’en élimine aux extrémités des racines. Dès qu'ils se répandent dans la terre ou dans les solutions nutritives où l'on fait végéter des plantes, ils deviennent la proie des microbes. Il faut donc les rechercher dans les milieux stériles où l’on fait germer des graines.

Prenons quelques lots de dix semences de vesce de Narbonne bien stérilisées; plaçons-les, dans un vase d'Erlenmeyer, sur une couche de coton recouvrant des fragments de verre immergés dans de l’eau distillée, le tout préalablement stérilisé à 120°.

Sur ce nombre de récipients, quelques-uns sont toujours contaminés par des germes apportés par les graines; on les rejette.

Quand les jeunes plantes ont formé une ou deux feuilles, on change le liquide des ballons et on le remplace par de l’eau distillée stérile. On fait cette opération tous les deux ou trois jours en s’assurant avant chaque prise, par des ensemencements sur gélose, que les cultures ne sont pas contaminées. On soumet au fur et à mesure le liquide recueilli à une ébullition prolongée, afin d’être toujours sûr de le conserver à l'abri des microbes.

Au bout de quinze jours, on a accumulé ainsi un demi-litre d’éau de germination. Cette eau évaporée à 30 ou 40 °, bouillie avec une goutte d'acide chlorhydrique, et essayée par la liqueur de Fehling, donne un précipité d’oxydule de cuivre caractéristique de la présente d’'hydrates de carbone ‘

“ 1 Je me suis proposé de déterminer par le même procédé la nature de lacide mis en liberté par les racines ; dans ce but, j'ai évaporé à sec 200 c. c. d’eau de germination ; l’extrait a été épuisé par l'éther.

Celui-ci évaporé à son tour laisse au fond de la capsule un enduit liquide presque imperceptible, fortement acide au papier de tournesol ; on le redissout dans de l’eau distillée, on fait agir à l’ébullition de l’oxyde de zine pur préparé au laboratoire, on filtre, et on fait évaporer très lentement dans un verre de montre, à l’abri des poussières. Le récipient se recouvre de fines stries concentriques dans lesquelles on distingue au microscope de petites aiguilles enchevétrées, caractéristiques du lactate de zinc.

L’extrait épuisé par l’éther, redissous dans deux ou trois centimètres cubes

d’eau distillée, n’est plus acide.

Nous avons donc le droit de rechercher si les hydrates de carbone, les plus communs dans le règne végétal, exercent une action chimiotaxique sur le bacille des légumineuses.

Je me suis servi, pour faire ces recherches, d’un tube à essai de 20 centimètres de longueur sur deux de diamètre, divisé en deux compartiments par une cloison en verre; lecompartiment supérieur à 8 centimètres de hauteur, l'inférieur en à 12. Celui-ci porte une tubulure latérale, de même diamètre que le tube principal; elle est fixée au-dessous de la cloison. On la ramène, par une courbure convenable, dans la position verticale; son ouverture se trouve dans le même plan que celle du tube. Un tube capillaire très fin, d’une longueur de 8 centimètres, fixé à la cloison au moyen d’une soudure intérieure, met les deux chambres en communication.

Son extrémité supérieure affleure de quelques millimètres au-dessus de la cloison.

L'autre extrémité porte une courbure dont la petite branche a 5 millimètres de longueur. On souffle une ampoule au tiers inférieur ; elle a un diamètre de 8 à 10 millimètres.

Remplissons cet appareil d’un liquide stérile, de facon à faire affleurer la surface

Biz 4, libre à une hauteur de 2 centimètresenviron au-dessus de la cloison. Plaçons, dans Ja chambre supérieure, une trace d’un corps soluble convenablement choisi, et laissons tomber dans la chambre inférieure, par la tubulure latérale, deux gouttes d’une dilution de culture jeune sur gélose d'un microbe mobile, faite avec un liquide identique à celui qui remplit l’appareil. Si la substance qui diffuse à travers la colonne liquide du tube capillaire exerce une attraction sur les microbes, ceux-ci pénètrent dans le tube et montent peu à peu dans la chambre supérieure où la concentration du liquide est la plus forte. Ou pourra y constater leur présence en faisant, à des inter-

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valles de temps plus ou moins espacés, des ensemencements sur gélose avec des prises de liquide.

L’ampoule du tube capillaire et la position latérale de son ouverture inférieure ont pour but d'empêcher le passage accidentel des microbes dans la partie supérieure du grand tube, par un entrainement de liquide occasionné soit par les chocs, soit par une légère dénivellation des deux surfaces libres.

J'ai fait un grand nombre d’essais avec le microbe des nodosités et les hydrates de carbone. Comme milieu, jai employé de l’eau physiologique, du bouillon de haricots et de l’eau de terre. C’est ce dernier liquide qui m'a fourni les meilleurs résultats. J

J’ai fait agir le saccharose, le glucose, l’amidon soluble, et de l’eau distillée stérile dans laquelle avaient germé des semences de vesce de Narbonne; chacune de ces substances était répartie dans trois tubes à raison de quatre gouttes d’une solution à 2°/, dans chaque tube; dans chacun d’eux on introduisait ensuite deux gouttes d’une dilution, dans de l’eau de terre, de culture sur gélose âgée de deux jours. On opérait en même temps sur trois tubes témoins qui ne recevaient que des microbes. Inutile d'ajouter que toutes ces opérations exigent l'emploi de milieux stériles et des cultures pures. Elles ont été faites à une température moyenne de 23-250.

Deux chiffres permettent d'apprécier l’action exercée par chacune des substances employées : 1°le temps que les microbes mettent à franchir une çolonne liquide de 8 centimètres ; 2° le nombre des microbes qui franchissent ce trajet dans un temps donné.

. Je n’ai employé que le premier procédé, car les hydrates de carbone favorisent la multiplication des microbes, et la question de numération s’en trouve faussée.

En faisant des prises de semence toutes les quatre heures, j'ai constaté de celte facon que les tubes qui ont recu du saccharose et du glucose donnent tous régulièrement des ensemence- . ments positifs au bout de 8 heures. — Les tubes témoins ne donnent des résultats qu’au bout de 12 heures ; ils sont tous fertiles au bout de 16 heures. Les tubes additionnés d’amidon soluble ne présentent qu’une légère avance sur les tubes témoins. Ceux qui ont recu de l'eau de germination accusent générale-

ment un léger retard sur les témoins ; les prises de liquide né donnent pas toujours des ensemencements positifs après seize heures.

En résumé, les résultats sont les suivants : les hydrates de carbone attirent les microbes des nodosités ; l’eau de germination semble les repousser.

La raison de cette contradiction n’est pas difficile à découvrir; l’eau de germinalion est légèrement acide, et, de plus, elle ne contient que des quantités infinitésimales d'hydrates de carbone. Si l’action des acides n’est pas éliminée par la réaction alcaline des milieux. elle se traduira toujours par un retard très sensible, car les acides, employés à raison de deux ou trois gouttes d’une solution à 1/1000 par tube, suffisent pour conserver la stérilité du liquide des chambres supérieures pendant plus de 24 heures. Quelquefois, les prises de semence redeviennent stériles après avoir donné des résultats positifs. Si l’alcalinité de l’eau de terre, par exemple, est suffisante pour neutraliser l'acidité de l’eau de germination, on constate encore que les microbes ne parviennent pas, dans la partie supérieure des tubes, plus vite que dans les témoins. Il faut donc admettre que les racines des légumineuses n’émetltent pas, abstraction faite des hydrates de carbone, une substance spécifique capable d’exercer une action chimiotaxique sur les microbes du sol.

Nous aurions pu étudier aussi l’action de quelques sels, en particulier des nitrates, car on se rappelle ‘que nous nous sommes proposé d'expliquer l'influence de ces corps sur la formation des tubercules radicaux. Mais l'explication découle tout naturellement de ce qui précède. Nous n’avons qu’à nous rappeler le rôle physiologique des nitrates dans l’organisme des végétaux ; MM. Lœw! et Olto® ont démontré qu'ils sont utilisés dans les feuilles principalement et dans tous les organes en voie de développement. Ils se combinent aux produits résultant de l’assimilation chlorophyllienne pour former des corps quaternaires.

En nous appuyant sur ces observations, nous pouvons affirmer . que si la plante trouve dans le sol assez de nitrates pour absorber les hydrates de carbone élaborés par les organes verts, la sève descendante n’en renfermera que très peu, et, par suite, les poils

1. Compte rendu dans les Annales agronomiques, t. XNI. 2. Ber. d. d. bot. Gesellsch., t. VIII,

absorbants n’en perdront pas par diffusion; les microbes du sol ne seront pas attirés et il ne se formera pas de nodosités. C’est le cas des terres riches. Les rares tubercules qui peuvent se développer restent chétifs parce qu'ils sont dépourvus d’aliments hydrocarbonés. Au contraire, si le sol renferme peu de nitrates, les hydrates de carbone circulent danstoutes les parties dela plante parce qu'ils sont en excès sur les aliments azotés; ils parviennent ainsi vers les extrémités végétatives des racines, et de là se répandent dans la terre. Les bacilles des légumineuses, attirés par la présence de cetaliment,envahissentlesrégionspilifères, parce que c’est dans l’intérieur même des cellules que les liquides sont le plus riches en hydrates de carbone, car, évidemment, les mêmes phénomènes que nous avons observés avec nos tubes à chimiotaxie se passent dans la nature.

Nous voyons donc que la question de la symbiose des légumineuses est réglée d’un bout à l’autre par le jeu naturel et simple des forces physiques que la vie met continuellement en action. Les plantes vertes disposent, dans les radiations solaires, d’une source d'énergie inépuisable; mais elles ne peuvent l'utiliser pour triompher de l’inertie de l’azote. On a vu par quel mécanisme les légumineuses y parviennent; grâce à cette propriété, elles sont aussi intéressantes au point de vue biologique qu'au point de vue agricole. Elles peuvent, suivant les conditions, vivre de la vie indépendante des autres plantes supérieures, ou de la vie saprophyte par l'intermédiaire des bacilles, ou bien encore des deux simultanément.

Cette dernière remarque nous permet d’aller au-devant d’une objection qui se présente ici : l'émission d’hydrates de carbone n’est pas particulière aux légumineuses, car ces composés se rencontrent dans tous les végétaux; pourquoi n’y a-t-il pas symbiose avec d’autres plantes? Remarquons que le caractère spécifique des légumineuses ne réside pas dans cette propriété de diffuser des hydrates de carbone, mais bien dans la faculté d'utiliser directement les composés quaternaires fabriqués par les microbes des nodosités aux dépens de l'azote libre.

Toutes les plantes privées de cette propriété se conduisent, vis-à-vis du bacille des nodosités, comme elles se conduisent à l'égard d’un microbe quelconque; elles se défendent par tous

les moyens dont elles disposent,