Recherches «le O’Siillivsin el Tompson. — Le

nombre de recherches qui ont été faites sur les diastases est très considérable, mais seulement un petit nombre d’auteurs se sont occupés d’une manière systématique de l’étude des lois générales de l’action des diastases; je ne m’arrêterai que sur les travaux qui concernent uniquement ce point de la question, ce sont les recherches de O’Sullivan et Tompson, Tammann, Duclaux et Brown.

En 1890, O’Sullivan et Tompson ont publié un travail très détaillé sur l'invertine (‘), dans lequel ils étudient la loi d’action de ce ferment. Une quantité déterminée d'invertine est dissoute dans l’eau, portée à la température de l’expérience et mélangée avec un certain volume d’une solution de saccharose. Pour activer la diastase les auteurs ajoutent une très faible quantité d’acide. A des moments déterminés on prélève une certaine quantité de la liqueur et on la verse dans un verre contenant quelques

(») O’Sullivan et Tompson, Invertase. Journ. of Chem. Soc., 1890, t. LVII, p. 834-930.

gouttes de soude, ce qui suffit pour arrêter l’action de la diastase. Le dosage du sucre se faisait au polarimètre.

Les auteurs construisent la courbe qui représente la marche d’une réaction et la comparent à une courbe logarithmique telle qu’on l’obtiendrait pour l’action d’un acide sur le saccharose. Ils concluent que les deux courbes se confondent presque exactement, d’où ils déduisent que l’action de l’invertine sur le saccharose suit la loi logarithmique des réactions monomoléculaires, par conséquent il y aurait identité pour lés lois d’action des acides et de l’invertine sur le saccharose.

Les auteurs tirent cette conclusion de l’étude des résultats obtenus pour trois expériences de vitesse d’inversion ; ils remarquent que pour ces trois cas il existe de faibles écarts entre la courbe logarithmique et la courbe obtenue, et que ces écarts ont lieu dans le même sens ; mais ils n’étudient pas ce point et ne font pas les calculs de la constante d’inversion K donnée par la relation

Lorsqu’on fait ces calculs pour les expériences de O’Sullivan et Tompson, on voit que la valeur de K ne reste ' pas constante, mais qu’elle croît régulièrement depuis le début jusqu’à la fin (Voir les résultats p. 32).

On voit que les valeurs de Iv augmentent d’une manière régulière, donc la loi suivie pendant une inversion n’est pas exactement la loi logarithmique. Mais l’erreur principale commise par O’Sullivan et Tompson dans leur assimilation de l’action de l’invertine à celles des acides provient de ce qu’ils n’ont pas étudié l’action de la con-

Proportions interverties

K — - lo£ — t c -a

5 minutes

Première série 0,031

Deuxième série

5 minutes

Troisième série

un —

centration du saccharose qui leur aurait révélé immédiatement une différence profonde entre ces deux aclions. Cette étude a été faite par Duclaux qui a montré l’erreur commise par O'Sullivan et Tompson dans leur conclusion. Mais avant de parler des recherches de Duclaux, nous examinerons les travaux de Tammann parus simultanément avec ceux de O’Sullivan et Tompson.

î). Recherches <le Taiiiniaiin. — Tammann a consacré trois mémoires (') à l’étude des lois d'action des diastases. Il rapporte des expériences faites avec l’émulsine et l’invertine et examine l'influence de toute une série de facteurs différents.

Il cherche à montrer d’abord que les actions de ces deux ferments ne sont pas complètes. Une quantité donnée d’émulsine ne transforme qu’une certaine proportion d’amygdaline,desalicine, arbutine, aesculine ; de même une quantilé déterminée d’invertine ne peut transformer qu’une partie du saccharose auquel elle est ajoutée. Celte proportion limite varie avec la température, la quantité de ferment et la quantitéde substance à transformer; elle dépend également de l’accumulation des produits delà réaction, de sorte que, si on élimine ces produits, la réaction progresse davantage.

Cette proportion limite n’est pas, d’après Tammann, un état d’équilibre, puisque, en ajoutant une certaine quantité des produits de la réaction, on ne voit pas la limite rétrograder.

Cet ensemble de résultats qui conduisirent Tammann à

(>) Tammann, Zeitsch. f. physik. Chem. Ill et XVI11 ; Zcit. f. physiol. Chem. XVI.

l’énoncé de la loi générale que les actions diastasiques sont incomplètes, est composé d’expériences n’ayant pas toutes la môme valeur. A coté d'expériences comme celles sur l’action de l’émulsine sur l’amygdaline, l’esculine et l’arbutine qui ne sont pas sujettes directement à des causes d’erreur, nous croyons que certaines expériences sur la salicine et surtout sur l’invertine doivent être critiquées ; en effet, l’auteur a étudié des séries qui duraient plus de 24 heures, et il n’a pris aucune précaution contre le développement des microorganismes.il dit lui-même, en parlant de la limite d’action de binvertine sur le saccharose,

(. Zcits . physiol. Chem ., p. 280) que dans une expérience d’inversion de saccharose qui a été suivie pendant 3046 minutes, environ 500 minutes après le début la solution a commencé à se troubler par suite du développement des microorganismes. 11 n’est pas étonnant que dans ces conditions on trouve que la réaction n’est pas complète.

De même dans certains tableaux sur l’action de l’émulsine sur la salicine qui servent également à montrer que l’action du ferment est incomplète, l’auteur indique pour certaines séries qu’à partir d’un certain moment la lecture polarimétrique était impossible, puisque le liquide était devenu trouble.

Or, nous savons maintenant quel rôle important les microorganismes peuvent jouer dans des réactions diastasiques, soit en augmentant l’activité, soit en l’annihilant complètement.

Donc pour cette première partie du travail de Tammann, nous devons faire des réserves en ce qui concerne l'action de l’invertine sur le saccharose et celle de l’émul-

sine sur la salicine. Nous montrerons plus loin que dans les conditions où nous nous sommes placées, ces actions pouvaient être considérées pratiquement comme complètes.

Relativement au résultat annoncé pnr Tammann que dans les cas de réactions diastasiques limitées il n’y avait pas d’état d'équilibre, nous savons également que les recherches de Ilill, Emmerling, E. Fischer ont démontré le contraire. Pour l’action de la maltase sur le maltose, de l’émulsine sur l’amygdaline et de, la lactase sur le lactose nous avons bien un état d’équilibre, ce qui permet d’obtenir la synthèse de ces sucres et glycosides en partant de leurs produits de décomposition.

Tammann examine ensuite la loi de la vitesse des actions diastasiques et il trouve que cette loi n’est pas simple, elle dépend de la quantité de ferment qui est mise dans la solution. Ainsi, pour l’action de l’invertine sur le saccharose, l'auteur donne dix séries d’expériences faites avec une même quantité de saccharose et avec des quantités d’invertine variant de 0 gr. 920 jusqu’à 0 gr. 001. L'auteur trace les courbes qui représentent les vitesses d’inversion et il voit que la forme de ces courbes est très différente suivant la dose de ferment : pour de fortes quantités d’invertine la vitesse d’inversion va en diminuant continuellement, tandis que pour de faibles doses la vitesse augmente de plus en plus avec le temps.

Ce résultat conduit l’auteur à affirmer que la réaction de l’invertine sur le saccharose suit une loi très complexe, bien différente de la loi logarithmique des acides.

Lorsqu’on examine de plus près les tableaux des expériences de Tammann, on s’aperçoit que pour les quatre

premières séries faites avec des quantités d’invertine égales à 0 gr. 92, 0,46, 0,23, 0,092 la vitesse diminue progressivement depuis le début de la réaction jusqu’à la fin. Dans ces séries, des dosages faits pendant les 500 premières minutes indiquent déjà des transformations de plus de la moitié du sucre. Au contraire, pour les dix séries suivantes, au bout de 500 minutes la transformation est ou bien très faible, ou même n’est pas du tout appréciable, et l’auteur donne les mesures faites après des durées bien plus longues, atteignant 5437 minutes. C’est pour ces durées qui dépassent 24 heures qu'il trouve l’anomalie indiquée plus haut que la vitesse s’accroît avec le temps. Puisqu’il ne dit pas avoir pris de précaution pour empêcher le développement de microorganismes, il est à craindre que ces anomalies ne soient dues à cette couse d’erreur qui s’introduit si facilement dans les expériences avec des milieux nutritifs aussi bons que les solutions de saccharose à 20 0/0.

Nous ne devons donc considérer que les quatre premières séries, et nous voyons en les étudiant que l’expression Tv =- lo g ~ — calculée d’après ces expériences aug-

OL Cl CL

mente d’une manière régulière depuis le début de la réaction. Voici (p. 37) les résultats pour la première série.

Ce résultat est do, ne bien conforme à celui qui a été obtenu par O’Sullivan et Tompson.

Enfin Tammann examine longuement l’action de la température sur les diastases, mais comme nous ne nous occuperons pas du tout de l’action de la température, nous laisserons complètement de coté cette partie des recherches de Tammann.

La conclusion générale de l’auteur est donc que les diastases ne suivent pas les mêmes lois que les actions catalytiques de la chimie générale, et qu il est très difficile de trouver les lois des actions diastasiques.

Durées

Proportions interverties

K = t l0R sr^

14 minutes

10. Recherches de Duclaux. — Duclaux a donné en 1898, dans les Annales de l’Institut Pasteur et dans le IIe volume de sa Microbiologie, un essai général d’une grande importance sur les lois des actions diastasiques. Il commence par critiquer la conclusion de CPSullivan et Tompson relative à l’identité des actions diastasiques et des actions produites par les acides, dette critique repose sur les résultats obtenus pour différentes concentrations en saccharose.

En 1878 Barth (‘) et en 1883 Duclaux avaient vu que si l’on mettait la même quantité d’invertine en présence de doses croissantes de saccharose, les quantités de saccharose interverties au bout du même intervalle de temps

(‘) Barth, Berl. Ber. 1878, p. 481.

dans ces solutions ne variaient pas du tout proportionnellement à la concentration en sucre, comme cela se passe pour l'action des acides ; au contraire, pour des solutions de concentrations moyennes, comprises chez Barth entre 5 et 15 0/0 et chez Duclaux entre 10 et 40 0/0, on trouve que la quantité de sucre interverti est la même quelle que soit la concentration en sucre. Voici, du reste, les résultats numériques de Barth.

Quantité de sucre

Concentration de saccharose interverti au bout de

30 minutes

0gr,5 pour 100 centimètres cubes.

20 milligrammes.

Duclaux remarque que cette propriété n’appartient pas seulement à l’invertine, mais qu’elle se produit pour d'autres diastases, ainsi, par exemple, pour l’amylase de l’urine, d’après les recherches de Dubourg.

Un deuxième point sur lequel insiste Duclaux, c’est le résultat observé par beaucoup d’auteurs qu'au début d’une réaction diastasique la vitesse est uniforme, la quantité de substance transformée est proportionnelle au temps, la courbe représentative est donc une ligne droite ; et ceci a lieu jusqu'à la transformation d’environ 20 0/0 de la totalité du corps qui se trouve dans le mélange.

Enfin Dnclaux insiste sur faction retardatrice exercée par les produits de la réaction.

En se fondant sur cet ensemble de faits, Duclaux construit une théorie générale de faction des diastases. Dès le début de cette théorie, fauteur renonce aux lois de la chimie générale, en affirmant que faction d’une diastase sur le corps à transformer est indépendante de la quantité de ce corps et ne dépend que de la durée. De sorte que la

vitesse a pour expression — = K ; elle est constante, la

courbe est donc une ligne droite.

Mais ceci n’est que la première phase du phénomène, à celle-ci s'ajoute une deuxième qui est l’influence exercée par les produits delà réaction, influence retardatrice qui explique pourquoi la vitesse diminue à mesure que la réaction avance. Cette action retardatrice des produits de la réaction sur la diastase est différente, d’après Duclaux, de faction exercée par le ferment sur le corps à transformer ; elle dépend de la quantité des produits de la réaction ; mais ici encore^, fauteur admet une action se produisant suivant des lois différentes de celle de la loi des masses ; en effet, faction retardatrice serait proportionnelle au rapport des produits de la réaction à la quantité de substance à transformer qui se trouvait au début de la réaction. Ainsi, si à un moment donné nous avons dans le milieu les quantités a — .rdu corps à transformer, a étant la quantité au début, et x est la quantité des produits de la réaction, faction retardatrice serait propor-

tionnelle au rapport -. L’auteur fait cette hypothèse d’une façon absolument arbitraire, elle ne correspond à

aucune considération théorique relative à la nature de cette action retardatrice.

La vitesse définitive de l’action diastasique est représentée par la formule.

ou encore

dx 1 dt a

(Ka —

Kj#).

En intégrant on obtient :

— ü r- lu (Ka — Iv . jc) = 1 constante,

en observant que pour t = 0, x est égal à 0 on obtient la valeur de la constante d’intégration,

O = — lu K«

Ki

de sorte que la formule définitive est :

Kj Kâ — K, x '

Cette formule contient deux constantes K et Kt ; si la réaction observée est totale, ainsi que cela se produit pour l’invertine, on doit avoir lv = KA et la formule précédente prend la forme :

On voit que cette expression diffère de la loi des réactions du premier ordre seulement par le facteur a.

La formule (!) exprime donc, d’une part, que la vitesse d’une réaction est représentée par une courbe logarithmique, ainsi que l’avaient trouvé O’ Sullivan et Tompson, et, d’autre part, que, pour des solutions de concentrations variables en saccharose, la quantité absolue de sucre interverti au bout du même temps est la même dans toutes les solutions, ce qui est conforme aux résultats de Duclaux, Barth et Dubourg.

Plusieurs critiques doivent être adressées à cette formule (ï). D’abord pour ce qui concerne la forme de la courbe, on trouve en réalité que cette courbe est plus rapide que la courbe logarithmique. Les valeurs de K calculées d’après la formule (1) pour une inversion croissent d’une manière régulière depuis le début jusqu’à fin.

Deuxièmement, le résultat sur l’indépendance de la quantité transformée de la concentration en sucre n’est exact que pour des concentrations moyennes ; pour des solutions diluées déjà Barth avait trouvé que la quantité de sucre interverti après un certain temps était de plus en plus faible, à mesure que la solution devenait de plus en plus diluée. Les expériences de Tammann (p. 315 et 316) confirment le même fait pour l’action de l’émulsine sur l’amygdaline et de l’invertine sur le saccharose. Enfin les recherches de Brown et celles que nous rapportons plus loin montrent également que le résultat de l’indépendance de la concentration n’est vrai que pour les solutions de concentrations moyennes.

Enfin la théorie de Duclaux présente ce défaut qu’elle suppose deux lois d’action différentes pour l’action de la diastase sur le corps à transformer et pour l’action des produits de la réaction sur la diastase, et ces deux lois différentes ne correspondent ni l’une ni l’autre à la loi d’action des niasses. Les diastases sont donc envisagées comme obéissant à des lois sui generis , constituant ainsi une classe devant être mise à part des phénomènes de la chimie générale.

I I . Recherches de A. Brown. — Passons maintenant aux recherches récentes publiées par Adrian J. Brown ('). Cet auteur avait montré, en 1892, que l’action de la levure de bière sur le sucre dans la fermentation alcoolique ne suivait pas la loi logarithmique des acides, mais que la vitesse était représentée par une ligne droite. Il reprend la question pour l’invertine; il montre d’abord que si l’on étudie une inversion de saccharose par l’invertine, la vitesse suit une loi plus rapide que la loi logarithmique; l’expression

augmente continuellement depuis le début jusqu’à la fin. Voici (p. 43) les nombres relatifs à deux séries d'expériences de A. Brown.

Ensuite il montre que pour des solutions de concentrations moyennes (de 5 à 30 0/0) une certaine quantité d’in-

(i) Adrian J. Rrown, Enzyme Action. Journ. of. Chem. Soc., avril 1902, p. 373-388.

Proportion interverte

Première série. — 9sr,48 saccharose pour 100 centimètres cubes.

30 minutes

Deuxième série. — 19s1', 28 saccharose pour 100 centimètres cubes

30 minutes

vertine hydrolyse au. bout d’uu temps donné la même quantité de saccharose. Voici des exemples numériques.

Concentration des solutions de saccharose

4yr,89 pour 100 centimètres cubes.

Quantité intervertie après 60 minutes

Ce résultat est bien conforme à ceux de Barth, Duelaux et Tammann. Par conséquent, conclut hauteur, l’invertine

ne suit pas la loi des masses, telle qu’elle s’applique h l’action des acides.

A. Brown essaie ensuite de donner une théorie qui expliquerait l’action de l’invertine. 11 suppose que le ferment forme avec une partie du saccharose une combinaison intermédiaire, qui persiste un certain temps et puis se décompose en donnant le sucre interverti et le ferment primitif. Puisque la combinaison intermédiaire ne se décompose pas immédiatement, mais persiste pendant un certain intervalle de temps, une quantité donnée de ferment ne pourra, donner lieu à ces transformations qu’un nombre limité de fois. Par conséquent, si la quantité de saccharose est forte par rapport à celle de la diastase, la transformation sera indépendante de la concentration en saccharose ; au contraire, si la quantité de sucre est faible, le nombre de transformation par unité de temps n’aura pas atteint le maximum et alors la concentration du sucre aura une influence sur la vitesse de l’inversion. L’auteur arrive donc ainsi à étudier les solutions très diluées et il trouve que l’expérience correspond bien à ses prévisions théoriques ; voici du reste les résultats numériques :

Concentration en saccharose

Quantité intervertie après 60 minutes

2gr,0 pour 100 centimètres cubes. 308

On voit nettement que pour ces solutions diluées la vitesse d’inversion dépend de la concentration en saccha-

rose.

La théorie de A. Brown est très incomplète. Elle suppose d’abord que la combinaison intermédiaire persiste un temps minimum avant de se décomposer, mais l’auteur ne nous dit pas s’il admet que cette combinaison se produit très rapidement et que la décomposition se produit également avec une vitesse très grande; de sorte qu’il est absolument impossible d'écrire les équations du problème. La chimie générale nous enseigne que nous ne pouvons pas admettre la formation rapide d’un composé intermédiaire qui resterait intact quelque temps et puis se décomposerait brusquement ; les phénomènes chimiques

ne présentent pas de discontinuités de cette nature ; ou bien c’est la formation du composé intermédiaire qui est lente, ou bien sa décomposition est lente, ou bien les deux processus sont lents. Quelle que soit l’hypothèse que nous fassions, nous n’arriverons pas à une formule. qui représente les faits connus sur l’inversion du saccharose, puisque ces hypothèses ne tiennent aucun compte de l’action du sucre interverti sur la vitesse delà réaction.

Or, le sucre interverti ralentit l’action du ferment et A. Brown donne lui-même des expériences à ce sujet, mais il n’en tient aucun compte dans sa théorie. Cette théorie est donc très incomplète et ne permet nullement de prévoir la loi suivant laquelle se produit l’action de l’invertine sur le saccharose.

i‘«. Recherches <le 11. Brown et t*leii<liiiiiin<r. —

Horace T. Brown et Glcndinning (‘) ont publié à la

(’) The velocily of Ilydrolysis of Starch by Diastase with some Homarks on Enzyme Action. Jourv . of. Chem. Soc., avril 1902,]). 388-400

suite du travail de A. Brown des recherches sur l'hydrolyse de l’amidon par l’amylase et ils établissent également une théorie de l’action des diastases.

En ce qui concerne l’hydrolyse de l’amidon, ils montrent que la loi est la même que pour l’invertine ; nous reviendrons dans la suite sur ces expériences. La théorie que développent les auteurs diffère de celle de A. Brown, elle a l’avantage sur la précédente d’être plus complète et de ne pas admettre l’existence de combinaisons qui persisteraient sans se décomposer pendant un temps minimum.

Cette théorie appartient au groupe de réactions catalytiques avec formation de combinaison intermédiaire complète se produisant très rapidement et se décomposant lentement. Nous avons montré précédemment (p. 15) que dans ce cas, si la quantité de catalysateur était faible par rapport à celle du corps à transformer, la courbe de vitesse serait d'abord une ligne droite et deviendrait, au bout d’un certain temps, une logarithmique; de sorte que l’on voit bien que pour des solutions de concentration moyenne la vitesse est indépendante de la concentration en sucre, et au contraire, elle en dépendra pour des solutions diluées.

Cette théorie explique bien quelques points de l’action des diastases, mais elle est incapable de donner une représentation complète de la marche de la réaction ; en effet, le sucre interverti n'entre pas en ligne de compte dans cetle théorie ; les auteurs prétendent que pour des solutions de concentration faibles les produits de la réaction n'ont pas d’action notable, cette hypothèse est contraire aux faits expérimentaux qui seront exposés plus loin. Donnons un

exemple numérique qui montrera que la théorie précédente est incomplète.

Supposons que nous ayons deux solutions de saccharose à 5 0/0 et à 10 0/0; ajoutons dans les deux la même quantité de diastase, nous verrons qu’au bout d’une heure il y aura le même nombre de grammes intervertis dans ces deux solutions, soit 1 gr., 2 dans chacune.

Supposons maintenant que nous ajoutions d’abord à chacune des deux solutions primitives la même quantité de sucre interverti, 5 grammes, par exemple, de sorte que la première solution contiendra 5 grammes saccharose -f- 5 grammes sucre interverti et la deuxième solution 10 grammes saccharose h- 5 grammes sucre interverti. Puisque la quantité de saccharose est bien supérieure à la quantité d’invertine que l’on ajoute à chacune de ces deux solutions, d’après la théorie desauteurson devrait de nouveau s’attendre à voir la même quantité de sucre hydrolysée au bout d’une heure ; l’expérience montre qu’il n’en n’est rien : on trouvera, par exemple, dans la première solution, au bout d’une heure, 0 gr., 8 saccharose hydrolyse et dans la deuxième 1 gr., 0. Il y aura une différence très nette.

Tout un ensemble de faits de ce genre, ainsi que les résultats relatifs à l’action de l’invertine sur le saccharose et de l’émulsine sur la salicine, ne peuvent pas être expliqués par la théorie des auteurs précédents.

1 3. Expériences <1e Ilerzog. — Nous devons enfin mentionner les recherches sur les lois d’action des dias-

lases publiées par Medwedow (') sur les oxydases et par Herzog- (-) sur la fermentation alcoolique.

Medwedew a surtout étudié l’influence de la concentration du ferment.

Herzog a mesuré la vitesse de fermentation alcoolique du glucose et du lévulose parla zymase de Buchner en déterminant la quantité d’acide carbonique mise en liberté au bout de durées différentes. Ces expériences encore préliminaires montrent que l’expression K = \ log — —

reste à peu près constante pendant une réaction, la courbe de vitesse semble être une courbe logarithmique ; mais en comparant les résultats pour différentes concentrations en sucre, on voit que l’action suit la même loi que l’invertine ou la salicine : la valeur de K varie lorsqu’on passe d'une concentration à une autre et le produit ali (qui devrait rester constant d’après la théorie de Duclaux) augmente lorsque la concentration a diminue.

14. Résumé cic riiistoi'ique. — En résumé, l'examen historique précédent nous montre que l’étude expérimentale des lois d’action des diastases n’est, pour ainsi dire, qu’ébauchée ; le nombre d’expériences sysmématiques faites jusqu’ici est trop faible pour qu’on, puisse s’en servir dans le but de construire une théorie quelconque.

Un fait ressort nettement de cet ensemble, c’est que les actions diastasiques ne se produisent pas en apparence de la même manière que les actions produites

(') Pfl. Arch. 63 (1896), p. 249,74 (1899), p. 193,81 (1900). p. 340.

(s) Z eit. physiol. Chem., 37, 1902, 149.

par les acides. Donc, en vertu de ce qui a été dit dans l'introduction, on doit en conclure que si les actions diastasiques sont assimilables aux réactions catalytiques de la chimie générale, elles appartiennent à un autre groupe de réactions catalytiques que celles dues aux acides.

Deux problèmes principaux se posent dans l’étude des lois des actions diastasiques : 1° il faut reprendre systématiquement l’étude expérimentale de la question, en faisant varier les conditions d’une manière aussi complète que possible et en se guidant continuellement par les indications de méthodes fournies par la chimie générale ; 2° cette étude expérimentale terminée, discuter les résultats en se plaçant de nouveau au point de vue des lois de la chimie générale et examiner si l’on ne peut pas arriver à une conception générale des lois des actions diastasiques en s’appuyant uniquement sur la loi de l’action des masses et sans avoir recours à des propriétés sut generis qui seraient dues seulement aux diastases et qui en formeraient une classe de phénomènes à part.

Tels sont les deux problèmes que je me suis proposé d’étudier.