DEUXIÈME PARTIE MÉTHODES ET TECHNIQUES

Avant d'exposer les résultats de recherches expérimentales, il faut toujours dire par quelles techniques ces résultats furent obtenus. Rappelons-nous que les techniques défectueuses font les résultats erronés. Or, les techniques à employer dans l'étude expérimentale des Dermatophytes sont trop diverses et trop nombreuses pour qu'on puisse toutes les exposer en détail. Ces parasites provoquent des maladies cutanées chez l'homme et chez l'animal, leur étude demande un médecin qui soit clermatologiste et qui devrait avoir des connaissances vétérinaires.

Ces parasites se cultivent sur milieux artificiels ce qui impose à l'observateur la connaissance des techniques de culture bactériologique. Ce sont des parasites végétaux de structure assez compliquée, dont l'étude voudrait un mycologue. Les modifications chimiques qu'ils déterminent au sein de leur milieu de culture demanderait un chimiste, etc....

Pour ces raisons il n'y a pas lieu de s'étonner qu'on ait vu, en ces matières, des médecins parler mal de mycologie, des vétérinaires manquer des notions de dermatologie élémentaire, des mycologues vouloir faire œuvre de clinicien.... Erreurs de mots, erreurs d'observations, erreurs de méthode.... Il est bien difficile de faire une œuvre parfaite en des sujets si complexes. Parmi toutes les techniques qu'il faudrait décrire, on parlera seulement ici de celles qui doivent être utilisées le plus fréquemment, de celles qui sont le plus nécessaires à connaître et qui permettent d'éviter les plus grosses erreurs. En note on indiquera les erreurs auxquelles ont conduit l'omission des techniques essentielles.

A. Dossier clinique de chaque cas soumis à l'étude. — Il est

indispensable, lorsqu'un cas de dermatophytie doit être étudié, que

l'observateur commence par rédiger sur ce cas une note clinique, décrivant minutieusement les lésions, leur aspect, leurs détails, leur âge, leur nombre, leur évolution, leur origine si elle est connue, et leur séquelle, s'ils en ont eu.

Mais, en outre, une habitude très nécessaire, est de résumer cette fiche individuelle sur une très grande étiquette, et cette étiquette sera collée sur le bocal contenant les cultures en tubes qui seront faites de ce cas. Ainsi chaque fois qu'on examinera les cultures, cette étiquette, plus vite et plus souvent consultée qu'un registre, permettra de se rappeler de suite les particularités de la plaque de teigne tondante, ou du cheveu malade qui a produit ces cultures.

En outre, chaque cas se trouve ainsi représenté par un bocal étiqueté qui n'a aucune chance d'être égaré, ou confondu, et qui contient toutes les cultures en tubes d'un môme cas.

D'ailleurs, chacun des tubes qu'il contient est étiqueté, lui aussi, et son étiquette porte le nom du malade, un signe conventionnel indiquant la nature du milieu nutritif et la date de l'ensemencement.

B. Réserves de cheveux ou de squames. — Lorsqu'une lésion est décrite, on prélève, sur elle, les poils, squames ou cheveux qui serviront aux ensemencements et aux examens microscopiques. Pour cela, on opère les prélèvements avec une pince flambée, mais sans aucune stérilisation préalable de la surface des lésions. L'expérience prouve que cette stérilisation est inutile, car la lésion peut fournir sans cela une quantité de cultures pures d'emblée, et lorsqu'on l'a frictionnée, môme avec des liquides antiseptiques, on l'a généralement salie avec les impuretés du voisinage.

On recueille donc une grande quantité de matériaux d'étude, et on les dépose entre deux lames porte-objet, flambées et refroidies, qu'on roulera ensuite clans une feuille de papier pour les conserver aussi longtemps qu'on voudra. L'expérience montre l'excellence de ce procédé. Après des mois, on peut retrouver, entre ces lames, les éléments de nouvelles cultures, qui seront aussi pures qu'au premier jour. Sur le papier qui enveloppe ces lames, on recopie le nom du sujet et la fiche succincte que porte le bocal contenant les cultures du même cas. On aura soin de faire ces provisions assez copieuses pour que, si le cas se trouve très intéressant, on puisse y puiser à plusieurs reprises pour tout examen.

C. Épilation de cheveux entiers. — Fox et Blaxall ont insisté à juste titre (l) sur ce fait qu'il est utile d'épiler des cheveux malades entiers. Cela n'est pas toujours possible, en dépit de toutes précau-

(') Loc. cil. et clans : Some remarks on rin^worm. British médical journal, 2 déc. 4899.

tions; mais si Ton ne peut avoir le cheveu entier, il est utile d'en avoir des fragments le plus longs possibles. Car ils permettent d'étudier bien plus exactement la structure et la disposition du parasite qu'ils contiennent.

D. Examen extemporané. — Presque toujours on doit pratiquer l'examen extemporané des éléments parasitaires après dissociation et éclaircissement de l'épiderme et du cheveu par l'immersion à chaud pendant quelques secondes, dans une solution de potasse caustique (50 grammes de potasse pour 70 grammes d'eau).

Ce procédé a été très attaqué à l'étranger, surtout en Angleterre, où l'on tendait à lui substituer, comme moins brutal, le chauffage dans une solution de potasse à 7 pour 100 (Adamson, C. Fox, Blaxall, Malcolm Morris (').

En réalité chaque auteur trouve très justement préférable les techniques dont il se sert d'ordinaire, parce qu'il sait mieux comment s'en servir; le tout est d'en avoir acquis l'usage (2).

Une technique dont nous avons beaucoup usé, avant ou sans coloration, pour éclaircir le cheveu, est le chauffage de la squame ou du cheveu dans l'acide formique (Berdal) (3). Ce procédé a sur le précédent un gros avantage : au lieu de rendre le cheveu friable en l'éclaircissant, il lui garde sa résistance à la rupture et à l'écrasement.

E. Préparations permanentes. — L'étude des mycoses externes exige une collection de préparations permanentes. Il est curieux de

(') Malcolm Morris trouve que non seulement la solution de potasse à 30 0/0 ne donne pas de résultats satisfaisants, mais positivement mauvais (misleadings). The ringworm in the Light of the récent researches. London, 1898, p. 40.

(2) C. Fox et F. R. Blaxall. An inquiry into the pluralitry of fungi causing ringworm in huraan beings. British Journal of Dermatology. Vol. 8, nos 93-90, préconisent un long séjour des cheveux à examiner, dans une liqueur de potasse à 7 pour 100, et il trouve que cela est préférable à un rapide chauffage dans un liquide à 40 pour 100. Adamson (1895) recommande de ne pas écraser le cheveu sous la lamelle, de ne pas monter dans la glycérine, de ne pas se servir de solutions potassiques fortes, d'examiner sous le microscope le parasite pendant que la solution de potasse l'éclaircit; d'épiler le cheveu lentement, doucement, clans sa direction, de le laver dans l'éther avant de le passer dans la liqueur potassique, ce qui n'est pas indispensable, dit-il. Il est à noter aussi que F. BALZER(Note sur l'histologie des Dermatophytes, Arch. de Physiol., n° 8, 1884). préconisait aussi le dégraissage du poil dans l'alcool-éther, le passage du poil dans une solution de potasse, variant de 10 à 40 pour 100, et son montage au baume. — Besnier et Doyon disaient que l'action de la solution caustique (pot. à 40 pour 100) doit être surveillée de près ; il faut qu'elle ne s'exerce que sur la matière colorante du cheveu et qu'elle n'amène pas la désagrégation complète de celui-ci. Il est difficile de dire d'une façon précise combien de temps le cheveu doit séjourner dans la solution; cela dépend de sa coloration, de son épaisseur, de la concentration du liquide; à chaud, l'action est plus rapide, mais aussi plus irrégulière. Notes de Kaposi, p. 764.

(3) E. Berdal. Annales de Dermatologie et de Syphiligraphie, 1892, p. 709.

constater ce l'ait qu'aucune collection de préparations permanentes concernant les teignes n'existait avant que je n'insiste dans les Trichophyties humaines sur leur nécessité. Les préparations permanentes, d'après'lesquellcs ont été faits tous les dessins de cet ouvrage, ont été obtenues par diverses méthodes. Tantôt le cheveu, traité par la potasse à 50 pour 100, est lavé à l'eau puis monté dans la glycérine, tantôt le cheveu est traité par l'acide formique et la préparation montée au baume. Chacun de ces procédés a ses inconvénients. Beaucoup de détails visibles dans la solution potassique disparaissent dans la glycérine. Mais tous les liquides conservateurs, par lesquels nous avons voulu remplacer la glycérine, ne nous ont pas paru valoir mieux qu'elle. D'un autre côté, le cheveu est moins bien éclairci par l'acide formique que par la potasse (').

F. Les préparations colorées. — Après l'action de la potasse, aucune coloration n'est bonne; la potasse mordance le cheveu, et ensuite les colorants les plus doux imprègnent le cheveu en masse. Voici la technique de coloration dont nous nous sommes constamment servis. La squame ou le cheveu sont dégraissés d'abord dans le chloroforme. Ils sont placés ensuite dans un verre de montre contenant de l'acide formique que l'on chauffe deux ou trois minutes jusqu'à ébullition. Après avoir bien lavé à l'eau distillée on colore pendant une minute dans un godet de bleu de Sahli (2). On lave, on déshydrate à l'alcool absolu, on passe au xylol et on monte au baume (3).

(4) Quel que soit le procédé qu'on emploie, la nécessité de préparations permanentes est absolue. Je citerais par centaines des erreurs dues à ce que les auteurs n'avaient pas à côté de leurs collections de cultures, leur bibliothèque de préparations correspondantes. Comment expliquer, sinon par ce manque de préparations, l'erreur de Ch. J. Wiiite classant la culture rose parmi les Microsporums, alors qu'il s'agit d'un Tricnophyton endo-ectothrix, type, à spore de 5 — 6 j*. (Rihgworm as it existe in Boston). Et l'erreur de Malcolm Morius niant que Pendo-ectothricité des Trichophytons soit un phénomène constant pour une espèce donnée (Ringworm in the Light of modem researches). Et la même erreur de Pelagatti (I trichophyton délia provincia di Parma, Giornale ital. délie malat. vener. e délia pelle, 1896 fasc. 6, p. 724) affirmant que le dispositif endo-ectothrix du parasite dans le cheveu est sans valeur pour la différenciation. Ce sont là des erreurs dont on pourra mesurer le degré, lorsqu'on verra, par exemple, la morphologie des Trichophytons microïdes ou faviformes. Les mêmes erreurs dues aux mêmes causes se relèvent dans le travail récent de Dalla Favera sur les Trich. de la province de Parme. Ann. de Dèrmat., 1909, p. 433.

(2) Bleu borate de Sailli.

Eau distillée 40 parties.

Solution aqueuse saturée de bleu méthylène. . . . 24 — Solution de borax à 5 pour 100 16 —

Mêler ensemble, laisser reposer un jour et filtrer.

(3) La plupart des procédés de coloration sont passibles de cette grave objection faite par Adamson « that it does not permit the relation of the fungus to the hair to be aceuratelv defined. - Il est bien à remarquer que ceux qui ont de

A mon avis on doit rejeter tontes les méthodes de coloration par les couleurs opaques telles que le violet d'aniline ; elles colorent en masse et dissimulent exactement les détails qu'elles devraient indiquer. On ne peut utiliser les méthodes de coloration, et avec les couleurs trans-

beaucoup le plus augmenté les notions que nous possédons sur la structure des Dermatophytes : Gruby, Adamson, Fox et Blaxall, ont préféré, comme moimême, les examiner sans coloration, après éclaircissement par la potasse.

H. G. Adamson in A note on ihe permanent staining of virigworm fungiis, 1895 Brilish Journ. of. dermat., n° 86, vol. VII, remarque que la difficulté est de décolorer le cheveu et l'épidémie corné sans décolorer le parasite. C'est donc la question du réducteur qu'il a fallu étudier. Boech, en 1885, avait préconisé dans ce but la résorcine.

Unna. Natùrliche Reinculture der Oberhautpilze. Monatsh f. prakt. Derm. Bd XVIII, n" 6, remplaça la résorcine par l'eau oxygénée additionnée de 5 p. 100 d'iode. Walsch se sert de la méthode de Gram, mais en additionnant l'huile d'aniline de 1 pour 100 d'acide chlorhydrique, ce qui augmente considérablement son pouvoir décolorant. Adamson regarde ce procédé comme excellent, mais il ajoute encore que rien de tout cela n'est comparable aux résultats de l'examen dans la solution potassique sans coloration.

Le procédé de coloration d'Adamson combine cet éclaircissement préalable du cheveu dans la solution potassique à l'immersion dans les bains colorants : Voici les divers temps de l'opération :

1° Eclaircir le cheveu par un bain de 10 à 50 minutes dans une solution de . potasse caustique 1,5-10 pour 100;

2° Laver dans l'eau alcoolisée à 15 pour 100, ce qui consolide le cheveu;

5° Sécher sur la lame, et s'il s'agit d'écaillés épidermiques, fixer en passant dans la flamme ;

4° Colorer dans le bain usuel de violet gentiane aniline 1/4 d'heure à 1 heure;

5° 1-5 minutes dans la solution de Gram;

6° Décolorer dans l'huile d'aniline 2 à 5 heures et davantage ;

7° Enlever l'huile au papier buvard et monter dans le baume de Canada.

Colhoux qui insiste (Transactions of the third international Congress of Dermatotogy, sur l'utilité des colorations, propose la méthode suivante :

Immerger pendant deux minutes le cheveu dans une mixture faite d'une solution alcoolique à 5 pour 100 de violet gentiane et d'eau d'aniline, dix de la première pour trente de la deuxième; éponger au buvard, traiter une à deux minutes par la solution iodo-iodurée de Gram, sécher de nouveau, traiter une fois par l'huile d'aniline iodée; eclaircir à l'huile d'aniline, laver au xylol, monter au Baume.

Malcolm Morris conseille, pour la photographie des Dermatophytes, d'user d'une autre méthode qui est la méthode de Walsch à peine modifiée, la voici :

Le cheveu d'abord lavé dans l'éther est placé dans une solution de violet gentiane, 5 pour 100, dans 70 pour 100 d'alcool. Le Microsporum Audouïni se teint vivement en cinq minutes. Les Trichophytons doivent rester une heure dans la solution et y être chauffés cinq minutes.

On peut teindre en rouge de la même façon en substituant une solution de 5 pour 100 de fuchsine, dans l'eau, avec un peu d'alcool, ou une solution à 2 pour 100 de fuchsine phéniquée. Le rouge est meilleur que le violet pour la photographie. Ensuite, le cheveu est passé dans l'iode pour fixer la couleur. Il est ensuite décoloré dans l'huile d'aniline ou dans un mélange de 2 à 4 gouttes d'acide nitrique dans l'aniline pendant dix à quinze minutes. Ensuite dans l'aniline pure et laissé quelques secondes, puis lavé au xylol et monté au baume.

Au même Congrès de Londres, M. Unna insista beaucoup sur la nécessité des colorations, et préconisa les méthodes qu'il avait données antérieurement.

Enfin Bodin préconise comme techniques de coloration (Les Champignons parasites): 1° le Gram; 2° la thionine phéniquée (formule de Nicolle); 5° la

parentes, telles que le bleu de Sahli, que pour préciser certains détails que l'examen sans coloration ne montre pas assez ; ainsi les subdivisions transversales des rubans mycéliens qui, sans coloration, ne paraissent souvent pas aussi nombreuses qu'elles le sont. En résumé les méthodes de coloration sont, dans ce sujet, des méthodes adjuvantes, non pas du tout des méthodes de tond. Toutes sont infidèles. Aucun colorant ne pénètre également et profondément un cheveu fermé (*). Lorsqu'on examine avec coloration et sans coloration les cheveux atteints des mêmes parasites, ils sont méconnaissables, leur tableau d'ensemble peut être tout différent. En général les préparations montrent les cheveux colorés, avec des détails plus précis, et dans l'ensemble, des figures bien plus incomplètes. On a préconisé les colorations spécialement pour faciliter la photographie microscopique, mais il est à remarquer que les meilleures micro-photographies qu'on a fourni des Dermatophytes, celles que Doyen et Rothier de Reims ont fait de mes préparations et celles que Fox et Blaxall ont donné des Microsporums ont précisément été faites sans coloration.

G. Mensuration des éléments parasitaires. — Les diverses méthodes de préparation microscopique des cheveux teigneux montrent combien la dimension des éléments parasitaires varie suivant les préparations qu'on leur fait subir. L'eau, et surtout l'eau potassique, gonflent les cellules cryptogamiques; l'acide formique, les colorants, l'alcool absolu, au contraire, les rétractent et les amoindrissent. Ce sont là des faits qui n'ont pas été mis en lumière jusqu'ici d'une façon suffisante, bien que Gruby les ait en parties signalés dès ses premiers travaux. Ceci montre combien il est difficile de mesurer les éléments parasitaires qu'on décrit, sans tenir compte des milieux dans lesquels on les a placés. Ainsi quand Fox et Blaxall affirment que, d'une variété à l'autre des Microsporums, la dimension des spores varie sensiblement, il est nécessaire de faire remarquer que ces faits sont plus difficiles, à vérifier qu'on pourrait d'abord ne le croire. Car la dimension des éléments parasitaires variera suivant les liquides employés, et même suivant le temps de leur emploi. Nos dessins seront de nature à faire la preuve de ces faits.

E. Les dessins. — A propos de nos figures, nous ferons remarquer

coloration au Kernschwartz pendant 24 heures; 4° la méthode proposée par Anglade et Morel pour la coloration de la névroglie. V. p. 99, note I.

(') •■ La coloration des endothrix est rendue plus difficile que celle des Microsporons, parce que l'enveloppe du cheveu des endothrix n'est pas déchirée. »

Fox et Blaxall. Some remarks on ringivorm, p. 7.

qu'on a jusqu'ici voulu se servir exclusivement de la photographie en ces sujets, alors qu'elle ne peut suffire à les éclairer. Après avoir usé delà photo-micrographie dans un précédent ouvrage, nous revenons aux dessins, comme on le verra: En examinant ceux-ci, on se rendra compte qu'ils montrent et prouvent des faits que la photographie ne saurait prouver. Toutes les figures de ce volume ont été relevées à la chambre claire par notre dessinateur M. Bessin, d'après des préparations permanentes que je garde en ma collection. Leur valeur artistique égale leur intérêt documentaire. Intentionnellement, tous ces dessins

ont été faits à un grossissement de —j- diamètres et réduits du 1/5 à la gravure ce qui donne à leur reproduction un grossissement constant de ^j— diamètres. L'uniformité des grossissements permettra de comparer les dimensions relatives des divers éléments des parasites représentés. Elle permettra aussi d'apprécier, ce que je disais tout à l'heure, les variations de dimension des mêmes cellules cryptogamiques suivant le mode de fixation, de préparation et de montage qu'on aura suivi.

Ces images permettront enfin d'apprécier combien le même parasite se modifie suivant le terrain sur lequel il évolue, et, par exemple, combien ses éléments diffèrent en forme et en dimensions sur l'Homme et sur le Cobaye. La constante identité des grossissements de ces dessins rendra ces différences saisissantes.

Pourtant, là où un fort grossissement est nécessaire nous avons fait

représenter certains détails à une dimension de — j — diamètres soit;

760 après réduction de 1-/5. Mais ces dessins seront alors, autant que possible, inclus dans un autre sous la forme de cartons.

Ces dessins montreront, je crois, par leur nouveauté, combien les documents iconographiques sont nécessaires au cours d'études descriptives comme celles-ci et combien ils ont manqué jusqu'ici (1).

(') Adamson constate avec raison le peu d'habileté technique avec laquelle ont été faites les préparations qui ont servi aux dessins de la génération médicale qui a précédé la nôtre. Rien n'est plus vrai. Certaines de ces figures sont d'une fausseté criante ou d'une imprécision invraisemblable se répète que même depuis 1892, plusieurs auteurs comme R. Krôsing, Weitere studien iïber Trichophytonpilze (Arch. f. Dermat. und Syph. Rd XXXV, 1895), dénient encore à la morphologie des Dermatophytes dans le cheveu ou le poil presque toute va) leur. Il serait impossible à un auteur de soutenir cette opinion, s'il gardait de chacun des cas observés des préparations permanentes. Nos dessins des Tr. endothrix, des Tr. microïdes, des) Tr. faviformes, prouvent, jusqu'à l'évidence, l'importance de la forme et de la disposition des Dermatophytes dans le cheveu. Krôsing niait jusqu'à l'existence de la microsporie comme maladie distincte ayant un parasite de forme reconnaissable ,

98 LES TEK INES.

1 . Anatomie pathologique. — Les pièces que l'on peut être amené à examiner, dans les dermatophyties, sont des biopsies d'herpès circiné de teigne tondante, ou faveuse, de godets faviques, etc.

Nous pratiquons leur fixation soit par le sublimé acide (l) soit par le liquide de Dominici dont les résultats, en ce qui concerne la la fixation cytologique, sont admirables (*).

On peut employer toutes les colorations pour colorer les coupes de ces pièces ; je mentionnerai parmi les meilleures et les plus simples :

1° Le bleu polychrome de Unna, avec ou sans coloration seconde au tannin orange ;

!2° L'hématoxyline de Boehmer; avec ou sans coloration seconde à l'éosine orange ;

5° L'éosine orange et le bleu de toluidine ;

i° L'éosine orange et le bleu polychrome^).

Pour la coloration des coupes, Bodin préconise la méthode d'An-

X1) Suivant les dimensions de la pièce, on la l'oit passer, de un quart d'heure à une heure, dans la solution aqueuse de sublimé et d'acide acétique (4 pour 100 de chacun). La pièce est lavée ensuite à l'acétone iodée (couleur acajou) changée deux fois en douze heures, ensuite déshydratée à l'acétone anhydre, douze heures; on l'imprègne dans l'éther parafliné à saturation à 38 degrés pendant ■24-48 heures. La pièce passe enfin 1 à 2 heures dans la paraffine fondue à 55 degrés avant d'être incluse et coupée.

(3) Le liquide de Dominici se fait ainsi : Préparer à chaud une solution aqueuse saturée de sublimé, laisser refroidir à 45 degrés. Ajouter 10 pour 100 de ormol commercial à 40 pour 100 ; filtrer. Ajouter de la teinture d'iode, goutte à goutte, et en agitant le liquide, jusqu'à obtenir la teinte d'un vieux rhum, et s'arrêter au moment où la teinte commence à virer au rouge, avant que se produise un commencement de précipitation. Après un quart d'heure, on voit la décoloration se produire, on ajoute de la teinture d'iode goutte à goutte, jusqu'à retrouver la première coloration ; ce liquide ne se conserve pas et doit être fait sur-le-champ suivant le besoin. Chaque pièce demande, pour être fixée, une grande quantité de liquide. Pour une pièce d'un demi-centimètre cube, il faut l'immerger dans cent centimètres cubes de solution. La fixation demande cinq à dix heures suivant la dimension de la pièce. Laver ensuite, dix heures, la pièce dans l'alcool à 90 degrés. La déshydrater, pendant le même temps, à l'alcool absolu, ou à l'acétone anhydre. Ensuite : éther paraffiné à 58 degrés pendant 24-48 heures; paraffine fondue à 55 degrés, une heure et demie à deux ; inclure. Noter que, dans toutes les pièces cutanées, l'orientation a une extrême importance. Autant que possible, il faut laisser à la pièce quelques poils qui la facilitent. Tous les poils sont incurvés, les coupes doivent être pratiquées devis le plan que leur incurvation détermine.

(3) a) Bleu polychrome de Unna, 1-2 minutes, lavage à l'alcool sans lavage à l'eau.

fi) Lorsqu'on fait une deuxième coloration au tannin orange, on la poursuit jusqu'à ce que l'on voie un commencement de décoloration du bleu.

y) L'éosine orange, en solution aqueuse à 1 pour 100, est employée, plus ou moins longuement, suivant la couleur de fond que l'on veut obtenir, depuis trente secondes jusqu'à une heure. Bien laver à l'alcool absolu, et, si l'on veut décolorer, laver à l'alcool à GO degrés. On colore ensuite au bleu de toluidine, 1 pour 100, ou au bleu polychrome, une demie à 2 minutes. Xylol. Baume.

glade et Morel (*), par le bleu Victoria, avec ou sans coloration double par l'érythrosine (2).

Je mentionnerai aussi le procédé de Sabrazès pour l'étude du godet favique par coupes sériées. On colore le godet en masse dans le picro-carmin ou le carmin aluné, après fixation à l'alcool absolu. On colore ensuite les coupes par la méthode de Weigert modifiée : immersion d'une demi-heure dans une solution très concentrée de violet gentiane, et décoloration lente par l'huile d'aniline (3).

J. Des méthodes d'ensemencement en général. — Les parasites des teignes sont d'une culture artificielle extrêmement aisée ; sauf exception (cultures faviformes), on en obtient, par une technique simple, des cultures pures d'emblée dès les premiers ensemencements, sans la moindre complication. Toutefois, les procédés d'ensemencement seront un peu différents, suivant qu'il s'agira de cultiver un Dermatophyte, en partant d'une goutte de pus ou de sérosité, ou d'un cheveu, ou d'un poil de barbe, ou bien d'ensemencer le poil d'une bête, ou encore de la poussière d'ongle ou un godet favique. Tous ces cas se présentent en pratique et doivent être étudiés successivement.

1. Herpès circiné. — Dès les premières cultures faites par les premiers techniciens valables, on avait reconnu que le Trichophyton peut s'extraire purement du pus de l'herpès circiné. « Pour le Trichophyton tonsurans on trouvera le plus souvent la semence pure dans les phlyctènes purulentes qui entourent parfois la plaque d'herpès (4). »

La plaque d'herpès circiné présente, tant qu'elle s'accroît, un bourrelet périphérique plus ou moins érythémateux, vésiculeux ou pustuleux. Si les vésicules ou les pustules sont grosses, en serrant la région entre deux doigts, on fera rompre une pustule, et du pus en sortira. Avec une baguette de platine on en prélèvera une trace qui sera ensemencée, en une strie, sur trois tubes successifs, sur milieu d'épreuve. S'il s'agit de vésicules et non de pustules, on fera de même, et on ensemencera de même la sérosité. Si les vésicules sont profondes

(1) a) Coloration des coupes, 24 heures, dans une solution alcoolique saturée de bleu Victoria, étendue de moitié d'eau, ou solution phéniquée de bleu de Toluidine (formule de Nicolle).

P) Lavage prolongé à l'eau.

y) Action de la solution iodo-iodurée de Gram pendant 5 minutes, puis lavage à l'eau.

S) Séchage complet au papier buvard.

e) Décoloration avec : Xylol, une partie, huile d'aniline, deux parties., Ç) Éclaircir au xylol, monter au baume.

(2) On passe la coupe pendant cinq minutes dans une solution aqueuse d'érythrosine à 1 pour 100 avant la coloration au bleu.

(3) Sabrazès. Le favus de l'homme, de la poule et du chien. Annales de dermatologie et de syphilîgraphie, 1893, p. 541.

(4) Duclaux. In Thèse de Feulard. Teignes et Teigneux. Paris, 1886, p. 96.

(paume de la main, par exemple), on les ouvrira d'un coup, avec une aiguille fer de lance flambée, ou bien on abrasera leur coupole d'un coup de ciseaux flambés ; la prise de la gouttelette d'ensemencement et la culture se taisant de même. Il doit être entendu, une fois pour toutes, qu'on doit préférer la lésion intacte, la vésicule ou pustule non ouverte, aux mêmes lésions déjà cffractées. Dans d'autres cas, le cercle d'herpès est sec, alors on ensemencera la squame. Le plus simple est d'utiliser pour cela deux lames de verre porte-objet, stérilisées à la flamme ; on racle, avec l'une, les squames qui tombent sur l'autre. On pratique, avec la baguette de platine, un ensemencement des plus fines parcelles, qui sont portées, une par une, sur la surface du milieu d'épreuve. Quelquefois on n'a pu prélever qu'une grande squame. On la porte alors sur une lame de verre, sur laquelle on la découpe en menues parcelles, avec deux aiguilles à dissociation. Les parcelles sont ensemencées ensuite une par une. Notez que cette dissociation est pratiquée à l'air libre, sans aucune précaution contre les poussières de l'air. Il se pourra qu'une des parcelles soit souillée par elles; non pas toutes.

On ensemence ainsi 5-10 menues parcelles punctiformes sur la surface d'un tube de culture. Mieux vaut n'ensemencer que cinq parcelles sur un tube, et faire ainsi six tubes d'ensemencement, que d'accumuler deux fois plus de parcelles sur moitié moins de tubes.

Ici doit se placer, en effet, une remarque que nous aurons lieu de répéter : opérer en grand, sur un très grand nombre de tubes, sans craindre la peine d'avoir à refaire de nouveaux milieux, est une des conditions pour faire des expériences claires et démonstratives.

2'. Teigne tondante. — De deux choses l'une : ou bien une teigne tondante présente des caractères analogues à l'herpès circiné, pustuleux ou séro-pustuleux, fait d'ailleurs rare, et on devra en pratiquer la culture comme il a été dit plus haut; ou bien on n'observe que des cheveux malades. Apprendre à les reconnaître est difficile. Nous les décrirons plus loin. Sans aucune stérilisation préalable de la peau, ni des cheveux, on prélève un certain nombre de ces cheveux, à la pince flambée, et on les dépose sur une lame de verre stérilisée. On découpe ensuite, avec un scarificateur, leur partie radiculaire, en quatre ou cinq parcelles punctiformes qui sont aussitôt ensemencées.

Pour les ensemencer, on flambe un fil de platine, avec lui on va piquer la gélose qu'on va ensemencer, et le fil de platine ainsi mouillé enlèvera par adhérence, une à une, les parcelles punctiformes de cheveu qu'on vient de découper, et qu'on ira déposer, à la file, sur un tube de gélose, chacune à un centimètre de sa voisine, quatre ou cinq par tube.

5. Barbe. — Nulle différence ne sera faite entre un poil de barbe ou

un cheveu d'enfant. Mais dans les trichophvties de la barbe on fera bien de rechercher et d'ensemencer aussi le pus, la sérosité, ou la squame, comme dans l'herpès circiné des régions glabres, parce que, dans beaucoup de trichophvties de la barbe, on peut trouver ce matériel d'ensemencement, alors que les poils malades sont rares. , Quelquefois aussi des poils de barbe sont mortifiés par la folliculile trichophytique sans avoir été eux-mêmes envahis par le parasite.

4. Poil d'animal. — Le poil du Cobaye, celui du Cheval, etc., ne sont jamais envahis par les Dermatophytes que sur un ou deux millimètres de leur racine, laquelle est bien moins profonde que celle du cheveu humain; par conséquent, on ne devra pratiquer le morcellement et l'ensemencement parcellaire que sur cette extrémité racliculaire seule, en évitant soigneusement de porter sur les milieux de culture des fragments de la portion aérienne du poil, cal*.' la fourrure de tous les Animaux domestiques est criblée de semences de moisissures banales qui couvriraient les milieux en quelques jours.

5. Ongle. — Quand un examen microscopique a démontré la présence d'un Dermatophyte dans l'ongle, et qu'on veut en pratiquer la culture, ou bien on prélève une rognure d'ongle qu'on dissociera avec des aiguilles, ou bien on stérilisera une lime à ongle et on limera la partie malade au-dessus d'une lame de verre stérile. De toutes façons, on en pratique l'ensemencement parcellaire comme des parcelles de cheveu.

6. Godet. — De même, on pratique l'ensemencement parcellaire du godet favique, après avoir écrasé, entre deux lames stériles, un fragment de son centre, en évitant d'ensemencer les parcelles provenant de sa surface et qui sont habituellement souillées.

Tels sont dans leur simplicité mes procédés d'ensemencement. J'ai vu de très nombreux élèves étrangers de maîtres divers, étonnés de la simplicité de ces procédés et de la sécurité de leurs résultats.

Ces cultures extemporanées de pus, de cheveux, de poils, de squames, sont pratiquées, pour chaque cas, sur cinq à six tubes qui reçoivent, chacun à un centimètre d'intervalle les unes des autres, trois à quatre semences. Ces méthodes simples nous donnent plus de 15 cultures pures d'emblée sur 20 faites (').

Tous les élèves qui sont passés dans mon laboratoire ont, sans faute, délaissé les méthodes compliquées et surannées de Plaut, de Kral (2)

(*) Exception faite pour les Trichophytons faviformes dont nous reparlerons en leur lieu.

(â) Voyez F. Kral. Untersuehungen ûber Favus. II Mykologischer Theil. Arch. f. Dermat. et Syph. Ergànzungshefte, n° 1, p. 79. — Kral s'est servi d'abord du procédé classique des plaques et des dilutions, ensuite du broyage mécanique avec des poudres inertes. Ce procédé peut être utile pour une démonstration dans un cas isolé. Il est tout à fait inutile dans le plus [grand nombre .des cas,

do Rosenbach (*), comportant la stérilisation externe préalable du cheveu dans des bains ou des vapeurs antiseptiques, leur passage à la chambre humide, ou les broyages et les dilutions etc., etc., méthodes dont la complication, si elle était nécessaire, eût suffi à retarder de bien des années tout progrès en ces questions (2).

A l'heure actuelle, un nombre considérable d'observateurs : Bodin, de Rennes, Adamson. Bunch, Colcott Fox, de Londres, Mibelli, à Parme, Fergnani, à Barcelonne, Truffî, à Pavie, Krzystalowicz, à Cracovie, Du Bois, de Genève, Minne, à Gand, Uriburu, à Buenos- Ayres, Nicoulan, à Bucharest, etc., etc., se servent de la méthode que j'ai préconisée il y a quatorze ans et je crois que, si ceux qui la jugent incertaine la voyaient pratiquée comme elle doit l'être, ils se rendraient compte du mal fondé de leurs objections. C'est ce que Mario Truffî a écrit dans une note au Prof. Reale, combattant les critiques de Kral, de Walsch, de Krôsing, en Allemagne; de Marianelli, de Pelagatti et de Reale, en Italie.

K. Vases de culture. Température. Aération. Développement et purifications. — J'envisagerai ici une série de points techniques de second ordre mais importants néanmoins à bien connaître.

Parlons d'abord des tubes de culture :

a. — Les tubes de culture dont je me sers pour les premiers ensemencements ont iS centimètres de long sur 14 millimètres de large. J'estime que ces dimensions ne doivent pas être restreintes sous prétexte d'économiser la quantité des milieux de culture qu'on emploiera. En effet, pour juger d'une culture, il faut qu'elle se développe librement, et, quand elle touche les parois du verre, elle se déforme. Cet inconvénient est réduit au minimum avec des tubes larges.

p. — Les vases de culture ne doivent pas être bouchés d'ouate hydrophile, mais au contraire d'ouate non absorbante, sans quoi la stérilisation mouillera les bouchons qui ne sécheront plus et se laisseront envahir par les moisissures dont l'air déposera sur eux les graines.

y. — Les cultures de Dermatophytes croissent à de basses tempé-

et impraticable totalement clans une étude d'ensemble comme celle qu'expose ce volume.

1 H.-C. Plaut. Zuchtung der Triçhophytie Pilze in situ. Central Blatt f. Bakter, XXXI, 5, 1902, 215, 221, a préconisé une méthode •< qui se recommande par sa simplicité », dit Gedoelst. On dépose le poil ou la squame sur une lame nimbée, et on recouvre d'une lamelle également flambée, qu'on fixe aux quatre coins par une goutte de cire. On place le tout dans une chambre humide. Après 6 à 11 jours, des spores ont germé, des filaments mycéliens extra-pilaires se sont développés ; on reprend le mycélium ainsi formé pour l'ensemencement. On voit mal quel avantage offre ce procédé sur l'ensemencement parcellaire direct.

(') Rosexbacii. Transactions of thc Third Congress of Dermatology. London 1897.

(2) M. Truffî. Giorn. ital. del. malat. vener. et délia pelle. Fascicol III, 1902.

ratures, entre 15° et 30° environ; au-dessus et au-dessous de cette température elles souffrent et s'altèrent. Il faut éviter ces écarts. Des cultures laissées à 12° poussent mal, croissent tardivement, leur forme est anormale. Des cultures, portées à 50° et au delà, subissent des altérations aussi importantes, assez importantes pour amener des doutes sur l'identification de leur espèce. Les fortes chaleurs amènent généralement une surcoloration des cultures, diverses altérations de formes, et en outre une sénilité précoce.

Cette question est importante. Nous laissons toutes nos cultures à l'air libre dans le laboratoire. Cette façon de faire est simple et bonne; toutefois, en automne, avant que le chauffage d'hiver soit commencé, les cultures sont retardées par les nuits froides. Par contre, en hiver, dans les locaux très chauffés, les cultures doivent être soustraites à l'action trop directe de la chaleur : radiateur, calorifère, etc.

Lorsqu'on manipule des quantités de cultures, il serait difficile de les réunir dans une étuve, et l'on voit aussi que cette précaution serait inutile. Si on se sert d'une étuve, elle ne doit jamais dépasser 28°.

Il me semble préférable de laisser les cultures à l'air libre subir les oscillations de température du jour et de la nuit. La nuit, quand la température se refroidit, une certaine quantité d'air neuf rentre dans le tube de culture en se filtrant sur le bouchon d'ouate qui le clôt.

o. — Cette aération des vases de culture est nécessaire. Sauf exception, les vases de culture ne doivent pas être capuchonnés de caoutchouc, ce qui amène leur sénilisation précoce, et hâte l'apparition des formes pléomorphiques. Le capuchon de caoutchouc n'a pas cet inconvénient quand il s'agit de milieux sur lesquels les altérations pléomorphiques ne se produisent pas.

e. — Lorsqu'on veut identifier une culture de façon certaine, il faut la transplanter sur les milieux appropriés dont nous exposerons tout à l'heure la structure chimique, sur des vases de forme ronde, parce que le développement des cultures de Dermatophyte se fait toujours en cercle parfait. Cette remarque m'a conduit, en 1895 ('), à l'emploi des matras coniques d'Erlenmeyer et de Gayon, à base plate, au fond desquels on a coulé un disque de gélose nutritive d'un centimètre d'épaisseur environ. L'ensemencement se fait, par piqûre, au centre de la surface du disque. Sur ce milieu plan et rond, les cultures, qui sont toutes discoïdes elles-mêmes, prennent un développement normal et parfait et leur aspect le plus caractéristique.

Lorsque cette méthode s'est répandue, on a voulu à tort substituer la boîte de Pétri à la fiole d'Erlenmeyer. Mais le couvercle d'une boîte de Pétri est perpétuellement couvert d'une buée qui dissimule

(*) Annales de Dermatologie et de Syphiliçjraphie, 1893, p. 982. Rapport : Sur la trichophytie, présenté à la Soc. de Dermat. et de Syph.

exactement la culture sous-jacente. D'ailleurs une boîte de Pétri se souille trop aisément au cours de révolution d'une culture, évolution qui dure de quatre à six semaines et plus. Au Congrès de 1897 à Londres, les cultures sur boîtes de Pétri sont restées invisibles pendant toute la durée de la session.

La forme conique des fioles d'Erlenmeyer est elle-même utile, en ce que, si ce vase est exposé à la chaleur du jour, la condensation de la buée intérieure, due à l'humidité du milieu, ne peut, de par la forme même du vase, se faire que sur un tiers ou la moitié de la surface latérale, et la culture reste toujours visible par l'un quelconque des côtés du vase.

£. — La dimension des matras coniques sur lesquels on reporte les cultures de Dermatophytes doit être choisie en rapport avec la dimension que peut prendre la culture qu'on y porte. Ainsi pour les grands Trichophytons pyogènes, pour les Microsporums animaux, on est amené à se servir de matras coniques ayant jusqu'à 20 centimètres de diamètre et contenant jusqu'à 200 centimètres cubes de gélose chacun ; on arrive à avoir ainsi des cultures d'une beauté remarquable et dont beaucoup d'auteurs, même parmi ceux qui ont étudié le sujet, ne se doutent pas

7). — J'insisterai ici sur un point très important. Un trop grand nombre de mycologues ou de dermatologïstes n'ont jamais fait de bonnes classes primaires de bactériologie. Nous avons eu sous nos yeux des « chefs de laboratoire » qui seraient incapables de faire euxmêmes les géloses que leurs garçons de laboratoire font comme ils peuvent et stérilisent. Faire soi-même ses milieux de culture, savoir les faire, dresser soi-même son personnel à les fabriquer est de nécessité, première. Il ne faut pas non plus que la difficulté de se procurer des milieux de culture puisse obliger le chercheur à restreindre le nombre de ses expériences; la vérité se fera dans son esprit par la répétition en grand nombre des mêmes faits. Un laboratoire qui étudie ces sujets doit faire et dépenser plusieurs litres de gélose par semaine. Des expériences faites chichement ne donneront aucune sécurité en ces matières ('). Elles doivent chacune être reproduites des centaines de fois. Ceci est capital et tous ceux qui n'auront pas compris la vérité de cette affirmation feront, pour avoir négligé ce conseil, des erreurs qu'ils auraient pu et dû éviter. Lorsqu'on aura traité ici de la nature chimique des milieux qu'il faut employer pour la culture des Dermatophytes, on exposera exactement comment procéder à la fabrication de ces milieux de culture, en simplifiant au maximum les manipulations nécessaires.

(') La quantité de gélose faite pour le seul objet de ce volume en deux ans et demi dans mon laboratoire a correspondu à 15 000 tubes de culture.

L. Des milieux de culture. — En 1894, les Trichophyties humaines résument ainsi les remarques techniques suggérées par deux années d'observation. « La composition des milieux de culture dominera toujours toute étude mycologique ».... « Sur la composition chimique des milieux de culture s'appuient presque toutes les recherches qui vont suivre ('). » — Quinze ans passés ont vérifié ces mots. Et toutes les différenciations d'espèces dermatophytiques, qui ont été faites depuis lors, l'ont été par leur culture en milieux spéciaux.

Depuis cette époque, certaines techniques ont été améliorées ou complétées, beaucoup de faits mieux compris ont amené à délaisser certains procédés, on en a inventé plusieurs autres. Mais ces innovations ont confirmé et étendu ce que j'avais dit, plutôt qu'elles ne l'ont restreint ou modifié. On va le voir par la suite.

1° Sur un milieu de culture solide déterminé, une espèce mycologique prend un aspect déterminé^). — « Au contraire des bactéries, disais-je, dont les cultures ont [sur milieux solides] un aspect à peine reconnaissable et toujours analogue, même quand il s'agit des espèces les plus différentes, les Champignons ont dans les cultures une variété de formes dont la variété des plantes d'ordre plus élevé peut seule donner une idée. Leur port peut être infiniment varié.... Il est spécial et caractéristique jusque dans les détails.... La culture des Champignons se présente donc avec cette particularité qui la rattache à celle des plantes ordinaires : qu'ils ont à l'œil nu des caractères nets et particuliers et si l'on veut « personnels » (3).

Or ce premier fait en avait un second pour corollaire, c'est que le même champignon reprend, « sur le même milieu, la même forme spécifique toujours invariable. Et ce caractère primordial est fixe. Aucun passage sur aucun milieu ne le fera disparaître. La culture étant inoculée, si l'on reprend le germe sur le vivant, on aura de nouveau la même culture que la culture originelle ('"). » Je cite ici cet ancien texte, parce qu'il me semble impossible d'écrire rien qui soit plus clair, plus catégorique et plus vrai. Depuis 1894, tous les observateurs qui ont bien voulu suivre ces techniques ont obtenu les mêmes résultats (5). Pour eux, comme pour moi, cette loi est hors de

(') R. Sabouraud. Trichophyties humaines, page 51.

(2) L'usage des milieux solides pour la culture différentielle des teignes est tout à fait indispensable, et cette nécessité n'avait pas été comprise par Duclaux et Verujsky qui écrivaient en 1886 : « Les milieux solides sont en général moins favorables à la culture de ces parasites que les milieux liquides. » Cela n'est vrai que pour l'étude biochimique des échanges des parasites en culture.

(3) Trichophyties humaines, p. 51, 52.

(^■Loc. cit., p. 52 et 12. Ceci est tout à fait vrai sous réserve des altérations de sénilité et des transformations pléomorphiques dont il sera traité plus loin. (5) Cf. Colcott Fox et Blaxall. Notes on two cases of tinea circinata. « When several cultures are inoculated at the same time on the same batch

doute et ne saurait être remise en question ('). Je n'insiste pas, car cent figures, et plus, de cet ouvrage sont là pour l'établir et prouver que, si certains auteurs ont cru mettre cette vérité en échec, c'est par erreur.

2° L'aspect d'une culture crypto g amique est lié à la composition chimique de son 'milieu et change avec lui. — Ainsi donc un milieu chimique toujours semblable, donnera, à un champignon donné, un aspect toujours identique. Mais cette proposition, vraie pour un milieu, sera vraie de même pour un autre. Sur deux milieux différents, le même champignon prendra deux aspects différents, et, sur chacun, il gardera son aspect spécial, toujours le même; ceci nous conduit donc à une deuxième proposition aussi importante que la première, à savoir que : l'aspect d'une culture cryptogamique est lié à la composition chimique de son milieu, et varie avec lui. C'est ce que je disais dès 1894, en termes précis : « L'aspect des cultures cryptogamiques est lié à la composition chimique de leur milieu.... On voit le même Champignon redonner sur le même milieu, chimiquement identique à lui-même, une forme spécifique toujours invariable.... Et, corollairement, le même champignon peut prendre une infinie variété déformes objectives, suivant les divers milieux qui lui sont offerts (2). »

Ces faits étaient vrais, et ils le restent (3).

of médium, they ail conform to the saine pattern. » — Gf. aussi Bodin. Les Champignons parasites de l'homme, p. 46.

(*) Sans doute peut-on lire, dans certains auteurs, quelques réserves sur ce point, même quand ces auteurs ont pensé suivre mes méthodes exactement, mais il n'est pas difficile de se rendre compte des raisons qui ont fait leur opinion. Ainsi Ducrey et Reale au Congrès de Londres de 1896 (Transactions, p. 580) disoient avoir obtenu « en ensemençant plusieurs tubes, avec la même semence, des cultures différant notablement les unes des autres, bien qu'ensemencées sur le même milieu ». Il est évidemment possible de créer ces différences en ensemençant plus ou moins profondément la même graine, ou bien en posant l'une sur un point où la gélose est épaisse, l'autre sur un point où la gélose très mince sera sèche en quelques jours.. C'est ce que nos photographies de cultures sur tubes montrent très bien, mais ceci est dû à des défectuosités de technique qu'il esl toujours possible d'éviter, et qui d'ailleurs sont évidentes à première vue. Tout le mémoire de Ducrey et Reale contenait ainsi, par scrupule scientifique sans doute, des propositions inverses émises parallèlement avec une valeur égale. Inversement, pour M. Pelagatti (/ trichophyton delta provincia di Parma, 1896), la composition chimique diverse des milieux de culture influe sur chaque variété trichophytique, mais non au point d'empêcher le diagnostic de la variété à première vue. C'est là une erreur certaine. Beaucoup de Dermatophytes, comme nous le verrons, changent totalement de caractères en changeant de milieu et deviennent rigoureusement méconnaissables.

(2) Loe. cit., p. 32. J'ajoutais encore : « C'est à cause de cette extrême sensibilité des formes cryptogamiques à la composition de leur milieu de culture, que tant d'auteurs ont répété à tort que leur aspect objectif ne pouvait servir à les différencier (Loc. cit., p. 52).

(3) On remarquera cependant qu'après avoir formulé autrefois les milieux d'épreuve avec 3,80 0/0 de sucre, j'ai élevé ce taux de sucre à 4 0/0 dans ma formule actuelle. Ce changement a été fait dans un but de simplification; il n'entraîne pas chez les Dermatophytes des modifications de forme suffisantes pour créer des confusions.

5° Un milieu de culture fixe permet de différencier des espèces eryptogamiques voisines. — Les propositions précédentes s'enchaînent entre elles et avec les suivantes comme des propositions mathématiques : si un milieu de culture fixe donne à chaque Champignon une physionomie personnelle, il permet de différencier entre elles des espèces eryptogamiques voisines. Et c'est ce que ce je disais encore :

« Si l'on opère avec un milieu de culture toujours chimiquement identique à lui-môme, et si, sur ce milieu, les cultures de diverses provenances se présentent avec des caractères distincts, si ces caractères demeurent permanents et héréditaires, on ne pourra faire aucun doute qu'il ne s'agisse d'êtres différents. L'expérience prouve que ce critérium est d'une extrême rigueur (1)--.- »

Le meilleur moyen de vérifier la pluralité d'espèces eryptogamiques voisines est de comparer « la forme spécifique de leur culture en milieux spéciaux » (s). « C'est en observant l'importance du rôle que joue la constitution chimique du milieu, dans le développement des champignons, qu'on est amené, pour s'assurer de l'unité ou de la pluralité des Trichophytons,... à différencier entre elles ces espèces, par leur culture sur un milieu fixe de composition chimique définie et courante. »

En résumé : les Trichophytons « sont doués d'une sensibilité infinie à la composition chimique du milieu sur lequel ils sont portés. Suivant ce milieu, un même Champignon peut varier pour ainsi dire sans limites, quant à l'aspect objectif de sa culture, et dans des limites très étendues quant à ses formes microscopiques. Et cependant, un même Champignon, sur un même milieu, fournit une culture toujours identique à elle-même. Le milieu devient le meilleur moyen de différencier, par leur aspect objectif en culture, deux Champignons, même d'espèce voisine. Les cultures sériées sur même milieu, en affirmant la persistance héréditaire des signes spéciaux, objectifs d'une espèce, feront la démonstration cherchée (s) ».

Mais ce n'est pas tout. Si un milieu de culture fixe, en donnant à chaque Champignon une physionomie personnelle, permet de différencier, entre elles, une série d'espèces eryptogamiques voisines, plusieurs milieux de culture feront de même ; et un second ou un troisième milieu, autres que le premier, attesteront différentes les mêmes espèces que le premier aura séparées. C'est ce que j'écrivais encore en ces termes : « Cette différenciation que donne un milieu, un second milieu la contrôlera, et l'identité des deux résultats donnera la preuve de la preuve elle-même » (4) .

(') Loc. cit., p. 29.

(-) Loc. cit., p. 54.

(3) Loc. cit., p. 35.

(4) Loc. cit., p. 54.

Et c'est la méthode qui nous permet de différencier les diverses espèces trichophytiqués, car les différents milieux, sur lesquels j'ensemençais, mes parasites, « affirmaient les mêmes cas dus aux mêmes espèces trichophytiqués, et les mêmes autres cas, comme dus à des espèces trichophytiqués différentes » (').

i11 Les milieux comprenant 4 pour 100 de sucre et 1 pour 100 de peptone donnent aux Trichophy tons leur forme différentielle la plus accusée.

Il restait à déterminer sur quels milieux les divers Champignons parasites prenaient leur aspect le plus spécial et le mieux différencié. Pour cela je fis nombre d'expériences comparatives que je n'ai pas à rappeler. J'éliminai d'abord en bloc tous les milieux liquides sur lesquels la forme des Champignons est variable et méconnaissable, j'éliminai la gélatine et la gélose peptone, trop pauvres, la pomme de terre, milieu assez différentiel, mais très pauvre aussi, peu maniable, trop vite desséché, et, ce qui est plus curieux, assez inconstant, car le même Champignon sur des 'pommes de terre différentes prend des aspects différents (*); Sur le conseil de E. Duclaux j'essayai alors les milieux sucrés, et, parmi eux, le moût de bière solidifié par la gélose. Ce milieu, lorsqu'il provenait de la même brasserie, lorsqu'il n'était ni trop concentré, ni trop recuit (3), montra les plus grandes qualités. Sur lui les cultures trichophytiqués prenaient un dévelop peinent maximum, et si l'on peut ainsi parler, leurs caractères différentiels s'épanouissaient et devenaient évidents. Ce milieu présentait seulement un grave inconvénient, inévitable, l'inconstance de sa composition chimique suivant sa provenance. Même si on le fabrique soi-même (*), on est obligé de rectifier sa teneur en sucre qui d'une fois à l'autre est variable. Et puis, les moûts de bière contiennent tous, et en proportion variable, d'autres hydrates de carbone que la maltose; dextrines, etc.... Bref il est impossible de donner une formule

(') Luc. cit. p. 56.

(â) Je n'insiste pas sur l'erreur de Krôsing proposant la pomme de terre comme le milieu de culture le plus constant et le plus différentiel qui soit. Les milieux naturels ont pour seul avantage de ne demander qu'une simple stérilisation ce qui rend leur préparation facile.

(3) Les chauffages répétés du moût de bière à 115 degrés centigrades produisent du caramel qui est antiseptique.

(4) Voici la technique donnée par E. Bodin, Les Champignons parasites de l'homme (1902, p. 51, note) pour fabriquer soi-même son moût de bière : « 200 grammes de malt moulu sont délayés dans un litre d'eau froide, puis on porte sur un fourneau et on élève doucement la température à 00° . On maintient cette température pendant trois quarts d'heure en agitant. On ajoute alors quatre grammes de houblon et l'on fait bouillir pendant une heure environ. On filtre et on dose la maltose à la liqueur de Fehling, on étend ensuite la liqueur avec la quantité d'eau suffisante pour l'amener le titre de la maltose à 3 pour 100. »

d'après laquelle on puisse fabriquer un moût de bière toujours semblable à lui-même. Pour éviter ces inconvénients il fallut formuler un milieu artificiel facile à faire, dont les composants fussent aisés à trouver partout, et qui pût servir de milieu international d'épreuve, de telle façon qu'en reportant sur lui un Trichophyton quelconque, il y reprît sa forme spéciale à lui, prise pour caractéristique.

Les Trichophyties humaines racontent ('), comment on arriva à en établir « la formule générale » qui est la suivante :

Sucre (ou mieux hydrate de carbone) 4 grammes.

Peptone 1 gramme.

Eau distillée 100 grammes.

Agar agar (gélose) q. s. pour solidifier.

Cette formule dut être précisée lorsqu'on se fut rendu compte que les différentes marques de sucre ou de peptone donnaient à un Champignon des caractères de culture différents. Alors la formule générale devint dans la pratique la formule particulière que voici :

Maltose brute de Chanut 4 grammes.

Peptone granulée de Chassaing 1 gramme.

Eau distillée 100 grammes.

Agar agar ler80 (2)

« Enfin, pour abréger le temps de ces expériences, et en même temps, pour augmenter la précision de leurs résultats, on pourra se servir à la fois de trois milieux de formule semblable mais faits avec des sucres différents. On conçoit que, si un cas de trichophytie donne sur un milieu sensible une culture spéciale, différente de celles que les autres cas ont fournie, si la même différence se reproduit sur un second milieu sensible, autre que le premier, l'autonomie de l'espèce nouvelle sera doublement affirmée (3). » C'est là un système qui rappelle les comptabilités en partie double. Depuis lors, et spécialement depuis quatre ans, nous n'avons jamais manqué à cette règle, et toutes nos expériences ont été répétées chaque fois sur les deux milieux d'épreuve maltosé et glucose.

Objections- — De ce qui précède, on peut conclure, ce que j'ai dit maintes fois expressément, que si l'on voulait obtenir des résultats comparables entre eux, il fallait opérer sur un milieu ou sur des milieux identiques, faits avec la même peptone et le même sucre.

Or, il est arrivé que certains auteurs, au lieu de choisir comme moi la mallose, ce qu'il aurait fallu faire, pour avoir des cultures comparables à

(l).Loc. cit., p. 55.

(aj Tous ces produits de laboratoire me sont fournis par la maison Cogit, 56, boulevard Saint-Michel, à Paris.

(3) Loc. cit., p. 55.

celles dont j'avais donné la figuration, ont l'ait leurs expériences, les uns avec la lévulose, comme Unna, les autres avec la ylucose, comme Bodin, les autres avec une peptone et une mallose différentes des miennes, comme Fox et Blaxall. Il s'en est suivi une confusion qu'on pouvait prévoir en sachant (ce que j'avais dit) : que le môme Champignon, sur des milieux différents, change d'aspect et devient méconnaissable. Le résultat de tout ceci est que, si Ton consulte n'importe quel auteur sur ces sujets, la figuration des cultures qu'il donne est incomparable à toute autre, et ne peut conséquemment servir que si l'on recommence toute la série de ses propres expériences. Il est impossible de savoir à l'heure actuelle, par les figures publiées, si la plupart des Derniatophytes de France, d'Angleterre et d'Allemagne sont identiques ou différents (1).

Notons bien que les erreurs qui ont amené cette confusion ont eu des causes. Unna a dit s'être servi de tous temps de la lévulose, et qu'il faudrait prendre la lévulose pour étalon (2). Fox et Blaxall avaient pris la peptone allemande de Witte, parce que c'est celle dont ils avaient l'habitude et ils n'avaient pas pris ma m ait ose parce qu'ils n'en avaient pas trouvé (3).

Bodin a objecté que la glucose donnait des cultures plus florissantes et que ma maltose était impure •(*).

Je voudrais répondre brièvement à ces objections.

Dans \u\e étude objective des cultures de Derniatophytes, étude qui a pour but de les différencier entre eux, la question n'est pas de savoir si tel sucre donnera, avec un de ces Champignons pris pour exemple, un poids de récolte supérieur à celui que l'on obtiendrait avec un autre sucre. Il est parfaitement certain, pour moi, que si telle était la question, ce milieu devrait alors changer, avec chaque Champignon parasite que l'on étudierait. Je citerais ainsi tel Trichophyton qui préfère la lactose ou la lévulose, tels autres qui, en dépit de la règle générale, préfèrent des milieux peu sucrés et fortement azotés. La question n'est donc pas à poser ainsi. Il s'agit de formuler un milieu simple et facile à faire, qui donne aux cultures des Derniatophytes, pour chaque espèce différente, des caractères différentiels. Or, les cultures sur milieu glucose ne sont pas mieux différenciées que sur gélose nialtosée. Toute la série des pho-

I1) J'exprimais les mêmes regrets en 1896 en parlant des collections de teignes exposées au Congrès international de Londres en 1896.

•< Ce qui importe au sujet, et qui est de nécessité absolue, si l'on veut faire un pas en avant dans la question, c'est l'adoption de techniques communes à tous et identiques. Un Congrès international n'a de raison d'être que quand ceux qui s'y rassemblent sont mis à même de se comprendre. Or, les cultures de chaque collection étaient inintelligibles pour les auteurs des collections voisines. Elles étaient donc inutiles. » (La question des teignes. Revue critique des discussions sur ce sujet au 5° Congrès international de dermatologie et de syphiligraphie. Londres, 4-8 août 1896. Annales de dermatologie et de SyphiligrQphie, 1896, p. 1555.

(2) P.-G. Unna. Sur la culture et la pluralité des Trichophytons. Journal des maladies cutanées et syphilitiques, mai 1897, p. 253. — Voir p. 268.

(5) C. Fox et F. Blaxall. On ringworni; an inquiry, etc..., p. 28 du tirage à part.

(4) <• Il importe de noter que pour la fabrication de ce milieu, dit milieu d'épreuve, Sabouraud a utilisé une mallose impure, qui ne se trouve plus dans le commerce. » E. Bodin. Les Champignons parasites de l'homme, p. 107, note 1. C'est cette idée (que la maltose que j'avais utilisée ne se trouvait plus dans le commerce) qui a conduit Bodin à utiliser des milieux d'épreuve glucoses.

tographies de cet ouvrage le prouvera. Et même, si ce bénéfice existait. il n'eût pas valu un changement de formule qui rend des travaux antérieurs consciencieux et valables, incomparables à ceux qui les ont suivis. Bodin objecte aussi que ma maltose était impure, et qu'avec une glucose pure anhydre on aura partout des résultats comparables.

Que ma maltose ne fut ni pure, ni anhydre, mon texte de 1892 le disait déjà(J), mais il serait inexact de croire que toutes les maltoses ou les glucoses pures anhydres, de différentes marques, seront identiques entre elles. Et déjà la maison Merck de Darmstadt a deux glucoses pures de prix différent; laquelle prendre ? Et si l'on est obligé, quoi qu'on veuille, de faire élection d'une marque de sucre, si pur qu'il soit, pourquoi, dès lors, changer la première choisie.

On pourrait encore supposer qu'un sucre, lorsqu'il est pur, doit être plus favorable à la culture des Dermatophytes, et les différencier mieux qu'un sucre brut. Mais cela est encore erroné. C'est le contraire qui est vrai. Il est assuré, pour moi, que les manœuvres d'épuration1, qui font d'une maltose brute ou commerciale une maltose pure anhydre, altèrent profondément la nature et la valeur nutritive de ce produit. J'affirme le fait sans l'expliquer. Toutes les maltoses, soi-disant pures, que j'ai essayées, donnent des cultures d'une médiocrité insigne, alors que la maltose commerciale dont je me sers donne des cultures admirablement belles et différenciées (2). C'est un fait dont plusieurs observateurs étrangers qui ont pu faire la comparaison, ont convenu sans aucune peine (3).

On objectera peut-être encore que les sucres bruts doivent être plus altérables, ou encore, que d'une cuvée à l'autre, des sucres bruts peuvent ne pas être semblables. Tout ce que je puis répondre, c'est que mes expériences primitives, je les ai reprises après quatorze ans, et que j'ai retrouvé, à cette date, la même maltose que j'avais utilisée jadis, et qu'elle m'a fourni des cultures dont la forme est de tous points identique à celle de leurs aînées, de même espèce, photographiées à cette époque. Cette objection ne vaut donc pas plus que les précédentes.

Enfin, il reste, en cette question, un point qui mérite de fixer encore notre attention. Si l'on veut pratiquer une étude culturale valable des Dermatophytes, on doit ensemencer des cultures en tubes et enmatras,par milliers, et les cultures en tubes dépensent 10 à 12 centimètres cubes, et les cultures sur matras de 30 à 200 centimètres cubes de milieu nutritif

(') « On conçoit que se servir d'un milieu de culture d'une constitution chimique parfaite soit, dans ce cas (pour la différenciation des espèces), moins nécessaire que de s'astreindre à répéter sur un milieu simple et sensible la série des expériences que nous venons d'énumérer. »

« Une peptone et une maltose même impures pourront suffire, pourvu que, dans la suite des recherches faites, on se serve constamment de la même peptone et de la même maltose, etc. » Trichophy fies humaines, p. 54.

(-) La glucose pure anhydre est moins altérée. C'est parce que dans ses essais comparatifs Bodin s'est servi de ces maltoses dites pures et en réalité inassimilables, qu'il a pu croire les milieux glucoses très supérieurs aux milieux maltoses. En fait, dans nos ensemencements, le développement comparé des Dermatophytes sur les deux milieux est semblable. Pour formuler mon opinion tout entière, peut-être les milieux glucoses favorisent-ils un peu les Microsporums, et les milieux maltoses, les Trichophytons. Mais ce sont là des différences à peine appréciables.

(3) Voir particulièrement : Colcott et Blaxall. On ringworm ; an inquirv, etc., p. 28-29 du tirage à part.

chacune. Pour l'étude que j'ai reprise, mon laboratoire fabrique environ cinq litres de gélose par semaine. Or, la lévulose pure coûte de 200 à 250 francs le kilogramme, la glucose pure anhydre 70 francs, la maltose pure 200 francs et plus.

En un an, un laboratoire comme le mien dépenserait 1500 francs de sucre et davantage, en des expériences qu'on eût pu faire aussi valables pour 55 francs. La maltose commerciale coûte 4 francs le kilogramme au lieu de 200, et la glucose massée 2 francs au lieu de 70 francs, etc. Ce sont là des différences. Et si l'on réfléchit que l'emploi des sucres purs ne dispenserait pas de l'emploi de marques spéciales, et qu'on serait toujours obligé de spécifier la marque de sucre pur anhydre que l'on emploierait; si Ton ajoute que les peptones (dont l'emploi est quasi nécessaire dans un milieu nutritif de Dermatophytes, puisque ceux-ci ne se nourrissent pas exclusivement de sucre, mais aussi de matériaux azotés), si l'on songe, dis je, que les peptones sont encore bien plus différentes entre elles que les sucres, et que leur emploi oblige toujours à indiquer la marque qu'on utilise, il me semble beaucoup plus simple de dire :

Dans les expériences qui vont suivre, j'ai utilisé telle peptone et telle maltose, et si l'on veut renouveler les expériences comparables 'aux miennes, il sera toujours aisé de se procurer ces produits.

J'ai proposé au Congrès de Londres, et je propose de nouveau l'adoption internationale d'un et mieux de deux milieux d'épreuve pour différencier les espèces de Dermatophytes, et ces milieux ont pour formule :

Le premier :

f Eau pure 1000 grammes.

T S Maltose brute de Chanut 40 —

) Peptone granulée de Chassaing 10 —

( Gélose . . 18

Et le second :

f Eau pure 1 000 grammes.

Ir î Glucose massée de Chanut (I) 40 —

J Peptone granulée de Chassaing 10 —

( Gélose (2) ' 18

Cette question des milieux de culture est tout à fait capitale, c'est pour cela que j'y insiste à ce point. Je voudrais que ces milieux, proposés depuis quatorze ans, et qui donnent de si excellents résultats,

(') Consulter la note 2 de la page 109 concernant la provenance de ces sucres et de cette peptone.

(-) A propos de ce milieu, G Fox et Blaxall m'ont reproché de ne pas avoir indiqué qu'elle réaction acide, neutre ou alcaline, il devait avoir. C'est parce que ce milieu est spontanément neutre ou à peine acide et que je n'y ajoute rien qui puisse changer sa réaction.

devinssent en ce qui concerne les teignes des milieux internationaux (').

Si les auteurs de tous pays, avec le même labeur qu'ils ont dépensé, avaient pratiqué leurs cultures de Dermatophytes, sur le même milieu, cette question dermatologique serait infiniment plus avancée qu'elle ne Test encore, ("est là ce qui justifie ma proposition. Du reste, rien n'empêcherait chaque observateur de l'aire ses cultures sur le milieu d'épreuve de son choix, s'il voulait bien pratiquer ses cultures de comparaison sur un même milieu international. Faute de quoi, la peiné de chacun sera au moins à demi perdue.

Pratique des cultures. Tableaux d'ensemencement. — Gomme je l'ai dit déjà, en pratique, on ensemence, pour chaque cas mis à l'étude, vingt parcelles de cheveux ou de squames, en cinq, ou six tubes de milieu d'épreuve. Après trois semaines, les Trichophytons et Microsporums ont pris leurs caractères typiques. Très rapidement donc, l'observateur discernera, entre les cultures des différents cas, même si ses ensemencements ont été pratiqués sur tubes, les cas identiques x;t les cas dissemblables.

-Mais, quand on voudra réellement se rendre un compte parlait de la pluralité des espèces du groupe dermatophytique qu'on observe, on fera ce que j'appelle un tableau d'ensemencement. '.

Le même jour, on ensemence toutes les unités de la collection, chaque cas sur 4 ou 5 matras de milieu d'épreuve. Après trois semaines, on verra :

1° Que tous les matras ensemencés avec le même cas ont fourni une culture pareille ;

2° Que certains autres cas ont donné lieu à une culture semblable;

3° Mais que d'autres cas ont donné lieu à une culture différente.

Enfin on vérifiera que les réensemencements sur tous les milieux ne changeront ni ces similitudes ni ces dissemblances, qui se répéteront sur tous les milieux d'épreuve, maltosés, glucoses, lévuloses, lactoses, etc.

Et, lorsqu'un tableau semblable aura été fait ainsi sur mon milieu d'épreuve, les cultures qu'on obtiendra pourront être comparées aux miennes, car c'est ainsi qu'ont été obtenus les résultats que je vais exposer.

M. De la fabrication des milieux de culture solides. — Bien des observateurs m'ont envoyé des cultures qu'ils disaient faites sur

(M Je ne mentionne que pour mémoire la gélose de peau proposée par M. Finger à la .Soc. viennoise de dermat., 10 mars 1897. Le milieu est fait d'une macération de 5 grammes de poudre de peau de bœuf dans 100 grammes d'eau, solidifiée par la gélose. On voit mal le bénéfice de pareils milieux pour des parasites aisément cultivables sur tous autres.

mon milieu d'épreuve .'et leur milieu ne ressemblait point au mien. 11 faut donc exposer comment on doit faire les milieux d'épreuve.

D'abord, une première remarque : Ne jamais vouloir opérer sur plus de trois litres de liquidé, car c'est la quantité maxima qu'on peut manipuler, à la fois, sans difficultés techniques excessives. Il vaut môme mieux commencer par faire ces milieux en quantité moindre.

Cependant, comme les difficultés d'exécution croissent avec le volume du liquide sur lequel on opère, je supposerai l'opération portant sur trois litres.

I. Préparation du milieu. — On verse dans un grand ballon, à col demi-long, et à fond plat, d'une capacité de cinq litres, trois litres d'eau pure non distillée dans laquelle on ajoute immédiatement (l) : a) Cinquante-quatre grammes de gélose coupée en menus morceaux; p) Cent vingt grammes de sucre ;

y) Trente grammes de peptone granulée Chassaing(2). II 1er Chauffage. — On porte ensuite ce gros ballon bouché d'ouate non hydrophile à l'autoclave (3) et on monte la température sans aller trop vite, avec une couronne de gaz seulement. Il est bien entendu qu'on laisse ouvert le robinet d'échappement de vapeur jusqu'à dégagement d'un jet continu de vapeur d'eau. On le ferme ensuite et on laisse monter la température à 120°. On éteint le gaz aussitôt et on laisse redescendre à 100°.

III. Filtration. — Alors on ouvre l'autoclave, on débouche le grand ballon, on remue son contenu avec un agitateur de verre, et, en tenant le ballon lui-môme, on l'agite en tous sens pour bien mélanger tout ce qu'il contient.

D'autre part, on a, pendant la première chauffe, préparé, outre les vases de culture dans lesquels la gélose faite sera coulée, dix fioles de 500 grammes environ, en rang, ayant chacune leur entonnoir de cent grammes, garni d'un filtre de papier Chardin^) et on verse, avec le grand ballon, dans chacun de ces entonnoirs, la quantité de liquide qu'il peut contenir.

Ici se place la seule manœuvre de l'opération qui soit délicate parce

(') Si on veut obtenir les mêmes Dennatophytes, sous le môme aspect que leur donnent les planches de ce volume, on se servira de la maltose brute ou de la glucose massée de Chaïut, comme il a été dit, et de la pèptone de Chassahig.

(2) Si au lieu de faire un milieu d'épreuve on voulait faire un milieu de conservation des types cryptogamiques, on ajouterait pour trois litres d'eau, avec la gélose, 3 pour 100, soit 90 grammes de peptone et pas de sucre, le reste de l'opération restant identique.

(5) Il est meilleur de laisser la gélose en contact avec l'eau,' une demi-heure ou une heure, avant le chauffage, pour lui laisser le temps de s'imbiber d'eau.

(*) Ce papier filtre avec beaucoup de perfection et de rapidité les liquides, coagulables ou sirupeux; on le trouve comme les sucres et la peptone indiqués chez Cogit, 56, boulevard Saint-Michel, à Paris.

qu'elle demande a être exécutée très vite et très bien. Sitôt qu'un des premiers filtres s'engorge, et commence à ne filtrer que par gouttes, on enlève son entonnoir, on le remplace par un autre neuf, garni d'un nouveau filtre, et on troue l'ancien, -au-dessus de lui, avec un agitateur.

L'entonnoir sale est aussitôt pris par un aide, lavé à l'eau chaude, et garni d'un nouveau papier-filtre, il va resservir immédiatement. Ainsi de suite.

Dans une opération bien conduite, les filtres doivent laisser s'écouler un filet de liquide perpétuel.

En 1/4 d'heure tout doit être filtré, avec des déchets insignifiants et une dépense de 20 ou 25 filtres (').

On a donc le milieu d'épreuve, filtré, encore liquide, réparti en dix flacons de 500 grammes.

11 importe alors de mélanger rapidement le liquide que tous contiennent car les dernières parties filtrées sont plus foncées, plus char1 gées de sucre et de matière coagulante, que les premières.

Pour cela, on mélange tout dans un grand matras chaud, on agite; et on reverse de nouveau le liquide dans les mêmes fioles de 500 grammes, dont on se servira pour faire la distribution.

IV. Répartition — Les tubes ou les matras dans lesquels on va répartir la gélose sont prêts, l'opération est faite très vite, surtout si les opérateurs sont deux. Le premier verse, le second bouche les vases.

Celui qui verse veille : 1° à donner à chaque vase la quantité qu'il doit contenir ;

2° A ne pas mouiller de liquide le col du vase, ce qui y ferait adhérer le bouchon d'ouate.

Celui qui bouche veille : 1° à ne pas serrer ni tasser le bouchon d'ouate, car, à la stérilisation qui va suivre, il serait mouillé et ne sécherait plus;

2° A bien placer les tubes bouchés l'un près de l'autre pour éviter le refroidissement et la coagulation du liquide qu'ils contiennent.

V. Stérilisation. — Aussitôt cette opération finie, on entasse, dans le panier d'un grand autoclave, les tubes ou les matras, en les espaçant, pour que la vapeur puisse passer entre eux, en évitant la souillure de leurs bouchons (-) et de façon que tout tienne et soit stérilisé en une seule chauffe.

(') On remarquera que cette opération supprime le filtre à chaud, instrument coûteux, encombrant, inutile et d'une lenteur d'action pitoyable, Avec lui, une filtration de trois litres de gélose demanderait dix heures. La même filtration par notre procédé ne demande pas vingt minutes, et elle ne doit pas demander plus, sous peine de laisser coaguler le liquide filtré, ce qu'il ne faut pas.

(*) Les matras sont coiffés d'un papier, très utile pour préserver l'ouate de la

L'important ici sera de monter très lentement la température de l'autoclave, car la gélose a un coefficient de chaleur de fusion très élevé, et, en ce moment de l'opération, elle est considérablement refroidie. On monte donc avec une seule couronne de gaz très .' lentement jusqu'à 120°. Et, comme la première fois, on éteint aussitôt. La stérilisation du milieu nutritif, des vases et des bouchons d'ouate, est faite ainsi, d'un seul coup, et complète.

Lorsque la température sera descendue, on étalera tous les tubes inclinés. On placera sur un plan horizontal tous les matras. La géloseainsi faite sera prête à servir quelques heures plus tard. Toute l'opération, pour trois litres de liquide qui ont fait 500 "tubes(1),a demandé à peine quatre heures à deux personnes.

On comprend néanmoins que, pour savoir manier de telles quantités d'une matière coagulable à plus de 40°, sans la laisser coaguler, il y faut une prestesse et une précision qui ne s'acquièrent pas du premier coup. Aussi recommanderai-je au débutant de commencer par opérer sur un litre, puis sur deux, avant d'opérer sur trois litres de liquide. Il est inutile d'ajouter, je pense, qu'un tel travail ne pourrait à aucun moment être interrompu, si peu que ce soit.

On pourrait chercher ici l'exposé des techniques d'étude mycologique des teignes, mais elles trouveront mieux leur place en tète de /'Etude mycologique elle-même.

N. Inoculations expérimentales des Dermatophytes. — Les inoculations des teignes à l'Animal, et même à l'Homme, faites dans un but expérimental, doivent être répétées pour chaque espèce que rencontre l'observateur. C'est la plus simple manière pour lui de s'assurer qu'il manie bien un parasite et non pas un saprophyte accidentellement rencontré dans la lésion. Parmi les Animaux, le plus commode à utiliser est le Cobaye, mais on a pratiqué des inoculations sur le Lapin, le Chat, le Chien, la Poule, et même sur de gros Animaux : Mouton, Chèvre, Veau, Ane, Cheval.

Le Cobaye m'a toujours semblé pour les dermatophyties l'Animal d'inoculation de choix, tant par la facilité qu'il donne aux manipulations, que par la fidélité de ses réactions positives. Mais on doit éliminer, au fur et à mesure, ceux qui ont servi, puisqu'une seconde inoculation ne prend plus sur eux, la première étant vaccinale.

En général les auteurs ont pratiqué leurs inoculations par friction rude, sur une région préalablement tondue et grattée ou scarifiée pour

chute des poussières lorsque l'ensemencement sera pratiqué, et qu'on attendra pendant des semaines, le développement, complet de la culture.

(') Je rappelle que les tubes que nous utilisons sont des tubes de 18 centimètres de Ions.

traumatiser l'épidémie. La friction est pratiquée avec un tampon d'ouate hydrophile sur lequel on a placé un fragment de la culture adulte à inoculer.

Voici la technique dont nous nous servons constamment : Une surface grande comme une pièce de deux francs est tondue, aux ciseaux, entre les deux épaules de l'Animal.

Sur cette surface, on pratique, en triangle, trois piqûres avec la pointe flambée d'un scarificateur. Et, dans chaque petit trou, on insère une minuscule parcelle de la culture à inoculer.

Les lésions traumatiques qu'on a ainsi faites s'éteignent en quatre à six jours. Pour la plupart des cultures, ce n'est qu'après 8-12 jours qu'on aperçoit, autour de chaque point d'inoculation, une aréole rouge de o à 4 millimètres de diamètre qui s'agrandit. Une squame sérocroûteuse apparaît, qui s'épaissit, de jour en jour. Après trois jours, c'est une croûte, emprisonnant les poils par touffes. Si on enlève cette croûte, elle laissera, à découvert, une lésion épidermique humide. Si on laisse la lésion évoluer, cette croûte tombera, dix ou quinze jours après sa naissance, emportant ce poil avec elle, et laissant une aire ronde, sèche, propre, sur laquelle l'épidémie corné est déjà refait. A ce moment cette surface est peladoïde bien plus que trichophytique, car sur le Cobaye, dans presque tous les cas que j'ai vus, le poil tombe entier et ne se brise pas. Lorsque la croûte est tombée, la lésion glabre ne laisse plus percevoir, autour d'elle, qu'un bourrelet qui s'efface peu à peu. En général les lésions trichophytiques d'inoculation sur le Cobaye sont guéries spontanément un mois après l'inoculation.

On est amené quelquefois à inoculer à l'Animal un cheveu ou poil teigneux. La chose est on ne peut plus facile. On fait, dans la peau, un trou avec une aiguille, et, dans ce trou, on implante le cheveu teigneux. On provoque ainsi la naissance d'une teigne qui se comporte exactement comme celle qu'on provoque par l'inoculation de la culture.

L'examen microscopique direct des lésions provoquées chez le Cobaye n'est pas sans présenter quelques difficultés. C'est de 10 à 15 jours après l'inoculation, que les poils parasités sont le plus faciles à mettre en évidence. Parmi les poils que la croûte englobe, un ou deux sont malades, sur 8 ou 10 qu'on examine. Comme dans toutes les trichophyties animales, le parasite se cantonne au niveau de la portion radiculaire du poil, et cette portion chez l'Animal est toujours très courte, de un ou deux millimètres de long, pas davantage.

Dans l'examen de la squame, le parasite est ^ordinairement plus aisé à mettre en évidence, surtout dans une lésion en accroissement et en activité. Les préparations sont à faire, d'ailleurs, comme celles du cheveu humain ou de la squame humaine.

La culture de ces lésions s'obtient par les mêmes méthodes que la culture du cheveu humain. Mais, la fourrure des Animaux domestiques étant constamment souillée de germes de moisissures banales, il faut n'ensemencer que le millimètre inférieur de chaque poil, en 2 ou o parcelles, comme je l'ai dit.

On peut chercher aussi à obtenir la culture en série, par passages successifs d'un Animal à un autre de même espèce, ou d'espèce différente, ma : s la maladie chez l'Animal est en général bénigne, et se guérit spontanément; aussi ces passages successifs ne peuvent-ils aisément se réaliser qu'avec les parasites les plus actifs de la série.

Les inoculations d'herpès circiné sur l'Homme ne demandent aucune technique particulière ; on peut les faire par frottis, grattage ou piqûre vaccinale, avec insertion d'une parcelle de culture entre les deux lèvres de la piqûre. L'incubation de la maladie demande de Il à 15 jours avant l'appanitirodu point érythémateux indiquant que l'inoculation est posilive.

De V inoculation des culture* d'ancienne extraction humaine ou animale. — Il est tout à fait certain que beaucoup de Dermatophvtes, dont la culture est depuis longtemps conservée au laboratoire, même si ces cultures ne sont pas devenues pléomorphiques, et si elles ont conservé les organes de fructification qu'elles avaient à l'origine, cessent de devenir inoculables, alors qu'ils l'étaient aisément jadis. A ce sujet, il faut diviser les Dermatophvtes en trois groupes.

Le premier renferme les espèces qui demeurent toujours aussi aisément inoculables, quel que soit le temps depuis lequel on les cultive, au laboratoire, en milieu artificiel. Ainsi paraissent être les Trichophytons gypseum.

Le deuxième groupe, le plus nombreux, est fait des cultures qu'on inocule aisément, lorsqu'il n'y a pas très longtemps qu'on les cultive en milieu artificiel, mais qui perdent peu à peu leur inoculabilité. Tel est, "par exemple, le Microsporum equinum de Bodin (')•

Le troisième est fait des cultures difficilement inoculables même quand on vient de les obtenir en milieu artificiel, et qui très promptement ne peuvent plus être inoculables. 11 est à remarquer, en ce qui concerne ces espèces, que certains exemplaires s'inoculent assez aisément alors que d'autres sont peu ou point inoculables, et cela sans différences apparentes, ni mycologiques, entre leurs cultures Ainsi en esl-il pour les cultures de Microsporum Audouïni, par exemple. 11 esl à remarquer aussi que, pour beaucoup d'espèces dont la culture

(') M. Pelagatti (I trichophyton délia provincia di Parma 1896) affirme qu'une culture sur pomme de lorre ost toujours virulente et qu'un Trichophyton, qui a perdu sa virulence, la récupère sur vr- milieu. C'est un l'ait que }r n'ai pas vérifié,

LA QUESTION DU PLEOMORPHISME DES DERMATOPHYTES. 119

est peu ou pas inoculable, on obtient des inoculations, beaucoup plus facilement, en inoculant directement un cheveu ou un poil malades (Micrasporurn Audouïni), ou un fragment de godet [Achorion Schônleïniï).

LA QUESTION DU PLEOMORPHISME DES DERMATOPHYTES

Pour la compréhension de nombre de faits qui vont suivre, je me trouve obligé de placer ici l'étude de la question du pléomorphisme chez les Dermatophyles, question qui semblerait plus logiquement traitée dans le chapitre concernant la Biologie de ces parasites.

A la lecture, on comprendra que les cultures de Dermalopbytes ne donnent des résultats intelligibles que quand on a d'abord, une fois pour toutes, écarté du sujet les causes d'erreur provenant de leurs al l érali ons pléomorph i ques .

Toute culture trichophy tique quon laisse vieillir présentera des altérations et des déviations du type formel qu'elle a fourni tout d'abord.

1° Altérations de sénilité. — Toute culture dermatopbytique passant « par un premier stade de jeunesse, par un second d'âge adulte et par un troisième de sénilité,... plus une culture vieillit, plus sa forme s'altère, et c'est d'abord par l'exagération de ses caractères propres, que sa vieillesse se démontre ». Par exemple, « si la culture formait normalement des replis concentriques, ces replis s'accusent et se boursouflent. Si sa surface était craquelée, elle devient fîssuraire, etc.... » « Très souvent aussi la culture rencontre la paroi du verre... qui l'enserre, la forçant à des contournements étrangers à sa forme propre »... « toutes ces altérations, quels que soient leur mode d'origine, leur nature et leur forme, ont toutes un point commun qui est essentiel, c'est que leur réensemencement sur milieu neuf les ramène au type jeune de la culture-mère dont elles sont issues ('). »

2° Déviations pléomorphiques. — En regard de ces altérations morphologiques passagères des vieilles cultures de Dermatophytes, il faut placer les déviations pléomorphiques définitives de ces cultures et que de nouvelles cultures perpétueront. « Celles-ci diffèrent essentiellement des précédentes, en ce que la réimplantation, sur milieu neuf, leur conserve la nouvelle forme qu'ils ont acquise. Cette différence est considérable. »

Qu'on suppose une culture trichophytique pure, dans sa forme typi-

(M La Pratique. dermatologique. Articles Dermatophytes. Tome I, 1900. p. 791.

Fig. 1. — Apparition du duvet pléomorphique sur une culture adulte de Trichophyton. •

que, sur milieu d'épreuve. Elle a atteint ses dimensions normales, elle a six semaines d'âge :

« Sur un point quelconque de sa surface, et le plus souvent en son

centre, on aperçoit un jour une petite touffe délicate de duvet blanc, qui semble superposée à la culture-mère. De jour en jour, ce duvet grandit en hauteur et en surface, beaucoup plus vite que la culture-mère, parvenue à peu près à son maximun de développement, à cette époque.

Il la réouvre partiellement, il peut atteindre sa périphérie, s'implanter dans le milieu nutritif, comme une moisissure étrangère, et pousser activement, audelà du bord de la culture-mère sur laquelle il a toujours pris naissance. Quand on l'examine à l'œil nu ou à la loupe, ce duvet a ses caractères propres, entièrement distincts de ceux de sa culture-mère, il est d'un blanc pur, il est duveteux sur une culture poudreuse. Enfin, même, quand il a dépassé la périphérie de la culture-mère et qu'on l'examine par transparence au travers du milieu, son port, sa couleur, ses rameaux immergés diffèrent entièrement de la culture d'origine (fig. 1 et L2). »

« Qu'on prenne maintenant une parcelle de ce duvet blanc à la baguette de platine, qu'on l'ensemence sur un milieu neuf, il gardera sa forme de duvet, son port, sa couleur propre entièrement dissemblables de la culture originelle, à laquelle aucun réensemencement ne le fera revenir. On se trouve avoir ainsi, sans aucune faute de technique, deux êtres entièrement disparates, issus d'une même graine d'origine (fig. 5 et 4). »

« Et comme... il est extrêmement facile de conserver,... pendant des années, les cultures originelles dans leurs formes originelles, j'ai, dès à présent, pour un grand nombre de Trichophytons les deux formes : la forme primitive, d'une part, et, d'autre part, la forme pléomorphique, duveteuse et blanche. » Et « il est toujours possible, avec une culture d'origine,... d'obtenir le duvet blanc pléo-

Fig.2.— Duvet Manc pléomorphique au centre d'une culture d'Épidermophyton inguinale de ôOjours, sur milieu maLosé. — Culture de Sal)ouraud; cliché de Noire.

LA QUESTION DU PLEOMORPHISME DES DERMATOPHYTES. 121

Fig. 5. — Microspovum felineum (Fox et Blaxall, 1898). — Culture de trois semaines sur gélos peplonel, glucose i °/0; culture du laboratoire; cliché de Noire.

morphique, sans que la culture en milieux nutritifs artificiels ait jusqu'ici permis de remonter de la forme pléomorphique duveteuse blanche à la culture...

originelle » (').

On conçoit toutes les erreurs que de pareils faits rendent possibles dans l'étude des teignes.

1° Si on laisse vieillir, sans une surveillance continue et des réensemencements perpétuels, des cultures de Dermatophytes, la collection en est complètement ruinée en quelques mois, parce que les cultures, lorsqu'on les renouvellera, auront perdu tout à fait leurs caractères propres, originaux, et qu'on ne pourra pas les leur faire récupérer.

L2n Tant que ce* obstacle des altérations pléomorphiques existera, les

dermatologistes, qui s'occupent de ces questions, auront , en toute bonne foi, la plus grande peine à s'entendre, car il leur arrivera forcément de comparer des cultures primaires à des cultures pléomorphiques, et de les croire d'espèces différentes, alors que ce seront seulement des formes diverses d'une même espèce.

3° Enfin, tant qu'on n'aura pas écarté des études de cryptogamie dermatologique ce problème du pléomorphisme, certains auteurs pourront aussi, en toute bonne foi, s'imaginer que des espèces cryptogamiques, en réalité différentes, sont dérivées primiti-

Fig. i. — Forme pléomorphique duveteuse du Microsporum felineum (Fox et Blaxall). Culture de même âge et sur même milieu que la précédente. Culture du laboratoire : cliché de Noire.

(>) Loc. rit., p. 702-0i.

vement d'une même graine et ne diffèrent que par transformation pléomorphique. Cette opinion a été maintes fois exprimée, au début des études sur le sujet. Tout cela montre l'importance des faits de pléomorphisme dans l'étude des teignes en général. Pour les résumer on peut dire :

« Un très grand nombre de Tri chophy tons, d'espèces distinctes et fixes, stables en leur forme spécifique, peuvent dans certaines conditions physico-chimiques donner lieu, les unes comme les autres, à une forme pléomorphique qui est un duvet blanc. Ce duvet blanc, à son tour, est fixe en sa forme, et stable indéfiniment. La culture le reproduit en duvet blanc, tout à fait distinct de forme et d'aspect de sa culture-mère. La culture en milieu artificiel a été incapable jusqu'ici de le ramener à sa forme mère. »

« Ajoutons encore que ces duvets blancs, issus des Trichophytons les plus dissemblables, se ressemblent 'entre eux plus qu'ils ne ressemblent à leur culture d'origine, plus aussi que leurs culturesmères ne se ressemblent entre elles. »

Valeur mycologique et signification des duvets blancs pléomorphiques des Dermatophytes. — Que sont ces duvets pléomorphiques dans la vie des Dermatophytes? Représentent-ils vin progrès ou une régression? Ils représentent, à n'en pas douter, une régression.

En effet, un grand nombre de ces duvets blancs pléomorphiques sont faits uniquement et exclusivement de filaments mycéïièns grêles sans aucun appareil de reproduction différencié ('). D'autres portent, il est vrai, le long des filaments mycéliens de leur duvet pléomorphique, sur de très grandes longueurs, de petites spores latérales sessiles ou pédiculées, facilement déhiscentes, et montrent de grosses spores rondes, libres dans la culture, dont le mode de naissance n'est pas évident. Mais les plus dégradés des duvets pléomorphiques n'ont plus que des organes végétatifs et pas d'organes de reproduction. Et les plus différenciés ne montrent encore que des organes de reproduction simplifiés et rudimentaires si on les compare aux organes de reproduction des cultures primaires dont ils sont issus.

Tous les Dermatophytes ne fournissent pas également un duvet pléomorphique. La facilité, la constance et la promptitude avec lesquelles une espèce dermatophytique donne lieu à son pléomorphisme blanc diffèrent avec chaque espèce.

L'une d'entre elles (2) en fournit si constamment et si vite qu'il est difficile de garder longtemps sa culture primaire pure de tout pléomorphisme. D'autres en fournissent moins vite, mais tout aussi con-

f1) On le verra pour les Microsporums animaux : lanosum, felineum. equinwm, (2) Epidermophyton inguinale.

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