C. — Pneumocoque

COLORATION. — Par toutes les couleurs basiques d’aniline. Prend le Gram. Toujours encapsulé dans les tissus et les produits d’expectoration. La capsule se forme aussi dans les milieux de culture albumineux, le lait, le sérum coagulé, etc. Elle est décolorée par le Gram et colorable par i’éosine (voir technique de coloration des capsules, chapitre vrr).

CULTURE. — Ne pousse pas à 20°. La gélatine ne peut donc pas être utilisée. Le milieu de choix est la gélose-peptone arrosée de sang de lapin ou de sang humain, ou le bouillon-sérum comme pour le streptocoque. pH limites — 7,0-8,3. pH optimum = 7,8.

Milieu de Salimbeni et d'Hérelle (liquide). — On fait digérer pendant 7 à 8 heures (pas plus), à 50°, des estomacs de porc dégraissés et hachés comme pour la préparation de la peptone de Martin. L'eau est d’abord portée vers 55°, on ajoute ensuite, par litre, 10 centimètres cubes d’'HCI pur (22° Bé) et, en agitant, 300 grammes de hachis d'estomac. On règle la température vers 50°. Après 7 à 8 heures, on monte celle-ci à 80-90° afin de détruire la pepsine et d'arrêter la

PNEUMOCOQUE 309

digestion. La peptone ainsi obtenue se conserve, sans précautions, plusieurs semaines.

Pour préparer le milieu destiné à la culture du pneumocoque on rend la peptone légèrement alcaline au tournesol, par addition de soude, et on stérilise à 120°. On filtre sur papier Chardin mouillé et on ajoute 2 grammes de glucose. On Sstérilise après répartition vers 112° à 1150.

Pour conserver les pneumocoques virulents, le milieu suivant est excellent :

Milieu T (de Truche) liquide

Peptone Chapoteau. A Rs 4 gr.

Ghlorure dé fsodium ea mou! à Oègr5 * Glucose TE. | 0 gr. 2

PARIS UNIGR Pet M Le ou es LUC.

Faire dissoudre à 80°. Alcaliniser légèrement jusqu'à réaction légèrement rose avec la phtaléine de phénol. Faire bouillir pendant 5 minutes, filtrer, répartir et stériliser 1/4 d'heure à 110°.

Il est bon, pour les premières cultures, d ajouter à ce milieu 1/3 de liquide d’ascite et, pour conserver la virulence, d'ajouter au milieu initial 2/3 de gélatine à 15 p. 100 dissoute dans de l’eau physiologique et alcalinisée.

Garder les cultures à la glacière, en tubes scellés.

Gélose T. — Même composition que le milieu T liquide. On ajoute 20 grammes de gélose par litre. Après dissolution de la sl e on alcalinise jusqu'à virage légèrement rose de la phénolphtaléine. On répartit en es sans filtrer et on stérilise à 110° pendant 20 minutes. On laisse les tubes en position droite pendant 30 minutes dans l’autoclave chaud ouvert, puis on les incline comme les tubes de gélose ordinaire.

Nota. — Les pneumocoques virulents sont solubles dans la bile (0 ce 1 à 0 ce. 2 de bile de lapin dans 2 centimètres cubes de culture de 24 heures en bouillon ou d’émulsion de culture sur gélose), le milieu s’éclaircit en quelques minutes. Le taurocholate de soude, en solution à 10p 100 dans l’eau salée physiologique stérilisée, a Ja même action à la dose de 1 volume pour 100 volumes de culture. ”

Milieux différentiels.

Sérum. de DŒUrSEN.— . 1 vol.

Plat is tIée OPA 7} 2 vol.

Milieu de Hiss

Ajouter 1 p. 100 de teinture de tournesol à 5 p. 100, chauffer à 100°, filtrer. Ajouter 1p. 100 d’inuline.

Stériliser par chauffage discontinu à 1000.

Le pneumocoque fermente l’inuline Le milieu rougitet se coagule. Le streptocoque ne fermente pas.

CONSERVATION DE LA VIRULENCE. — Procédé à la géla tine (M. Nicolle, Cotoni et Truche).— Dans un litre de milieu T chauffé au bain-marie, faire dissoudre 150 grammes de gélatine portée à 55°, ajouter un blanc d'œuf ; alcaliniser ; chauffer 1/4 d'heure à 115°, filtrer, répartir en tubes ; stériliser pendant 20 minutes à 110°. Au moment de l'emploi, on fait fondre un tube de gélatine T au bain-marie et on y introduit la culture à conserver dans la proportion de 2 parties de gélatine pour une de culture. On mélange intimement en roulant le tube entre les mains eton porte à la glacière. Les microbes conservent ainsi leur vitalité et leur virulence pendant plusieurs mois. Pour les repiquer, il suffit de fluidifier la gélatine à 37° et d'ensemencer 2 à 3 centimètres cubes de son contenu dans un tube de milieu T.

Séro-agglutination (M. Nicolle). — Centrifuger une culture en bouillon T de 16 heures. Emulsionner le culot dans l’eau chlorurée sodique à 10 p. 1.000, à raison de 1 centigramme de germes par centimètre cube de liquide. Verser, dans une série de petits tubes à essai stériles, de 4 à 5 millimètres de diamètre, 1 centimètre cube d’émulsion et ajouter dans chacun d’eux des doses décroissantes de sérum : 1/20, 1/50, 1/100, 1/200 de centimètre cube. Boucher à l’ouate, agiter pendant 5 minutes. Si l'agglutination n’est pas immédiate, laisser les tubes à la température du laboratoire pendant 12 heures et lire les résultats.

Les pneumocoques serépartissent en agglutinables (43 %); hyperagglutinables (agglutinables par le sérum normal frais) (7 %); inagglutinables par les méthodes ordinaires (45 %) mais agglutinables après avoir été traités par la méthode suivante de Porgès : ajouter 1/10 d'HCI normal à 10 centimètres cubes d'émulsion de pneumocoques.Plonger 5 minutes dans l’eau bouillante, refroidir à l’eau courante, neutraliser avec 1/10 de NaOH normale. Répartir et opérer comme précédemment. Selon les échantillons, il est parfois nécessaire de porter de 2/10 à 5/10 la quantité d'HCI.

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D. — Méningocoque.

CoLoRATION. — Bleu Lôffler ou bleu Borrel. Ne prend pas le Gram. Les préparations faites avec le dépôt centrifugé de liquide cérébro spinal prélevé par ponction lombaire montrent la plupart des -éléments microbiens inclus dans les leucocytes. Le méningocoque se trouve souvent associé au Diplococcus crassus ou pseudo-méningocoque de Jaeger, qui est plus épais, plus arrondi, et qui reste coloré par le Gram. Le méningocoque vrai ne peut être différencié des paraméningocoques que par l'étude complète de ses diverses réactions biologiques.

MILIEUX DE CULTURE. — Température optimum 37°. Ne se développe pas au-dessus de 22°.

Bouillon ascite. — 3 volumes de bouillon, 1 volume d'ascite. Le méningocoque ne commence à troubler ce milieu que vers le 5° ou le 6° jour. Voile mince à la surface.

Gélose-ascile.

Bouillon gélosé. . . . PT TENTE 3 vol.

ÉCRIRE QI LEE TNT En, 1 vol.

Faire le mélange à la température de 50°. Couler en boîtes de Pétri. Laisser solidifier.

On ensemence ces plaques directement au lit du malade, avec les tampons d'ouate qui ont servi à préleverles exsudats nasopharyngés ; on les porte 36 heures à l’étuve, puis on repique les colonies sur les milieux différentiels. S'il s'agit d'un liquide de ponction lombaire, on étale sur ce milieu une partie du dépôt centrifugé. Les colonies du méningocoque se développent en 20 à 24 heures à 370.

Si l’on ne peut se procurer du liquide d’ascite, on emploiera le milieu suivant, préconisé par Sacquépée et Delater :

On mélange, dans un vase d’Erlenmeyer préalablement gradué, deux blancs d'œuf entiers. On y ajoute 3 fois leur volume d'eau distillée et 0 cc. 5 p. 100 centimètres cubes d'une solution de soude caustique à 10 p. 100. On stérilise

à l’autoclave à 115° pendant 15 minutes. On ajoute 1 partie de ce liquide à 5 parties de bouillon gélosé neutre stérile, fondu à 55°, et on coule en plaques.

M. Nicolle, E. Debains et C. Jouan recommandent l emploi de la gélose Truche (ou gélose T) comme milieu habituel.

Pour préparer la gélose-Martin-sérum (formolé), on ajoute, à 500 centimètres cubes de sérum de cheval, 1 centimètre cube de formol du commerce, on mêle, on verse après quelques instants 1 centimètre cube d’ammoniaque à 22° B£ pour neutraliser la formaldéhyde, on étend de deux parties d'eau distillée et on stérilise pendant 15 minutes à l’autoclave à 100°. Le milieu contientainsi une partie de sérum pour 9, ce qui suffit.

La gélose se prépare en dissolvant dans 1 litre d’eau chauffée à 80°, 40 grammes de peptone Chapoteau, 5 grammes de sel et 2 grammes de glucose. On ajoute 20 grammes de gélose, on alcalinise, on stérilise à l'autoclave, on filtre, puis on répartit et on stérilise une dernière fois. On laisse pendant quelques jours au repos sans capuchonner pour se débarrasser de l’eau de condensation.

Après 24 heures, sur ce milieu, le méningocoque donne des colonies rondes, humides, un peu surélevées, grisâtres.

Dans le bouillon préconisé par Salimbeni et d'Hérelle pour le pneumocoque, le méningo pousse également très bien, et reste vivant pendant une quinzaine de jours.

Presque tous les méningos, d’après M. Nicolle et ses collaborateurs, attaquent le glucose, le maltose et, moins énergiquement, le lévulose.

Pour l'isolement, on ensemence, sur gélose-sérum et en milieu de Salimbeni et d'Hérelle, le culot de centrifugaton du liquide céphalo-rachidien prélevé par ponction lombaire.

Milieu MM. (Panse glucosée) — Prendre par exemple un litre de peptone Martin obtenue par digestion courte (6-8 heures): elle est fortement acide. Alcaliniser, précipiter par chauffage à l’autoclave pendant 15 minutes à 120°. Filtrer sur papier, ajouter 2 grammes de glucose par litre, répartir et stériliser par chauffage à l’autoclave 15 minutes à 112-1150.

Gélose au placenta (de Kutscher). — Préparer un litre de

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bouillon en faisant macérer 500 grammes de placenta hache dans 1 litre d'eau: - Ajouter :

Gélose. . 2 NaCI. ORNPT TA UES MI GREUPENNR 0 CÉCOSCR RER Le 2 Sn 1 Nutrose. Re 2 Peptone Chapoteau. 2

À 3 volumes de cette gélose, légèrement alcalinisée et stérilisée, ajouter 1 volume de sérum de bœuf inactivé par chauffage à 60°. La gélose et le sérum stériles doivent être portés l'un et l’autre à la température de 50° au bainmarie avant d'en faire le mélange.

DIAGNOSTIC BACTÉRIOLOGIQUE DE L'INFECTION MÉNIN- GOCOCCIQUE. — Recherche du méningocoque.

A) dans le liquide céphalo-rachidien. — Le liquide céphalorachidien, prélevé par ponction lombaire, est centrifugé pendant 15 à 20 minutes.

Examen microscopique. — Décanter le liquide clair. Avec une pipette effilée, prélever quelques gouttes du culot de centrifugation, et les étaler sur plusieurs lames de verre. Dessécher, fixer par la chaleur ou l'alcool éther ; faire un Gram et colorer le fond par le Ziehl dilué.

Le méningocoque se présente sous la forme de cocci en grains de café intraleucocytaires ou libres, ne prenant pas le Gram.

Isolement du méningocoque.

1° Procédé classique. Ensemencer abondamment le culot de centrifugation sur gélose ascite, en tubes ou boîte de Pétri. Mettre à l’étuve à 37° pendant 24 heures, examiner les colonies qui ont poussé.

2° Procédé de Tribondeau. — Après la ponction lombaire, prélever de 5 à 10 centimètres cubes de liquide céphalo-

rachidien. Le reste sera centrifugé pour l'examen microscopique et l’ensemencement du ot

Couler de la gélose ascite dans une grande boîte de Pétri. Lorsqu'elle est prise. verser sur le milieu les 5 à 10 centimètres cubes de liquide céphalo-rachidien qui ont été prélevés. La boîte de Pétri ainsi ensemencée est placée à plat à l’étuve à 37°. Au bout de quelques heures, incliner

légèrement la boîte de façon que le liquide céphalo-rachidien laisse à découvert une bonne moitié de la surface du milieu.

Vers la 18° heure, examiner les colonies de méningocoques qui ont poussé dans la zone sèche, le plus souvent à la limite du liquide.

B) Dans le mucus rhino-pharyngé. Le mucus doit être prélevé dans le rhino-pharynx avec l'écouvillon d'ouate stérile :

Déposer une parcelle de mucus recueilli sur une boîte de Pétri contenant de la gélose ascite. Avec une pipette coudée, l’étaler sur la boîte. Sans la recharger on peut faire une 2e et une 3° boîte semblables.

C) Dans le sang. 5 centimètres cubes de sang ensemencés dans un ballon de 250 centimètres cubes de bouillon. ascite ou d’un autre milieu favorable. Isoler ensuite sur gélose ascite.

IDENTIFICATION. — Les épreuves d'identification permettent de reconnaître : 19 si le germe isolé est un méningocoque ; 20 à quel type de méningocoque il appartient.

Epreuve des fermentations sucrées par le milieu différentiel au rouge neutre (Dopter, R. Koch).

Dans une série de matras contenant chacun 75 centimètres cubes de bouillon gélosé à 3 p. 100 fondu au bainmarie à 99°, on fait dissoudre 1 gramme de chacun des sucres suivants (chäque sucre dans un matras différent) :

Glucose.

Saccharose.

Maltose.

Lactose.

On chauffe 20 minutes à l’autoclave à 1059, on laisse refroidir à 50°, on ajoute à chaque matras 25 centimètres cubes de liquide d’ascite et 1 centimètre cube desolution aqueuse de rouge neutre à 1 p. 100. Le milieu prend une couleur orangée. On le maintient au bain-marie , pendant 1 heure. Au bout de ce temps, un précipité se forme. On agite les matras et on coule chaque milieu en boîtes de Pétri. Sous une faible épaisseur, il prend une teinte jaune et rougit nettement sous les colonies qui fermentent les sucres. Voici les résultats de la réaction avec le méningocoque et

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avec les principaux microbes dont il s’agit de le différencier :

Glucose Saccharose Maltose Lactose

Méningocoque et Paraméningocoque. + Diplococcus crassus. :

Microc. catarrhalis. . . .

Diploc. pharyngis flavus I.

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