CHAPITRE VII

Les procédés employés dans les laboratoires pour rechercher et cultiver les microbes pathogènes sont aujourd'hui très compliqués et ont déjà atteint un degré de perfection remarquable. Dans un livre élémentaire comme celui-ci, nous ne pouvons que donner une idée générale de ces divers procédés, et nous renverrons, pour les détails, au bel ouvrage de MM. Cornil et Babès, les Bactéries1, où la technique des laboratoires d'histologie microbienne est décrite avec beaucoup de précision et de clarté.

MrcRoscoPEs. — Les meilleurs instruments pour la recherche et l'étude des microbes, sont ceux de Zeiss d'Iéna et de Vérick, h Paris : les objectifs à immersion dans l'eau ou d'autres liquides homogènes sont indispensables pour les forts grossissements qui permettent seuls de voir distinctement la plupart des bactéries. Les condensateurs et particulièrement celui d'Abbe, fabriqué

1. Un fort volume grand in-8, deuxième édition, 1886 (chez Félix Alcan, éditeur).

2i8 RECHERCHE ET CULTURE DES MICROHKS

pur Zeiss, ne sont pas moins utiles pour concentrer le faisceau lumineux sur le point de la préparation que l'on veut plus spécialement examiner, et mettre en relief les bactéries, surtout après qu'elles ont été colorées par un des procédés que nous indiquerons.

Il faut toujours commencer par examiner uni; préparation à un faible grossissement (50 à 100 diamètres) pour étudier sa topographie et reconnaître les points où il y a lieu de rechercher les colonies de microbes au milieu des tissus d'une coupe ou des matières en suspension dans un liquide.

On passe ensuite à un plus fort grossissement (5 à 700 par exemple), en se servant de la lumière simple du miroir, et l'on arrive enfin aux forts grossissements de 1,000 à 1,500 diamètres en se servant des objectifs à immersion et du condensateur.

Instruments, microtome. — Les instruments de dissection fine sont ceux dont on se sert d'habitude en histologie. On y joint des aiguilles de platine et de verre, des spatules minces en nickel pour transporter les coupes, etc.

Le rasoir ordinaire qui sert pour les coupes à main levée est insuffisant pour les coupes minces et larges nécessaires quand on recherche les bactéries. Il faut se servir d'un microtome, ou instrument à faire les coupes minces, et particulièrement de celui de Thoma ou de celui de Vérick. Quelquefois on durcit la pièce à examiner en la congelant au moyen d'une pulvérisation d'éLher, ce qui permet d'y faire des coupes minces avec le rasoir (microtome à glace de Jung).

Réactifs liquides non colorants. — Ce sont les acides, les bases, l'alcool, l'huile d'aniline, les essences qui

servent à. déshydrater ou à décolorer en partie les préparations; le baume de Canada qui sert à les enfermer, enfin l'eau distillée qui doit être absolument pure de microbes, ce qu'il est facile d'obtenir aujourd'hui au moyen du filtre -bougie Chamberland que nous avons précédemment décrit.

Récolte des liquides a examiner. — Pour recueillir les

Eig. 102. — Pipette à col tordu, bouchée de ouate et stérilisée.

liquides que l'on va chercher dans une salle d'hôpital ou ailleurs (sang-, urine, crachats, eau de mares, d'égout, etc.) on se sert de pipettes droites ou à col tordu (fi g. 102) terminées par une extrémité capillaire fermée à la lampe, et bouchée par en haut avec de la ouate fine et stérilisée : on chauffe la pipette au chalumeau pour la flamber et

détruire les germes. Pour s'en servir, on casse L'extrémité effilée, on la plonge dans le liquide (abcès au moment de son ouverture, bulle d'érysipèle, etc.), et l'on aspire par l'autre extrémité : l'étranglement du col tordu empêche le liquide de dépasser ce niveau, ce qui est important, surtout quand on aspire avec la bouche. On ferme alorsl'effilure àlalampc. Laforme de ces pipettes peut être variée suivant les besoins, et en prenant toujours les mêmes précautions pour éviter toute erreur.

Préparations. — Ces précautions et surtout la plus grande propreté sont ici nécessaires, car l'air, l'eau, la poussière, les mains et les instruments peuvent introduire des microbes étrangers. Les instruments doivent être lavés dans l'alcool pur, ou mieux flambés à 150 ou 200 degrés.

Pour les liquides (pus, mucus, etc.), on prend de préférence, non la couche superficielle, mais celle en rapport avec les tissus, et on les étale sur une lamelle mince à l'aide d'un fil de platine porté au rouge et refroidi .

Pour les tissus, on en détache une partie avec un couteau chauffé au rouge : on le met dans le microtome à congélation de Jung pour en faire des coupes, on le durcit dans l'alcool ou dans le même liquide additionné de bichromate de potasse. On fait des coupes aussi grandes que possible et on les transporte immédiatement dans une capsule remplie d'alcool, où elles se déplissent d'elles-mêmes. L'aiguille de verre ou de platine, les spatules de nickel ou de platine servent à étendre et déplisser ces coupes.

Coloration des préparations. — Les couleurs d'aniline ont la propriété de teindre les bactéries beaucoup plus

vivement que les tissus qui les entourent, souvent même sans les tuer ni altérer leurs mouvements. On a tiré parti de cette propriété, et la coloration des préparations est pratiquée actuellement sur une large échelle.

Le violet de mêthyle ou de fuchsine, en solution aqueuse, sert à colorer les bactéries à l'état frais, dans une goutte de liquide, entre deux lames de verre. Une petite goutte du liquide colorant se diffuse lentement dans la préparation et teint les bactéries, au fur et à mesure, sans colorer sensiblement le liquide qui les entoure. Le bacille virgule du choléra ainsi traité conserve encore ses mouvements au bout de 24 heures, et continue à se développer si l'on chauffe la platine du microscope à 25 degrés.

Dans les coupes durcies ou desséchées dans l'alcool, les bactéries ne sont plus vivantes, mais on les colore au moyen des réactifs suivants :

Le carmin borate de Grenacher, Xhématoxyline, la solution d'iode ioduré, servent tour à tour suivant l'espèce de microbe à colorer (Micrococcus, flagellum des bactéries, Bacillus amylobacter et moisissures, etc.)

Les couleurs d'aniline, à base alcaline ou acide, sont très nombreuses et très variées : violet de mêthyle et de gentiane dans l'huile d'aniline, ou en solution aqueuse, rosine, safranine, brun de Bismarck, purpurine, etc.

On recherche souvent une double coloration des coupes, les tissus par exemple étant teints en rouge et les bactéries en violet, ou réciproquement. Le picrocarminate d' ammoniaqxie donne cet effet par le procédé suivant : après avoir coloré au violet de mêthyle, on trempe une minute la préparation dans la solution iodée, on lave dans l'eau ou l'alcool faible, puis on trempe

quelques minutes dans le picrôcarminate, on éclaircit en lavant à l'alcool pur et à l'essence de girofle, puis on monte dans le baume. Les noyaux des cellules sont rouge carmin et les bactéries violettes : le reste de la préparation est beaucoup plus pâle.

Méthode d'Ehrlich. — Cette méthode, dont nous avons parlé, à propos du bacille de la tuberculose, consiste à traiter les coupes ou les prépai'ations sur lamelles par la solution de violet de méthyle dans l'huile d'aniline, puis à décolorer rapidement dans de l'acide nitrique au tiers. Les bactéries seules restent violettes.

Signalons encore la fuchsine, le bleu de méthylène, la coccininc, la vesuvine, etc., qui sont employés dans divers procédés de coloration des bactéries.

Mensuration, dessin et photographie. — On mesure les bactéries en les comparant aux divisions du micro-millimètre objectif mis sur la platine du microscope à la place de la préparation. — Les microbes se dessinent assez facilement à la chambre claire, surtout avec un peu d'habitude, leurs formes étant simples et peu compliquées. — Mais la photographie donne, comme on le conçoit facilement, des résultats bien supérieurs. La plaque photographique, en effet, est plus sensible que l'œil, et fait souvent voir des détails qui ont échappé à celui-ci. Malgré les difficultés de ce genre de microphotographie, Koch a donné de bonnes figures des bactéries pathogènes dans son livre intitulé : lieitrâge zur Biologie clcr Pflanzen, 2e vol. (1877).

Méthodes de culture des microbes. — On peut étudier le développement des microbes en plaçant une goutte du liquide à examiner dans la chambre humide de Ran* vier formée d'un verre porte-objet avec une rainure

circulaire et un plateau au centre : on recouvre d'une lamelle que l'on borde de paraffine ou do vaseline pour fermer le tout. La rainure renferme de l'air et un]peu

Fig. 103. — Différentes formes de ballons de cultures employés par M. Pasteur. (Figures empruntées à Duclaux).

de liquide. La platine du microscope est maintenue à la température voulue.

Pour faire des cultures en grande masse, on se sert d'autres appareils et de liquides nutritifs stérilisés, dans

lesquels on introduit le liquide supposé contenir des microbes au moyen d'un fil de platine chaude au rouge, puis refroidi; on y trempe son extrémité, et ou l'introduit rapidement dans le milieu de culture en se tenant dans l'atmosphère de la flamme d'une lampe à alcool. Puis on ferme le vase avec un tampon de ouate.

Les liquides de culture employés par Pasteur sont l'eau

Fig. 104. — Fourneau à, gaz pour flamber Fig. 105. — Tubes à et stériliser les ballons. culture de Pasteur.

de levure de bière, l'infusion de foin, l'urine bouillie et neutralisée, les bouillons de diverses viandes. Les vases ont tous des formes qui ne sont que des modifications de celle que nous avons déjà indiquée (fig-. 76). Ces vases sont flambés dans un fourneau à gaz en tôle (fig. 104) dont la double boîte est chauffée directement par la flamme du gaz et contient un panier en fil de fer qui reçoit les ballons, tubes, etc., à stériliser. La température, indiquée par un thermomètre, atteint 150 à 250 degrés. Le liquide nutritif bouillant à l'air libre dans une cap-

DANS LES LABORATOIRES. 2oa

suie de porcelaine est introduit en cassant Teinture du ballon que l'on plonge immédiatement dans le bouillon en aspirant par le tube opposé ; puis on ferme à la lampe.

Les tubes à double réservoir et à double effilure(fig. \ 05 et 106) sont employés en grand nombre dans le labora-

Fig. 106. — Chevalet portant des tubes de cultures.

toire de M. Pasteur. On les range à cheval sur le montant d'une planchette comme le montre la ligure.

On s'assure que ces tubes contiennent un liquide réellement stérilisé en les laissant pendant plusieurs jours en observation dans une étuve spéciale à 35 degrés.

Outre les liquides de culture déjà indiqués, on en compose beaucoup d'autres avec des solutions variées de phosphates de chaux et de potasse, des solutions albumineuses, etc.

2ii« RECHERCHE ET CULTURE DES MICRO HE S

Substances nutritives soudes. — Pour arriver à isoler les différentes espèces de bactéries et obtenir des cultures pures, on préfère aujourd'hui les substances solides : œufs, tranches de pommes de terre et de carottes, mais surtout la gélatine, l'agar-agar1 mêlés avec des peptones, le sérum de sang de bœuf gélatinisô, toutes substances dont la transparence permet d'étudier facilement les cultures dans les tubes de verre. M. Koch, dans son laboratoire de Berlin, se sert presque exclusivement de ces milieux solides, que l'on stérilise à l'avance en usant toujours des mêmes précautions.

Pour obtenir des cultures pures, on laisse croître d'abord toute espèce de germes; puis on prend une très petite parcelle du milieu de culture et on le transporte dans un autre milieu stérilisé, où il naît naturellement un moins grand nombre de microbes. En répétant plusieui'S fois cette transplantation, on arrive presque toujours assez rapidement à avoir des cultures suffisammentpures.

Koch emploie une méthode plus sûre. Il ensemence des lames de verre recouvertes de gélatine stérilisée et chauffée à 30 degrés, au moyen d'un petit fil de platine chauffé au rouge, puis refroidi et chargé d'une particule très petite de matière remplie de bactéries. Les colonies des divers microbes s'isolent d'elles-mêmes et se voient nettement à la loupe, sur la lame de verre, où elles se présentent avec des caractères et une étendue variables qui permettent souvent de les distinguer, quand on en a l'habitude, par le seul aspect (fig. 87, l5 On inocule alors, avec le microbe que l'on veut étudier, des éprou-

i'. "L'agar-agar ou gélose, qui nous vient du Japon tout préparé, se retire, parait-il, d'une espèce d'algue marine.

vettes ayant la formé de colle que nous avons figurée pag-o 110 (fig. 82 et fig. 105), contenant de la gélatine stérilisée, et Ton ferme en prenant les précautions ordinaires.

Les filtres dont on se sert pour stériliser les liquides sont en porcelaine de Sèvres, dégourdie à 1200 degrés, ou en faïence non vernissée. Tel est le filtre-bougie de Chamberland, que nous avons précédemment décrit et figuré.

Cultures pour l'expérimentation sur les animaux. — Elles sont faites suivant les procédés que nous venons d'indiquer : ici encore on devra éviter toutes les causes d'erreur provenant du manque de propreté ou de l'impureté des liquides de cultures, et bien s'assurer que l'effet produit sur l'animal n'est pas dû à un autre microbe que celui à expérimenter ou à toute autre substance irritante et septique. On répétera plusieurs fois l'expérience en prenant le sang de l'animal inoculé et en faisant une culture pure à l'aide de laquelle on devra reproduire la même maladie sur d'autres animaux.

Atténuation des microbes pathogènes. — Ces cultures successives ont établi, comme nous l'avons vu, la possibilité de l'atténuation des virus et de leur transformation en vaccin.

Les procédés employés pour arriver à ce but sont compliqués et variés suivant l'espèce de bactérie à laquelle on a affaire.

Ainsi, pour le choléra des poules, Pasteur a vu que les cultures datant de 15 jours, 1 mois, 2 mois, 8 mois, 10 mois, perdaient progressivement leur virulence, et il croit que cette atténuation est due à l'action de l'oxygène de l'air. De même, dans une épidémie, Koch suppose

trouessart. — Microbes. 17

quo Faction de l'air et la dessiccation des germes amène au bout d'un certain temps l'extinction naturelle de la maladie.

Toussaint et Chauveau atténuent le virus charbonneux, comme nous l'avons vu, en le soumettant à une température do 42 ou 43 degrés.

Pasteur et Thuillier ont atténué le microbe du rouget du porc, en le faisant passer par l'organisme du lapin ; Pasteur, le virus de la rage (dont le microbe est encore inconnu), en le faisant passer successivement par le cerveau d'un lapin et d'un singe, etc.

Enfin, on peut obtenir un résultat semblable en mélangeant aux liquides de culture différentes substances antiseptiques qui affaiblissent l'action virulente du microbe.

Vaccination et inoculation. — Le virus atténué ou vaccin ainsi obtenu, il ne reste plus qu'à l'inoculer à la dose que l'expérience indique comme nécessaire et suffisante, et qui varie suivant l'espèce, ainsi que le procédé employé. Pour vacciner les moutons contre le charbon, un aide tient l'animal par les pattes antérieures, assis et présentant le ventre à l'opérateur qui enfonce la canule de la seringue de Pravaz, contenant l'injection, à la base de la cuisse qui est dépourvue de poils. Chez les bœufs, c'est à la base de la queue que l'opération se fait. Elle a lieu en deux fois: la première fois avec un vaccin faible, huit jours après avec un vaccin fort.

Chez l'homme, tout le monde connaît le procédé employé pour vacciner contre la variole au moyen du vaccin d'enfant ou de génisse. On se sert d'une lancette ou d'une aiguille cannelée, portant une goutte de vaccin et on fait de 4 à 6 piqûres aux bras ou aux cuisses.

DANS LES LABO RATOIHES.

Il ne faudrait pas croire que la vaccinalion puisse devenir une méthode absolument générale de préservation contre toutes les maladies. Ainsi dans l'érysipèle, la pneumonie, la blennorrhagie, on sait qu'une première atteinte de la maladie, loin de préserver d'une attaque ultérieure, crée un terrain favorable pour les récidives. Par conséquent, on peut dire a priori que la vaccination ferait plus de mal que de bien (Cornil). Il en est de même de la fièvre intermittente, de la tuberculose, de la syphilis, etc., toutes maladies dont le même individu peut être atteint plusieurs fois et à des intervalles de temps très variables, preuve évidente que la première atteinte n'a pas créé une immunité contre les atteintes ultérieures.

Immunité. — On appelle ainsi la propriété qu'acquiert l'organisme d'être à l'abri de telle ou telle maladie à microbes, par suite d'une première atteinte, ou d'une accoutumance résultant sans doute de l'absorption, par petites doses répétées, du poison pathogène. L'acclimatement constitue souvent l'immunité : ainsi dans les pays à malaria, à fièvre jaune, etc., les habitants du pays contractent la maladie bien plus rarement que les étrangers. L'immunité n'est pas absolue; elle se perd à la longue. C'est ce qu'on a constaté pour la variole ; aussi est-il prudent de se faire revacciner tous les dix ou douze ans.