MÉTHODE DE WRIGHT POUR MESURER LA VITESSE DE COAGULATION DU SANG

L'instrumentation nécessaire consiste en :

— Plusieurs tubes capillaires de 30 centimètres de longueur, dont une extrémité, effilée en cône et ouverte, est fixée au moyen d’un peu de cire dans l'extrémité, également effilée en cône, d’un bout de tube à.essai formant entonnoir ;

— Plusieurs tétines à soupapes de Wright ;

— Un bain-marie réglé à 37° et assez profond pour que les tubes puissent y être entièrement plongés en position oblique, la tétine seule dépassant à l'extérieur ;

— Une petite quantité de mercure bien propre.

Les tubes capillaires étant fixés par l’une de leurs extrémités, au moyen d'un peu de cire Golaz, sur le bout du tube qui porte la tétine à soupape, on les marque, avec de l'encre à écrire sur le verre, de deux traits bien visibles à » centimètres de chacune des ouvertures. |

On prend un premier tube ainsi monté. On en presse la

1 On peut préparer soi-même un extrait de têtes de sangsues de la manière suivante : On coupe avec des ciseaux et, dans un flacon contenant 100 centimètres cubes d'alcool absolu, on fait tomber le segment antérieur (tête et cou) d’une dizaine de sangsues. On bouche le flacon et on agite à plusieurs reprises. Après 24 heures on recueille les têtes de sangsues sur un filtre, on les sèche dans le vide et on les broie. On obtient ainsi une poudre, que l’on peut conserver à l'abri de l'air et de la lumière, pour en préparer une macération aqueuse par trituration avec quelques centimètres cubes d'eau physiologique au fur et à mesure des besoins. L’extrait obtenu avec trois têtes de sangsues par kilogramme de lapin suffit à empêcher la coagulation du sang pendant plusieurs heures quand on l'injecte dans les veines. In vitro, une tête par 30 à 50 centimètres cubes de sang représente, en général, une dose convenable. En présence de cet extrait, le sang reste indéfiniment fluide.

tétine pour chasser l'air, on plonge l'extrémité libre du tube dans du mercure et on en aspire, à l’aide de la tétine, juste la quantité suffisante pour remplir le premier espace de 5 centimètres de longueur.

On plonge, aussitôt après, la même extrémité du tube dans une goutte de sang frais prélevé par piqûre (au doigt ou au lobule de l'oreille chez l’homme). On prend soin de laisser le moins de temps possible cette goutte au contact de l'air.

On aspire le sang dans le tube capillaire, de telle sorte qu'il occupe tout l’espace compris entre les deux traits. L'intervalle compris entre l'ouverture libre et le premier trait sera donc occupé par de l'air, et l'intervalle compris entre la tétine et le second trait sera occupé par le mercure.

Immédiatement après, on plonge le tube dans le bainmarie, en position oblique, pour éviter la projection brusque du mercure (sous l'effort de dilatation) dans le petit entonnoir porte-tétine. On l'y laisseun temps déterminé (le temps de coagulation moyen est de 2/30 pour le sang de l'homme adulte, de 1’ à 120 pour le sang de CoHan e), compté par un indicateur à secondes Le délai qu'on s'était fixé (1, 2, 3 minutes ou fractions de minutes) étant expiré, on sort le tube du bain-marie, on en essuie rapidement l'extrémité libre avec le doigt et, par pression sur la tétine, on projette tout son contenu, mercure et sang. sur un Carré de papier à filtrer blanc.

S1 le sang n’est pas coagulé, il forme sur le papier buvard une large tache rouge.

S'ilest coagulé partiellement, on trouve sur la tache des filaments de fibrine plus ou moins volumineux.

Si la coagulation est complète, le bloc de sang projeté s'étale en un petit tube de même diamètre que le diamètre intérieur du tube capillaire et tache à peine le papierfiltre.

Si la coagulation est trop complète {ce qu il faut éviter), le sang ne peut plus être projeté par pression sur la tétine hors du tube capillaire et on est alors obligé de couper celui-ci.

Il est toujours avantageux de faire cette épreuve avec au moins deux tubes, pour préciser le délai de coagulation.

270 RÉACTIONS HUMORALES ET HÉMATIMÉTRIE

La mesure, ainsi effectuée, de la coagulabilité du sang, est toute relative, mais elle fournit des résultats assez EXACtement comparables entre eux.

F. — Pouvoir phagocytaire des leucocytes.

Mesure de l'indice opsonique.

Pour effectuer la mesure de l'indice opsonique d’un sérum, il faut mettre en présence :

1° Des leucocytes ;

20 Une émulsion microbienne convenablement préparée ;

30 Le sérum à étudier.

Ces trois éléments étant mélangés en parties égales, on les porte dans une pipette, à l’étuve à 37°, pendant quinze ou vingt minutes. On fait ensuite des préparations colorées. On compte les éléments microbiens contenus dans un certain nombre de leucocytes et on établit la moyenne du nombre de microbes phagocytés par leucocyte. On obtient ainsi un chiffre qui indique le pouvoir opsonique du sérum considéré. Mais, comme les conditions (concentration de la suspension de leucocytes et de l'émulsion microbienne) changent d'une expérience à l’autre, les résultats obtenus ne sont comparables et ne prennent une valeur que si on les rapporte à un facteur constant, toujours le même dahs toute la série des expériences. Ce facteur constant est représenté par un sérum normal, celui de l'observateur par exemple. Au pouvoir opsonique de ce sérum fémoin, on compare le pouvoir opsonique du sérum pathologique étudié. |

Le chiffre représentant le pouvoir opsonique d'un de ces sérums, divisé par le chiffre représentant le pouvoir opsonique du sérum normal {témoin donne l'indice opsonique.

a) Préparation des leucocytes. — Les leucocytes habituellement employés sont empruntés soit au sang humain, soit à l’exsudat péritonéal du cobaye. L'expérimentateur utilise généralement ses propres leucocytes.

Il lui suflit de se piquer avec un vaccinostyle la face dorsale d’un doigt, près de l’ongle, après avoir ligaturé le

doigt à sa base. Environ 20 gouttes de sang sont recueillies dans un petit tube centrifugeur à fond effilé, préalablement garni de la solution anticoagulante dont voici la formule :

Éauidisitiée be Cotet ss DeuriN HE OQUE Ce GhIDETE CI de SOdIUIN. #9 0 UE RE 8 gr. »

Citrate de soude. |. . . . 2 C'HLE 15 gr.

Il faut 8 ou 10 parties de cette solution, au minimum, pour une partie de sang.

On fait le mélange en renversant et redressant plusieurs fois le tube dont on a obturé l’orifice avec la pulpe du pouce, I] faut avoir soin d'éviter de secouer brusquement, pour ne pas altérer les leucocytes.

On centrifuge, puis on lave le culot. Pour cela on aspire avec une pipette à boule le liquide qui surnage. On verse dans le tube 10 centimètres cubes d’eau salée physiologique que l'on mélange au culot en renversant le tube comme précédemment. et l’on centrifuge de nouveau. Cette opération est répétée trois fois. Puis on enlève tout le liquide. La partie la plus superficielle du culot contient les globules blancs. Afin de la séparer de la couche plus profonde formée des globules rouges, on incline le tube. Les leucocytes de la surface s’étalent alors en surface. Ils sont recueillis par aspiration dans une pipette effilée garnie de la tétine spéciale de Wright, et portés dans un tube à essai court, de très petit calibre (60 millimètres de longueur, 6 ou 7 millimètres de diamètre).

On peut encore se procurer des leucocytes en provoquant, chez le cobaye, la formation d’un exsudat péritonéal par injection d’eau salée, de bouillon, etc. Une ou deux heures après. en piquant l'abdomen du cobaye tenu par un aide, le ventre tendu dirigé en bas, on prélève, à l’aide d’une pipette coudée à pointe effilée, un peu de l’exsudat riche en leucocytes. On recueille celui-ci dans l’eau citratée et on le traite comme il a été dit ci-dessous pour le sang.

b) Préparation de l’'émulsion microbienne. -— On prend une jeune culture en milieu solide de 12 à 24 heures. On en émulsionne une anse de platine avec une

272 RÉACTIONS HUMORALES ET HÉMATIMÉTRIE

baguette de verre dans un tube dans lequel on verse goutte à goutte, quelques centimètres cubes d’eau salée physiologique, de telle sorte que l'émulsion soit bien homogène et légèrement opalescente.

S'il s’agit de bacilles tuberculeux, on prend une jeune culture en bouillon glycériné âgée de 10 à 14 jours. On la” stérilise à l'autoclave à 100° pendant 20 minutes. On iette sur un filtre en papier et on lave les bacilles en versant sur le filtre de l’eau salée physiologique jusqu'à ce que celle-ci s'écoule incolore. Une petite quantité de bacilles (environ 1 centigramme) est alors prélevée sur le filtre et déposée dans un mortier d’agate. On broie doucement et on émulsionne en versant goutte à goutte (tout en continuant le broyage) de l’eau physiologique à l’aide d’une pipette effilée. On obtient ainsi une émulsion laiteuse que l’on rend encore plus homogène en l’agitant dans un flacon stérile avec des perles de verre. On la centrifuge ensuite (pendant quelques minutes seulement) pour la débarrasser des grumeaux.

Cette émulsion homogène est diluée avec de l’eau salée hypertonique à 1 gr. 5 de NaCI pour 100 {c’est le taux le plus favorable), jusqu'à l'obtention d’une concentration microbienne déterminée qu'on apprécie d'après son opalescence, laquelle doit être très légère. Il faut pour cela environ 50 centimètres cubes d’eau salée pour 1 centigramme de bacilles.

L’émulsion ainsi préparée peut être stérilisée à 105° et conservée en tubes scellés qu'on aura soin de bien secouer avant chaque expérience, pour mettre les bacilles en suspension aussi fine que possible.

c) Préparation du sérum à étudier. — On se procure le sang chez l’homme par piqüre de la face dorsale du pouce ou du bord postérieur du lobule de loreille. Le sang est aspiré par Capillarité dans un petit tube à extrémités eflilées dont l’une est recourbée. Quelques gouttes suffisent. On laisse pendant deux ou trois heures le sérum se séparer du caillot et on sectionne le tube au couteau à verre au moment de l’usage. Chez les animaux de Jaboratoire (lapins, cobayes) et aussi chez le bœuf, c'est par piqûre de l'oreille qu'on prélève le sang, en piquant au

niveau d'une des veinules que l’on voit par transparence. Chez la souris et le rat, c’est par section au ciseau du segment terminal de la queue.

Il faut que le sérum soit clair, parfaitement exempt de globules rouges, car la présence de ceux-ci fausse complètement les résultats. Il peut être conservé à la glacière pendant 6 à 7 jours, ce qui permet d'utiliser en une seule séance les sérums recueillis pendant toute une semaine, par exemple, chez le même sujet ou chez divers malades.

d) Technique de la réaction. — Possédant les trois éléments nécessaires. leucocytes, émulsion microbienne, sérum, il reste à les mettre en présence.

On prépare un certain nombre de pipettes capillaires. Il est commode et économique d'employer pour cela des segments de tube de verre de 10 à 12 centimètres de longueur, tels que ceux qui servent à fabriquer les pipettes dans les laboratoires. On les étire en leur milieu en prenant soin que l’effilure soit bien régulièrement calibrée. On sectionne au milieu de la partie effilée et on obtient ainsi deux pipettes de calibre égal.

A deux centimètres de la pointe ouverte, on marque un trait au crayon bleu. On adapte à la pipette une tétine à soupape (de Wright) qui sert à l’aspiration et au refoulement. On aspire une petite colonne d’émulsion bacillaire jusqu'à ce qu'elle affleure au trait de crayon bleu. On laisse alors pénétrer une bulle d'air. On aspire ensuite une égale quantité d’émulsion de leucocytes et on laisse pénétrer une nouvelle bulle d'air. On aspire enfin une égale quantité de sérum.

Le tout est alors refoulé sur une lame de verre et mélangé par une série d’aspirations et de refoulements successifs et, la pipette étant tenue bien verticale, on y réintroduit la totalité du mélange. On scelle l'extrémité du tube à la veilleuse d’un bec Bunsen et on porte à l’étuve à 37°, en position inclinée, pendant 20 minutes ?.

1. Si l’on a souvent à effectuer des déterminations d'indices opsoniques, il est recommandable de se servir de la petite étuve spéciale construite pour cet objet, sur les indications de Sir A. Wright, par la maison Hearson, de Londres (235, Regent Street). On peut se procurer cette étuve, ainsi que les tétines à soupapes pour pipettes de Wright, chez Cogit, 36, boulevard Saint-Michel, à Paris.

MICROBIOLOGIE 18

274 RÉACTIONS HUMORALES ET HÉMATIMÉTRIE

Au sortir de létuve, on brise la pointe de la pipette, on refoule son contenu sur une Jame de verre bien propre en brassant de nouveau, et on fait des étalements sur lames avec le bord d’une autre lame rodée.

Les préparations, séchées pendant quelques minutes à l'étuve, sont alors fixées par l’alcoo! absolu, puis lorsqu'il s'agit du bacille tuberculeux, colorées à froid pendant deux heures à 37°, par une solution de Ziehl contenant seulement 3 p. 100 d'acide phénique. On décolore ensuite par l'alcool acétiqué, on lave à l’eau, on recolore pendant 30 secondes au bleu de méthylène ou à l'hématoxyline.

S'il s’agit d’autres microbes facilement colorables, on se sert du bleu Borrel à l’oxyde d'argent ou, simplement, de la thionine ou du bleu de toluidine. On lave à Feau et on évite la décoloration par l'alcool.

La préparation lavée et séchée (lentement à l'étuve) est portée enfin sous le microscope. On passe en revue 100 leucocytes polynucléaires et on note au crayon le nombre de bacilles contenus dans chaque leucocyte, en inscrivant O0 pour chaque leucocyte qui n’a rien phagocyté.

Si l’'émulsion microbienne n’a pas été faite à une dilution convenable, la phagocytose est trop abondante où ne Fest pas assez, et c’est alors une cause d'erreur dans la numération. Il faudra donc recommencer l'expérience en cherchant à obtenir une émulsion qui donne en moyenne de 2 à 4 microbes phagocytés par leucocyte, en présence d’un sérum de sujet normal.

Dans la numération, il ne faut pas tenir compte des amas de microbes. On ne devra noter que les leucocytes bien distincts et bien colorés.

Certains polynucléaires renferment une grande quantité de microbes qu’il est impossible de compter. Dans ce eas, Wright et ses élèves ont adopté le chiffre 9 invartablement.

On établit le pouvoir opsonique ou quotient leucocytaire de chaque sérum en divisant par 100 le nombre de microbes comptés dans 100 polynucléaires. L'indice opsonique est ensuite déterminé en divisant le pouvoir opsonique d’un sérum pathologique, ou supposé tel, par celui d’un sérum normal témoin qu'on utilise dans toute la série des expériences.

Soit le sérum témoin T, dont le pouvoir opsonique est, par exemple, déterminé aïnsi :

209 microbes d 100 polynucléaires

et les sérums à étudier À et B. Si nous avons : 409 bacilles

Pouvoir opsonique de A : IU0 polynucléaires, = 4 À : : 109 bacilles Pouvoir opsonique de B : .… 10Œ polynuciéaires 1

Les indices opsoniques seront :

Pour le sérum de A : Ponyoir SREPAS de is 224 — 92,00 Pouvoir opsonique de T 2 Pour le sérum de B : ROHYpRE Tee TERRES dei be = 0,5 Pouvoir opsonique de T 2 Nota. — Vis-à-vis du bacille tuberculeux, l’indice opso-

nique des sérums normaux varie de OÜ,80 à 1,20. Chez les malades il s’abaisse au-dessous de 0,80.

La détermination d’un indice pris isolément n'offre aucun intérêt. C’est seulement l’étude de Ia eourbe opsonique d'un malade ou d’un animal qui peut permettrede tirer des conclusions utiles au diagnostic, au pronostie ou aux effets d'une médication.

G. — Mesure de la résistance globulaire. Hémolyse.

La mesure de la résistance globulaire à pour objet de déterminer la fragilité propre des hématies soit vis-à-vis des solutions salines ou médicamenteuses, soit vis-à-vis des sérums normaux ou pathologiques.

a) Résistance des hématies aux solutions salines. — Pour déterminer Ha fragilité propre des hématies provenant du sang d’un malade vis-à-vis du chlorure de sodium par exemple, on prélève, par ponction aseptique à la seringue, 10 centimètres eubes de sang dansune veine du pli du bras et on défibrine aussitôt ce sang par agitation dans un petit flacon stérile contenant des perles de verre

276 RÉACTIONS HUMORALES ET HÉMATIMÉTRIE

Lorsque la défibrination est achevée, — ce qui ne demande que quelques minutes, — on aspire 5 centimètres cubes du liquide avec une pipette graduée stérile et on les verse dans un tube centrifugeur préalablement taré. On marque à l’extérieur du verre, par un trait de crayon gras, le volume ainsi occupé par le sang défibriné et on centrifuge jusqu’à séparation complète du sérum. -

On décante alors celui-ci ; on remplit le tube avec de l'eau salée physiologique à 9 p. 1.000 ; on agite pour remettre les hématies en suspension et on centrifuge de nouveau.

On répète trois fois cette opération qui a pour but de laver les hématies et de les débarrasser complètement de sérum.

Après la troisième centrifugation etdécantation du liquide de lavage, on verse dans le tube une nouvelle quantité d’eau salée physiologique correspondant, aussi exactement que possible, au volume primitif du sang mis en œuvre (5 centimètres cubes), jusqu'au trait de crayon gras marqué à l’extérieur du tube. On agite une dernière fois pour remettre les hématies en suspension bien homogène, et c’est cette émulsion d'hématies lavées dans l’eau physiologique qui sert à effectuer la mesure de la résistance globulaire.

On aura préparé d'avance :

1 série de 12 petits tubes centrifugeurs de 10 centimètres cubes de capacité sur un porte-tubes ;

1 solution de chlorure de sodium pur, fondu, à 10p. 1.000, stérilisée à l’autoclave ;

2 pipettes effilées stériles permettant de répartir les liquides par gouttes égales.

Dans chacun des 12 tubes, on versera d’abord un nombre progressivement croissant de gouttes d’eau distillée en commençant par 10 gouttes dans le 1° tube eten augmentant de 2 gouttes d’un tube à l’autre. Le 12° tube recevra ainsi 92 gouttes.

Avec la même pipette, on versera ensuite dans chaque tube un nombre progressivement décroissant de gouttes de solution salée à 10 p 1.000, en commençant par 40 gouttes dans le 1°" tube et en diminuant de 2 gouttes d’un tube à l’autre. Le 12° tube recevra ainsi 18 gouttes.

La proportion de chlorure de sodium pur contenue dans

chaque tube se trouve être ainsi de 0,80 p. 100 dans le 1e tube, puis successivement 0.76 0,72, 0,68, 0,64, 0,60, 0,56, 0,52, 0,48, 0,44, 0,40, et enfin 0,36 p. 100 dans le douzième.

On agite légèrementle support pour mélanger les liquides, puis avec la seconde pipetite on aspire l’émulsion de sang défibriné lavé et on en laisse tomber une goutte dans chaque tube. Une petite secousse assure le mélange des liquides.

On laisse en contact 30 minutes à la température de 370, puis on centrifuge rapidement tous les tubes et on lit les résultats.

Suivant que l’hémolyse est nulle, partielle, intense ou totale, on la note par les chiffres 0, 1, 2 et 3, ou par 1 à 3 signes +.

A l’état normal, l’hémolyse se produit à partir de la concentration moyenne de 0,44 à 0,48 p. 100 de NaCI.

Dans certaines maladies, principalement dans les ictères hémolytiques, la fièvre bilieuse hémoglobinurique, la chlorose, etc., les hématies sont particulièrement fragiles. L’hémolyse se produit alors parfois avec des concentrations salines supérieures même à 0,80 p. 100

On peut mesurer par la même méthode la fragilité ou la résistance des hématies en présence de différents sels ou de substances médicamenieuses, par exemple de la quinine.

Lorsqu'on effectue la mesure de la résistance globulaire, il y a toujours intérêt à étudier séparément les hémalies et le sérum d’un même sang pathologique ; les hémalies vis-à-vis du chlorure de sodium ; le sérum vis-à-vis d'hématies d'un sanc humain normal.

b) Résistance des hématies à l’action hémolytique des sérums. — Les sérums normaux sont toujours anti-hémolytiques. Au cours de certains états pathologiques ils deviennent, au contraire, hémolytiques.

Pour mesurer le pouvoir hémolytique d’un sérum, on se sert d’une méthode tout à fait semblable à celle qui a été décrite ci-dessus. Mais il est indispensable que les hématies lavées dont on doit faire usage proviennent d'un sujet normal.

C'est sur ces hématies lavées et émulsionnées dans l’eau salée physiologique qu'on fera agir des quantités progressi-

278 RÉACTIONS HUMORALES ET HÉMATIMÉTRIE

vement décroissantes du sérum pathologique à étudier.

Ce sérum sera employé soit frais, non chauffé, soit après inactivation par 80 minutes de chauffage au bain-marie à 56° ; mais, dans ce dernier cas, il faudra l'activer par addition d’une quantité constante de sérum frais de cobaye (alexine), par exemple 2 gouttes pour chaque tube.

Cette dernière manière de procéder est la plus précise, car si l’on fait usage du sérum pathologique frais, la quantité d’alexine qu'il contient varie pour chaque tube.

On opérera donc de la manière suivante :

Dans chacun des douze petits tubes on verse d’abord un nombre progressivement croissant de gouttes d’eau salée physiologique à 9 p. 1.000, en commençant par 10 gouttes dans le 1° tube et en augmentant de 2 gouttes d’un tube à l’autre. Le 12° tube recevra ainsi 32 gouttes.

Avec la même pipette, on versera ensuite dans chaque tube un nombre progressivement décroissant de gouttes du sérum pathologique à étudier sérum inactivé par chauffage à 56°), en commençant par 40 gouttes dans le 1% tube et en diminuant de 2 gouttes d’un tube à l’autre. Le 12° tube recevra ainsi 18 gouttes.

La proportion de sérum contenue dans chaque tube se trouve être ainsi de 8 p. 100 dans le 1°" tube, puis successivement de 7,6, 7,2, 6,8, 6,4, 6,0, 5,6, 5,2, 4,8, 4,4, 4,0, et enfin de 3.6 p. 100 dans le 12.

Avec une seconde pipelte on laisse ‘ensuite tomber dans chaque tube 2 gouttes de sérum fraïs de cobaye (alexine). On agite légèrement pour assurer le mélange. Puis, avec une troisième pipetle, on introduit dans chaque tube une goutte d'émulsion homogène d’hémalies normales lavées, préparées comme il a été dit ci-dessus.

Une petite secousse assure le mélange des liquides. On lasse en contact pendant 30 minutes à la température de 37° et on lit les résultats qui sont généralement déjà assez apparents pour qu'il ne soit pas nécessaire de centrifuger.

Suivant que l’hémolyse est nulle, partielle, assez intense ou totale, on la note par les chiffres 0, 1, 2 et 3 ou par 1 à 3 signes +.

Cette méthode peut être également employée pour la mesure du pouvoir hémolytique des sérums hémolytiques

spécifiques (voir chapitre xx1), — mais il faut alors opérer sur des dilutions au dixième (dans l’eau salée physiologique) de ces derniers, — et aussi pour l'étude des hémolysines produites par certains microbes pathogènes dans les humeurs de l'organisme ou dans les milieux artificiels de culture.

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