INFUSIONS VÉGÉTALES

des végétaux inférieurs ; il convient, d'après l'auteur, particulièrement à Y aspergillus niger :

Eau 1.500 gr.

Sucre candi 70 —

Acide tartrique 4 —

Nitrate d'ammoniaque 4 —

Phosphate d'ammoniaque 0,6

Carbonate de potasse 0,6

Carbonate de magnésie 0,4

Sulfate d'ammoniaque 0,25

Sulfate de zinc 0,07

Sulfate de fer 0,07

Silicate de potasse 0,07

Les solutions minérales trouvent assez fréquemment leur emploi, lorsqu'il s'agit d'isoler une espèce ; mais il faut avouer que, dans la plupart des cas, il vaut mieux avoir recours aux infusions organiques, ou, tout au moins, les combiner avec ces dernières.

Infusions végétales. — L'usage de ces solutions se prête mieux à des applications multiples que les milieux purement minéraux; on peut les confectionner avec les végétaux.

On peut aussi les fabriquer avec les substances les plus diverses (décoction de fruits, de plantes, moût de bière). Tyndall a multiplié à l'infini le nombre de ces infusions végétales (infusion de choux^ navets, poireaux, pruneaux, carottes, etc.). Mais l'infusion végétale la plus répandue est le bouillon de foin. On l'obtient en coupant du foin

Trillat. Produits chimiques. 3

sec en petits fragments, qu'on place dans un vase métallique, puis on verse dessus une quantité d'eau bouillante suffisante pour le couvrir et le baigner largement (1).

Les bouillons par excellence sont les liquides animaux naturels ou artificiels.

Leur base est ordinairement constituée par des décoctions de chair musculaire dégraissée, additionnées souvent de substances gélatineuses ou peptonisées, et placées dans un état d'acidité ou d'alcalinité variant avec les cas particuliers.

Voici le mode de préparation des principaux bouillons employés :

Bouillon de Miquel.

Pendant cinq heures, on maintient à l'ébulliliou un kilogramme de chair musculaire maigre de bœuf, dans 4 litres d'eau. On écume le bouillon pendant toute la durée de l'ébullition. Une fois l'opération terminée, on laisse reposer, dans un endroit frais, jusqu'au lendemain ; on dégraisse très soigneusement et on neutralise à la soude caustique. Ensuite, on le fait de nouveau bouillir

(1) Dubief, Manuel de bactériologie. — Voyez aussi Macé, Traité de bactériologie, 2e édition. Paris, 1892.

pendant dix minutes, on filtre et on ramène au volume de 4 litres.

Pour le conserver, on le distribue dans des ballons d'un demi-liire, qu'on scelle à la lampe, et qu'on maintient pendant deux heures à 110o, pour le stériliser complètement. Le liquide est alors coloré en jaune foncé, mais reste limpide et ne fournit jamais de dépôt : s'il vient à se troubler, cela est diï à un mauvais dégraissage, ou à ce que la liqueur a été insuffisamment bouillie après la neutralisation. Ce bouillon, à 20°, possède une densité de 1.003 ; en y ajouiant 10 grammes de sel marin par litre, on obtient un bouillon, de densité 1,009, très sensible aux germes de l'atmosphère.

Bouillon de Liebig.

On prend 50 grammes d'extrait de viande commercial, connue sous le nom ftextractum carras Liebig, et on le dissout dans un lilre d'eau. La dissolution effectuée, on neutralise à chaud par la soude caustique, on fait bouillir, on filtre ; à ce moment, le bouillon doit être parfaitement neutre. Sous l'action de la lumière, ce liquide, pourvu après sa préparation d'une belle couleur rouge ambrée, se décolore et acquiert à la longue une teinte jaune pâle. Ainsi obtenu, le bouillon Liebig possède à 18°, une densité égale à 1,024.

Bouillons divers.

On peut préparer des bouillons nutritifs avec des viandes diverses (veau, poulet, volailles). Il faut avoir soin d'enlever toute parcelle graisseuse et aponévrotique ; ces bouillons se préparent mieux avec la viande pulpée. Pour la volaille, on met les animaux entiers, débarrassés de leurs organes viscéraux. On emploie une quantité d'eau telle que le bouillon représente à peu près le poids de viande employée.

On fait bouillir pendant un temps variable suivant le poids de viande (jamais moins de deux heures). On laisse reposer au frais, on filtre, on neutralise avec le carbonate de soude; on sale avec 1 ou 2 0/0 de chlorure de sodium, Il est bon par précaution et pour avoir des bouillons bien limpides de faire bouillir et de filtrer une seconde fois après refroidissement.il ne reste plus ensuite qu'à stériliser. (Voir p. 76.)

Bouillon de Fol.

Cet auteur emploie les mêmes décoctions de viande, mais recommande, pour obtenir une plus grande limpidité, de les chauffer pendant une heure à 110° dans un autoclave et de les filtrer ensuite.

Bouillon de Loëffler.

On fait macérer au frais pendant vingt-quatre

heures, dans un litre d'eau, 500 grammes de viande de bœuf réduite en pulpe après avoir été soigneusement dégraissée et débarrassée du tissus conjonctif. Au bout de ce temps, on exprime le tout à la presse, on ajoute de l'eau pour refaire un litre ; et on additionne le liquide de 10 grammes de peptone sèche, S grammes de sel marin et, si Ton veut, de quelques grammes de glucose. Onalcalinise ensuite légèrement au carbonate de soude. Pour clarifier le liquide, on le chauffe dans un autoclave pendant deux heures, on laisse reposer vingt-quatre heures, on décante le liquide clair qu'on filtre une dernière fois après s'être assuré qu'il est toujours alcalin.

Parmi les bouillons que nous venons d'énumérer le bouillon de Miquel et celui de Loëfflersont ceux qui donnent les meilleurs résultats ; entre les décoctions ordinaires de viande et le bouillon Miquel, il n'y a en somme qu'une différence de densité ; ce dernier d'une densité de 1 ,009 est surtout propre au rajeunissement des germes atmosphériques. Quant au bouillon de Liebig, c'est de toutes les préparations la moins recommandable.

Liquides organiques naturels.

Ces milieux de cultures sont éminemment favorables à. la vie des bactéries pathogènes, puisqu'ils se rapprochent des milieux où vivent normalement ces micro-organismes. Les plus employés sont

l'urine, le lait, l'humeur aqueuse de l'œil, le sérum . Ce dernier peut être retiré directement du liquide sanguin, mais on emploie avec avantage le liquide de l'hydrocèle, celui de la pleurésie ou de l'ascite ; ces derniers surtout sont faciles à se procurer en abondance.

CONFECTION DES MILIEUX DE CULTURE (1) Gélatine peptonisée.

La gélatine peptonisée est l'un des milieux de culture les plus usités pour les méthodes en milieux solides, surtout pour cultures en tubes et cultures sur plaques. Sa fabrication repose sur le fait de la gélatinisation, c'est-à-dire de la transformation en gelée transparente des différents bouillons usités dans les méthodes de Pasteur.

Tous les bouillons dont nous avons donné la préparation peuvent servir de base ou de véhicule à la gélatine peptonisée; on peut, par exemple, se servir d'urine neutralisée et stérilisée ou d'extrait de viande Liebig.

Biichner a proposé la composition suivante :

Eau 1 litre

Gélatine pure 100 gr.

Extrait Liebig 5 -r-

Peptone sèche 5 —

Sucre de canne 2 —

Phosphate basique 5 -

(4) Dubief, Manuel de bactériologie.

Mais parmi tous ces bouillons, ceux auxquels on devra, sans contredit, donner la préférence, sont les bouillons naturels, c'est-à-dire fabriqués avec la viande nature. On peut employer soit le bouillon de viande de Miquel, soit le macéré de viande Loëffler. Une fois que ces liquides ont été convenablement préparés, on procède à leur gélatinisationet à la confection définitive du milieu nutritif.

On prend un litre du bouillon qu'on a choisi et on y ajoute :

Peptone sèche pure ." . . . 10 gr.

Sel marin ordinaire 5 —

D'autre part, dans un vase bien propre (ballon, capsule de porcelaine), on a placé 100 grammes de gélatine bien pure et bien blanche qu'on a au préalable grossièrement concassée en petits fragments; on recouvre cette gélatine avec de l'eau stérilisée, de façon à ce qu'elle soit seulement recouverte par le liquide.

Au bout de 20 à 30 minutes, la gélatine est imbibée parle liquide et a subi un ramollissement très notable. Alors on fait écouler soigneusement tout l'excès de l'eau, et, après avoir bien fait égoutter, on verse sur la gélatine le bouillon peptonisé et salé. On place le tout au bain-marie et on fait dissoudre à une douce chaleur, en agitant constamment le liquide et en prenant soin que la température ne s'élève pas au delà de 40 à 45 degrés, car une

température exces'sive finit par modifier la gélatine au point qu'elle peut ne plus se coaguler par le refroidissement. Ainsi préparée, la gélatine-peptone a ordinairement une réaction franchement acide peu favorable à la culture de la plupart des bactéries; aussi faut-il la neutraliser et même pour certains cas l'alcaliniser. Pour cela ,on se sert d'une solution saturée de carbonate de soude qu'on ajoute goutte à goutte, en ayant soin à chaque instant de vérifier la réaction au moyen d'un papier de tournesol, et on continue j usqu'à ce qu'on provoque une tache faiblement bleue. Si l'on avait ajouté trop de liqueur alcaline, il faudrait neutraliser dans l'autre sens avec un peu d'acide lactique.

A ce moment, le bouillon gélatinisé n'est ordinairement pas transparent et il contient encore des substances qui pourraient se précipiter ou se coaguler au moment de la stérilisation ; il faut alors le soumettre à un chauffage prolongé, jusqu'à ce que les précipités soient complètement formés. Pour cela, on se sert d'un bain-marie à 100° centigrade où on laisse la gélatine-peptone pendant une heure. Une fois la précipitation terminée, il faut filtrer le bouillon. En raison de la coagulabilité du milieu nutritif, cette opération est assez difficile et doit être faite à chaud; l'expérience doit être disposée de telle sorte que le liquide ne puisse se refroidir pendant toute la durée de la filtration, généralement assez longue.

Pour obtenir ce résultat, les auteurs et les constructeurs ont imaginé un certain nombre de procédés et d'appareils ordinairement fort simples : c'est ainsi qu'on peut se contenter d'un ballon qui supporte dans son col un entonnoir ordinaire en verre portant un filtre à plis en papier, le tout étant placé

Fig. 14. — Entonnoir pour filtrer à chaud.

dans le poêle à vapeur. Nous avons insisté plus haut sur les inconvénients d'un chauffage prolongé de la gélatine, qui lui fait perdre sa propriété de se coaguler à froid, aussi devra- t-on veiller de toute façon à ce que la température s'élève simple-

70 VALEUR D'UN PROnïTIT MÉDICINAL

ment de quelques degrés au-dessus du point nécessaire à la fluidification de la gélatine. Il est préférable de ne pas employer le stérilisateur à vapeur et de se servir des appareils spéciaux pour la filtration à chaud, appareils dans 'lesquels on peut très facilement modérer et régler la température.

Le plus simple et le moins coûteux de ces appareils est celui fabriqué par Wiesnegg ; il se compose (fig. 14) d'un entonnoir en cuivre ou en ferblanc, dans lequel on peut adapter un entonnoir en verre qui contient la substance à filtrer ; l'espace formé par la double paroi entre les deux entonnoirs contient de l'eau que l'on peut chauffer au moyen d'un prolongement latéral en forme de tube qui supporte aussi un entonnoir destiné à remplacer l'eau qui s'évapore.

Il faut toujours munir l'extrémité de l'entonnoir d'une pince de Mohr ou d'un robinet et d'un tube de verre assez long si l'on veut transvaser directement la gélatine dans les tubes à essai.

, L'appareil représenté (fig. \ 5) est plus compliqué: le chauffage se fait par la couronne^ où la température se maintient dans l'entonnoir c par la circulation d'eau chaude qui exige l'emploi d'un bainmarie spécial en communication avec le tube h et le robinets. La gélatine claire tombe dans le réservoir d et peut être facilement répartie dans le vase à laide du tube qui commande la pince à pression /.

La gelée filtrée devra prendre une transparence parfaite à froid et Ton devra, si cette transparence n'est pas obtenue, recourir à plusieurs filtrations successives.

Souvent la gélatine chaude est trouble, grâce à

Fig. 45. — Appareil à filtration à chaud,

la présence de phosphates que la chaleur précipite et qui se redissolvent complètement par le refroidissement.

Agar-agar ou gélose.

Les cultures sur la gélatine présentent l'inconvé-

nient assez sérieux de ne pouvoir se faire qu'à la température ambiante, car à 25° centigrade les milieux gélatinisés se liquéfient et se transforment en bouillons, perdant tous les avantages des cultures sur milieu solides. On a comblé cette lacune par l'emploi de Yagar-agar, dont l'introduction en bactériologie est due au Dr Hesse.

L'agar-agar se trouve dans le commerce sous forme de plaques membraneuses ou écailleuses ; ces plaques ne sont autres qu'une substance mucilagineuse extraite de quelques espèces d'alguesmarines communes sur les côtes du Japon et dont les principales portent les dénominations botaniques de Gracilaria lichenoïdes et Gigartina speciosa. Cette substance mucilagineuse ou d'autres analogues existent d'ailleurs dans la plupart des alguesmarines, mais l'agar-agar provient surtout des espèces que nous avons désignées.

La préparation des gelées nutritives à l'agaragar est identique à celle des gelées à la gélatine ; elle ne diffère que par les proportions et quelques détails pratiques.

L'agar-agar doitêtre découpéparpetitsmorceaux ou être employé en poudre.

On commence par faire tremper l'agar-agar dans l'eau simple, ou mieux dans l'eau salée, pendant toute une nuit pour faciliter sa dissolution ultérieure ; puis, après l'avoir bien égoutté, on l'ajoute dans un bouillon convenablement choisi (ceux que

Ton emploie pour la gélatine peptone sont également utilisables ici).

Tandis qu'il faut 10 0/0 de gélatine pour gélatiniser un bouillon de culture, on ne doit employer que des proportions beaucoup plus minimes d'agar-agar; les proportions convenables sont de 1 à 2 0/0 et on peut employer la formule suivante :

Bouillon neutralisé 1 litre

Agar-agar 10 à 20 gr.

Peptone sèche 10 —

Sel niariu. 5 —

On commence par ajouter le sel et la peptone au bouillon, puis on met l'agar-agar, qu'il faut alors faire dissoudre. Cette dissolution est beaucoup plus longue et beaucoup plus laborieuse que celle de la gélatine, et elle n'est généralement complète que par une ébulition prolongée à feu nu pendant quatre ou cinq heures, en ayant soin de remplacer le liquide évaporé avec de l'eau stérilisée , de façon à conserver toujours le volume d'un litre. La dissolution de F agar-agar se fait beaucoup plus rapidement dans l'autoclave à 110°.

Ordinairement, la dissolution ainsi obtenue est neutre ; on peut l'employer telle quelle ou l'alcaliniser avec une solution de carbonate de soude saturée.

Le filtrage des gelées à base d'agar-agar est long et difficile, il est cependant indispensable.

Il est rare, malgré tout le soin qu'on peut y

mettre,, qu'on obtienne des gelées tout à fait claires et transparentes, mais en prenant les précautions suivantes, on peut cependant arriver à un résultat satisfaisant.

On commence par faire une première filtration avec un cône de feutre, ou en garnissant avec de la ouate la moitié inférieure de l'entonnoir, puis on filtre une seconde fois à travers un double filtre en papier placé dans un entonnoir dont le fond est garni de coton de verre.

Il est encore un procédé plus commode, quoique moins productif, puisqu'on est obligé de sacrifier une partie du produit ; il consiste à verser la gelée liquide dans de longues éprouvettes de verre qu'on abandonne ensuite à un refroidissement progressif. Après une nuit entière, la gelée est solidifiée, et en frappant sur les parois on parvient à la faire sortir sous forme de boudins, dont on tranche facilement la partie qui n'est pas suffisamment transparente.

Sérum gélatinisé.

Le sérum du sang est particulièrement apte à servir de milieu de culture pour certaines espèces bactériennes, principalement pour celles qui sont parasitaires; le sérum liquide est peu employé, on se sert surtout du sérum dit gélatinisé, préparé par la méthode de Koch.