CRYPTOGAMIQUES

Le rôle accessoire des commensaux du trichophyton étant prouvé, chercher la raison bio-chimique de leur association devient secondaire. Ce qui importe est de trouver une technique permettant de séparer l’une de l’autre les semences mêlées.

Troisméthodes sont en présence dont les moyens comme les résultats diflèrent; nous les étudierons successivement :

a) La première a été préconisée par Krâl, de Prague, pour le favus. Elle est identique à la méthode ordinaire de séparation des bactéries, basée sur la dilution des semences; mais, en raison de la cohésion spéciale des éléments mycéliens,cette dilution doit être précédée par un « broyage mécanique ». Nous appellerons l’ensemble de ces procédés : Méthode de Krâl;

p) La seconde méthode s’appuie d’abord sur le pouvoir électif des milieux; mais, comme son dernier temps est une séparation analogue aux séparations bactériennes, on peut la désigner sous le nom de méthode mixte;

y) La troisième n’est pas à proprement parler une méthode de séparation. C’est la culture des semences impures sur des milieux qui ne permettent que le développement d’une seule des espèces mêlées. C’est une méthode de sélection par le milieu.

A. Méthode de Krâl.

1° On prend une de ces lames porte-objets excavées en leur centre et désignées communément sous le nom de « cellules ». On la flambe avec grand soin et on la laisse refroidir, sa concavité tournée en bas;

2° Quand elle est froide on la retourne. Et on dépose dans la cellule :

a) La matière impure d’ensemencement (fragment de culture mixte ou poil trichophytique);

p) Gros comme un grain de chènevis d’acide silicique pulvérisé et stérile. Cela étant fait, très rapidement, avec une baguette de verre dont l’extrémité est dépolie, et qu’on a stérilisée par flambage, on mélange et on broie ensemble la poudre inerte et la semence;

3° Quand le broyage est effectué, on vide tout le contenu de

la cellule dans un tube de moût de bière. Puis, en agitant longuement ce tube, on répartit dans toute la masse du liquide, les semences divisées;

4° Ce tube sert alors à l’ensemencement immédiat de cinq ou six tubes de gélatine-gélose liquéfiée, dans lesquels on porte, suivant la grosseur de la semence primitive, de deux à quinze gouttes du moût de bière. Dans ces nouveaux tubes, la semence est de nouveau répartie par de petites secousses imprimées au tube.

On verse alors chacun d’eux successivement dans une boîte de Pétri ou une cellule de Jôrgensen, au fond de laquelle le liquide se coagule en une couche mince.

Sitôt la coagulation opérée, on renverse la boîte de Pétri ou de Jôrgensen sous le microscope, et avec un faible grossissement on en parcourt toute la surface en recherchant une spore isolée. Cette spore une fois trouvée, sa place est marquée à l’encre. On attendra la naissance de la colonie, et on en reprendra au bout de quelques jours une semence qui sera pure.

Cette méthode qui, exposée succinctement, ne paraît pas très compliquée, l’est effectivement beaucoup.

En effet, le broyage à ciel ouvert et le coulage dans les cellules exposent, on le comprend, à l’intrusion de toutes les moisissures de l’air.

De plus, suivant la grosseur ou la nature de la première semence prise, le nombre des germes dans les dilutions finales sera très restreint, ou au contraire considérable.

En troisième lieu, si cette première semence est un fragment de culture, on trouvera, dans les boîtes de Pétri, cinquante rameaux mycéliens composés encore d’un très grand nombre de cellules, pour une spore isolée ou une cellule mycélienne. Or celles-ci seulement peuvent servir de point de départ à une culture certainement pure.

Ensuite, l’expérience prouve que les cellules mycéliennes isolées sont très loin de pousser toutes: un grand nombre sont mortes après dilacération, ou sans être mortes ne croissent pas. On s expose donc à marquer dix cellules isolées sans en obtenir aucune culture.

En dehors de toutes ces chances à courir, il faut mentionner la difficulté spéciale des opérations de dilution et de coulage.

Il faut que ce premier tube de moût de bière employé soit

ANALYSE EXPÉRIMENTALE 45

chauffé, ou bien sa répartition dans les tubes de gélatine-gélose les solidifiera.

Si, pour simplifier ces opérations, on emploie des tubes de gélatine simple, comme toutes les moisissures et le trichophyton la liquéfient, on s’exposera à voir Faire de liquéfaction d’une grosse colonie envahir un point où Ton attend la germination d’une spore isolée.

Si, comme on est conduit à le faire, on emploie une gélatinegélose fusible à 38°, il ne faudra pas dépasser beaucoup ce point de fusion pour stériliser sinon les spores (38°), au moins les cellules mycéliennes (42°-45°).

Enfin il ne faut pas croire que la recherche microscopique d’une spore isolée sur le fond de cinq boîtes de Pétri soit une chose facile.

Même à un faible grossissement, c’est une surface énorme à examiner attentivement, et qui, de plus, si mince qu’on suppose la couche de gélatine, a toujours une certaine profondeur.

Il n’est pas jusqu’au procédé d’indication des spores choisies, qui ne présente une certaine difficulté, moindre pour les cellules de Jôrgensen qui sont quadrillées par millimètre carré, que pour les boîtes de Pétri, mais encore difficile pour toutes.

Ce procédé est donc un procédé d’exception; cependant, restreint à certains cas, il n’en demeure pas moins très utile.

L’obtention d’une culture pure par ces moyens est presque facile, quand la semence prise est un cheveu, et surtout quand il s’agit d’un trichophyton à mycélium fragile. (Yoirchap. II, | III.)

Car, dans ce cas, on n’est pas exposé à rencontrer de fragments mycéliens, mais seulement des spores plus ou moins nombreuses, parmi lesquelles on en trouve toujours beaucoup de solitaires.

De plus, il faut convenir que cette méthode est plus rigoureuse que n’importe quelle autre, parce qu’on a pu voir la spore isolée , dont la culture est issue et d’où procèdent toutes les culturesfilles.

Or, en admettant qu’on puisse trouver une nouvelle méthode plus pratique de séparation pour des cas donnés, il est toujours d’une absolue nécessité de comparer les résultats qu’elle fournira à ceux que donne une méthode difficile, mais absolument rigoureuse.

LES TRICHOPIIYTIES HUMAINES

B. Méthode mixte.

La méthode que je propose paraît théoriquement moins exacte: elle semble moins prompte aussi, mais peut-être estelle plus pratique.

Je la déclare d’avance imparfaite, en ce sens que si les résultats quelle fournit sont bons pratiquement, on ne peut en être sûr chaque fois qu’après un assez long temps.

En outre, elle est quelquefois infidèle, quand on ne la suit pas strictement.

Enfin on n’a pas avec elle la certitude que donnerait une culture partie d’une spore isolée qu'on a vu germer solitairement sous le microscope, comme dans la méthode de Kràl.

En revanche, elle est bonne en ce qu’elle ne demande aucun effort de technique ni de patience. Elle permet, avec une pratique suffisante, d’épurer ensemble en quelques semaines une cinquantaine de cultures mixtes.

À l’origine des études bactériologiques, M. Pasteur a isolé le vibrion septique par d’autres méthodes que les méthodes de dilution. Kitasato a repris des méthodes analogues à celles de M. Pasteur pour la séparation du microbe de Nicolaïer, et il y est parvenu, alors que les essais de séparation par dilution avaient constamment échoué. C’est un procédé de cet ordre que j’emploie. Il s’appuie non plus sur des manœuvres mécaniques , mais sur la physiologie des êtres qu’il s’agit de séparer.

J’ai dit que le moût de bière double était un excellent milieu de culture pour le trichophyton, un milieu médiocre pour ses commensaux. Partant de la racine du cheveu, j’ensemence un tube de moût de bière double (18 grammes de maltose 0/0) par piqûre.

Sitôt qu’une touffe de duvet a paru, je l’effleure de la baguette de platine, et je repique cette culture sur le même tube à 1 centimètre au-dessus de la première colonie.

Quand la deuxième touffe de duvet s’est formée, j’en reprends un atome avec la baguette de platine, et avec elle j ensemence en deux stries parallèles un tube de pomme de terre de Roux.

Quand cette culture est devenue adulte, elle paraît absolument pure. Elle ne l’est pas cependant, mais le trichophyton a poussé le premier.

ANALYSE EXPÉRIMENTALE 47

Je prends alors quatre tubes de moût de bière, et je les ensemence avec une parcelle de la culture sur pomme de terre prise pour chacun en un point différent, — en ayant soin de marquer chaque tube d'un numéro correspondant à un numéro semblable que porte le point même de la pomme de terre d’où sa semence est issue.

La pomme de terre et les quatre tubes sont conservés. Au bout d’un mois, en divers points des stries de la pomme de terre, le commensal du trichophyton est apparu, sous la forme de petits bouquets blancs très espacés.

Si l’un de ces bouquets est survenu près d’un point où une semence avait été prise, le tube correspondant est sacrifié.

Au moins deux ou trois des tubes de moût de bière sont purs. On choisit celui dont le point d’origine sur la pomme de terre est le plus éloigné de toute colonie du commensal. Et c’est lui qui fournira les semences à venir, les autres sont détruits.

En agissant ainsi, c’est à peine si une fois sur dix ou quinze opérations de ce genre on retrouve le commensal trichophytique dans une culture subséquente, on en est quitte pour recommencer.

On objectera que chacune des premières cultures sur moût de bière demandant six jours, la culture sur pomme de terre en demandant quinze, il faut attendre en tout environ deux mois avant d’obtenir une culture pure.

Cela est vrai, mais quand il s’agit d’une centaine de purifications de ce genre, chacune a demandé sept tubes de culture et une heure de travail très simple. Par la méthode de Krâl, telle que je l’ai pratiquée du moins, la même opération (sans parler des échecs préliminaires) demande un travail pénible d’une dizaine d’heure environ pour chaque culture.

Voici la raison de toutes les opérations précédentes :

1° Dans la première culture, en six jours le trichophyton s’est développé presque seul ;

2° A plus forte raison dans la seconde ;

3° Les stries sur pomme de terre répandent sur une grande surface la semence prise. Or, la pomme de terre est, de tous les milieux, celui où la culture comparative du trichophyton et de ses commensaux prend les aspects les plus divergents 1 .

1. Dans une culture où le trichophyton et ses commensaux ont poussé, on les distingue les uns des autres à plusieurs mètres de distance.

48 LES TRICHOPIIYTIES HUMAINES

Il est donc impossible quand les deux cryptogames se sont développés de ne pas voir s’il y a même une trace de la culture d’impureté sur l’endroit où la prise a été faite.

Malheureusement, ce qui force à recourir aux quatre tubes plutôt que d’attendre quinze jours de plus la pousse du commensal sur la pomme de terre, c’est que sur ce milieu le trichophyton meurt en trois semaines.