CHAPITRE XXX Vi

A. — Milieux de culture pour Ja recherche et la détermination des vibrions cholérigènes.

1° Pour la recherche du vibrion cholérigène dans les eaux, il y a lieu de procéder d’abord à l’ensemencement, en aussi grande quantité que possible, de l’eau suspecte dans un milieu d’enrichissement (eau peptonée). Ensuite on procède à l'isolement des germes sur milieux solides (plaques de gélatine au milieu de Dieudonné).

La meilleure méthode consiste à filtrer, sur une bougie Chamberland stérile, une dizaine de litres au moins de l’eau suspecte et à recueillir ensuite, au moyen d'un pinceau ou d'un tampon d'ouate stérile, le dépôt laissé par cette eau à la surface de la bougie. Ce dépôt est délayé et versé dans un ballon d'eau peptonée, concentrée (formule a ci-après), qu'on dilue avec 90 % d’eau distillée stérile. Si les vibrions s'y trouvent, même en petit nombre, ils ne tardent pas à se développer.

a) Eau peptonée concentrée (formule de Meichnikoff, recommandée) :

Héptonemseche RS CRE, À; 10 gr.

DÉPOMArFINS RTE Pen entre en eUe so SPORE BYer Gélatine MIE En. TE MER 20 gr.

Éautdistilléeq: suffis. pour... 01... 11100%cc.

Alcaliniser légèrement à la soude et stériliser à l’autoclave 30 minutes à 115°.

On verse 900 centimètres cubes de l’eau suspecte dans un ballon de 2 litres de capacité contenant 100 centimètres cubes de cette eau peptonée de Metchnikoff. On porte à l’étuve à 37° et, si l’eau renferme des vibrions, il se forme, déjà après 6 ou 8 heures, un léger voile à la surface. On en

MICROBIOLOGIE 24

prend une parcelle avec un fil de platine et on la réensemence dans des tubes d’eau peptonée (même formule, diluée au dixième avec de l'eau stérile), puis sur milieux solides (Dieudonné et plaques de bouillon-gélatine ordinaire) où les colonies ae vibrions se développent avecun aspect caractéristique (petites bulles d'air et liquéfaction).

b) Eau peptonée (formule allemande) :

Peptone de Witte sèche. . . . . . . 100 gr. Sel mar Re RU, ER ÉLUS 100 gr.

Nitrate de potasse . à FT S 1 gr.

Carbonate de soude cristallisé. . 3 M RAUET:

Eau distillée (quantité suffisante pour). :° "1,0001ce:

Cette solution-mère doit, pour l'usage, être étendue de 9 fois son volume d’eau dans laquelle il s’agit de rechercher les vibrions.

Pour la culture des vibrions cholérigènes dans les milieux gélatinés ou gélosés, il convient d'alcaliniser fortement ces milieux par addition de 3 % d'une solution à 10 % de lessive de soude. pH limites ; 6,4-7,9, pH optimum 7,0-7,4.

29 Pour la recherche du vibrion cholérigène dans les selles, on peut se servir, soit de la méthode d’Ottolenghi (bile de bœuf), soit de l'eau peptonée diluée au dixième comme milieu d’enrichissement.

Lorsqu'il s'agit de selles liquides, on prélève une anse de platine à la surface de l'échantillon, après repos de 10 à 15 minutes. Si les matières fécales sont solides (porteurs de germes), on prépare, dans l'eau physiologique (100 centimètres cubes environ), une émulsion d'environ 5 grammes de matières. |

L’anse de Nu est ensuite plongée dans un tube d’eau peptonée à 2% (peptone pancréatique, de préférence) qu’on laisse immobile 10 à 15 minutes. Pendant ce temps, on fait un examen direct de la selle au microscope, d’abord à l’état frais, puisaprès coloration (Gram-fuchsine en sol. aqueuse).

On prélève alors, à la surface du tube d’eau peptonée, une anse de liquide avec laquelle on ensemence, sur touteson étendue, un tube de gélose inclinée (A) qui est capuchonné et mis à l'étuve à 37°, ainsi que le tuba d’eau peptonée.

Après 3 heures d’étuve on prélève de nouveau à la surface

du même tube d’eau peptonée, une anse de liquide avec laquelle on ensemence un second tube de gélose (B) qu'on porte à l'étuve à 37°.

Au bout de 10 à 12 heures, les colonies sontapparentes et assez caractéristiques : brillantes, laiteuses, à bords ronds. On émulsionne une de ces colonies dansun peu d’eau physiologique pour en pratiquer l'examen direct à l’état frais, puis après coloration (Gram-fuchsine aqueuse). Avec la même émulsion, on recherche (à 37°) l’agglutination avec le sérum de l’Institut Pasteur, au taux d'au moins 1 pour 500 et jusqu’à 1 pour 10.000. Certains vibrions ne deviennent agglutinables qu'après 3 ou 4repiquages successifs sur gélose.

La séparation des vibrions développés en voile se fait, comme il a été dit ci-dessus, par réensemencement après 6 heures. Ces réensemencements doivent être effectués en eau peptonée diluée au dixième, en gélatine nutritive coulée en boîtes de Petri, sur milieu de Diendonné, et dans la bile de bœuf. |

Le milieu de Dieudonné, employé seul, permet souvent d'isoler d'emblée les vibrions cholérigènes des déjections riziformes.

a) MILIEU DE DIEUDONNÉ (pour les matières fécales).

On mélange parties égales de sang de bœufoude porc défbriné et de solution normale st potasse (à 56 grammes d'hydrate de potasse par litre), ou mieux, suivantla méthode de Pilon, on mélange parties égales de sang défibriné et de solution de soude pure, cristallisée, à 12 p. 100. On stérilise à l’autoclave (Hiquide A).

On prépare d’autre part, selon la technique ordinaire, de la gélose nutritiveexactementneutre au tournesol (liquide B). On mélange 7 parties de B pour 3 parties de À et on coule en plaques.

La gélose ainsi obtenue contient environ 0,6 p. 108 de potasse ou de soude #.

1. On peut remplacer le sang défibriné par une solution d'hémoglobine.

On dissout 5 grammes d’hémoglobine dans un mélange de 15 eentimètres cubes de lessive normale de soude et de 15 centimètres cubes d’eau distillée. Cette solution est stérilisée à 100° pendant une heure dans l’autoelave non boulonné). On en verse 15 centimètres cubes dans 85 centimètres cubes de gélose nutritive neutre fondue et on répartit en gros tubes à essai. On solidifie par refroidissement, en position inclinée.

Maintenir les plaques découvertes et la face en bas, à l’étuve à 37° pendant quelques jours ou, si l’on est pressé, les chauffer 5 minutes à 65°. Il est mieux de les conserver 48 heures au laboratoire avant l'usage, pour éliminer, par évaporation, une partie de l'ammoniaque quiempêcherait le développement des vibrions.

On ensemence ces plaques en stries avec un pinceau ou un petit tampon d’ouate stérile trempé dans une dilution de 1 gramme environ de déjections dans 10 centimètres cubes d’eau stérile. On essuie successivement le pinceau ou le tampon sur plusieurs plaques, sans le recharger.

On porte à l’étuve à 37° les plaques renversées, le couvercle en bas (pour éviter le dépôt d’eau de condensation à la surface du milieu). Au bout de dix heures, on examine. Les colonies de vibrions sont déjà visibles, tandis que celles de coli et d’autres microbes intestinaux se développent plus tardivement. Il faut donc en pratiquer le réensemencement précoce, en eau peptonée d'une part, sur bouillon gélosé en tube incliné d'autre part, pour identifier ensuite les vibrions par la recherche de la réaction indolnitreuse et par les réactions d’agglutination. Cette identification peut être effectuée sans difficultés 36 à 40 heures après l’ensemencement initial des déjections.

Hoffmann et Kutscher ont proposé de dessécher le milieu de Dieudonné dans un appareil à vide pour le transformer en une poudre grossière qui peut se conserver indéfiniment en flacon bouché à l’émeri et dont il suffit de faire dissoudre la quantité dont on a besoin dans 9 parties d’eau, au moment de s'en servir. On stérilise la solution à 100° avant de la répartir en plaques.

b) MODIFICATIONS DIVERSES DU MILIEU DE DIEUDONNÉ. — 1° Au lieu de se servir de sang frais défibriné, qu'il n'est pas toujours possible de se procurer rapidement, Costa préconise l'emploi de sang « cristallisé » qu’on trouve tout préparé dans le commerce et qu'on peut obtenir soimême, pour le garder en provision, en desséchant dans des cuvettes, en couche mince, dans un autoclave à vide, à la température de 45°, du sang de bœuf défibriné. Ce sang, finement pulvérisé au mortier, est délayé lentement à froid

avec de l’eau distillée en évitant la formation de grumeaux :

DAT CLIS CALISO ER en, à L.. D 4 10e ie 20 gr. HUE UIIES ORRRERN, E CN ReN 100 cc.

On verse ensuite dans :

Solution normale de potasse. . . . . . 100 cc.

Puis on porte à l’autoclave à 100° pendant 30 minutes. On filtre au papier Chardin mouillé, puis on stérilise pendant deux heures à 100° à l’autoclave. Cette solution est ajoutée à la gélose, selon la technique de Dieudonné, dans la proportion de 3 volumes de solution pour 7 volumes de gélose. Le mélange est coulé en boîtes de Pétri et peut être utilisé 12 heures après sa solidification.

290 Baerthlein et Gildemeister modifient également le milieu de Dieudonné en substituant, au sang frais, l'hémoglobine (extrait d’'hémoglobine de Pfeiffer). On dissout 3 gr. 50 d’hémoglobine dans 10 centimètres cubes d’eau salée physiologique. On y ajoute 10 centimètres cubes de solution à 5 gr. 50 de soude caustique pure anhydre et 2 centimètres cubes de lessive normale de potasse. On stérilise à 100”. Lorsque le liquide est refroidi aux environs de 50°, on le mélange à 80 centimètres cubes de gélose à 3 p. 100, exactement neutre au tournesol et préalablement chauffée à 80- 90°. On agite pour rendre le mélange bien homogène et on coule aussitôt en boîtes de Petri. On dessèche les plaques en position renversée pendant 24 ou 48 heures à l’étuve avant de les employer.

c) MILIEU D'HANS ARONSON. — On prépare d'avance une série de petits ballons ou vases d'Erlenmeyer contenant chacun 100 centimètres cubes de bouillon gélosé neutre, peptoné à 3,5 p. 100, avec de la peptone de Witte, et alcalinisé avec 6 centimètres cubes pour 100 d’une solution à 10 p. 100 de carbonate de soude cristallisé purifié.

À chaque ballon de cette gélose, préalablement fondue au bain-marie ou à l’autoclave, on ajoute :

o centimètres cubes de solution de sucre (saccharose) à 20 p. 100 ;

o centimètres cubes de solution de dextrine à 20 p. 100 ;

0 cc. 4 de solution alcoolique saturée de fuchsine basique ou Magenta ;

2 centimètres cubes de solution à 10 p. 100 de sulfite de soude. |

Chacune de ces solutions doit avoir été stérilisée à part. On agite ; il se forme un précipité qu'on laisse se déposer mais qu'on ne sépare pas et on coule en boîtes de Pétri en retenant dans le ballon les quelques centimètres cubes de liquide qui contiennent le précipité.

Sur ce milieu très alcalin, qu'on peut utiliser immédiatement, les vibrions cholériques se développent abondamment en 10 à 20 heures, en formant des colonies brillantes, rouges au centre, incolores à la périphérie. Ces colonies grossissent rapidement jusqu'à atteindre 6 millimètres de diamètre. Les colonies de Bacterium coli poussent beaucoup plus lentement et gardent une coloration blanche.

L'isolement des vibrions cholériques contenus dans les déjections est très facile avec ce milieu.

d) MizteEu D’'OTToLENGHI (bile de bœuf). Très recommandé. — On mélange, à 100 centimètres cubes de bile de bœuf fraiche, filtrée sur papier, 3 centimètres cubes de la solution suivante :

Carbonate de-soude: .onla mer: 10 gr.

Nitrita de \potassé:? PERS 7 Get nl Er is tEIIee Pet RER NP EC ARRET CUP EE

On répartit en tubes à essai, à raison de 5 centimètres cubes par tube, et on stérilise à l'autoclave pendant 20 minutes à 115°. On ensemence les tubes avec une anse de platine de déjections suspectes, diluées ou non. On porte à l’étuve à 37° pendant 12 heures et on réensemence directement en eau peptonée gélatinisée ou en bouillon gélatinisé pour isoler les colonies de vibrions.

e) MILIEU MINÉRAL DE KEMAL MOUKTHAR.

Phosphate de soude. PT TL Pe ? À 0 gr. 8 Asparagine. . . A EEE PNA 7 ur 0 gr. 4 Lactate d’ ammoniaque. 1 SES RATE 0 gr. 6 Ghlorure de,sadium.1,,6 PRE 0 gr. 5 Fair. distilléé" 0 LP RE n IUU es

On fait dissoudre les sels dans l’eau distillée et on stérilise après répartition en tubes. Ce milieu peut être

employé immédiatement. On ensemence les tubes avec une parcelle de matières fécales suspectes et on porte à l’étuve à 37°. Au bout de 5 à 6 heures, le vibrion y donne une culture presque pure tandis que le coli et les autres bactéries intestinales n’ont pas eu le temps de se multiplier. On peut faire ensuite l'isolement sur un milieu préparé comme suit :

RAR IS ICO RTE Es le 0 à ee dc 100 cc.

Phasphate-desondementlites. prie 2 gr.

Gélatine. . . PARA. ME UTE RE 2 gr.

COS DUR er 2 Ve A nee 2 gr.

On porte à l'autoclave à 120° pendant 15 minutes ; on filtre à chaud et on répartit en larges tubes à essai qu’on laisse solidifier en position inclinée.

Les propriétés biologiques des vibrions ne sont pas modifiées par la culture sur ce milieu minéral.

f) MILIEU POUR LA RECHERCHE DE LA RÉACTION INDOL- NITREUSE (choléra-roth de O. Bu id).

Do. daMatie SAT TAPER SR Ne. 10 gr.

Nitrateiderpotasse. e: ee M 2 À: Por:

NaCEE AEMERMENES KE RCE D MAR EAN EI 3 gr.

Dawtdisdlliée®s th. M1 € fete ei 1 litre

Après 24 heures de culture, verser dans le tube HCI ou SO‘? pur (1 ou 2 centimètres cubes). Ilse produit une coloration rose-rouge. Si la teinte est douteuse, ajouter 1 centimètre cube d’alcool amylique et agiter : l'alcool amylique surnage, coloré en rose par le nitroso-indol.

Cette réaction n'est pas absolument caractéristique, car des vibrions non cholérigènes la présentent, mais elle ne manque presque jamais avec les vibrions cholérigènes authentiques.

g) MILIEU POUR LA RECHERCHE DES HÉMOLYSINES. — On incorpore à un tube de bouillon-gélosé (fondu au bainmarie à 50°)2 ou 3 centimètres cubes de sang de lapin ou de mouton défibriné et on coule en boîte de Pétri. Ou bien, plus simplement, on verse à la surface d’une plaque de gélose, ou d’un tube de gélose inclinée, quelques gouttes de sang de lapin ou de sang humain défibriné.

On ensemenceen strie, sur cette gélose au sang, le vibrion qu'on veut étudier (ou tout autre microbe dont on veut

rechercher les propriétés hémolysantes, par exemple le streptocoque).

Si le microbe produit une hémolysine, ses colonies s'entourent d’une auréole claire sur le fond opaque du milieu.

Presque tous les vibrions pseudo-cholériques isolés des eaux produisent, autour de leurs colonies, une zone nette d'hémolyse.

Les vibrions cholérigènes authentiques (sauf le vibrion de Nasik et celui d'El-Tor) ne produisent pas d'hémolysine.

Les cultures, plus ou moins âgées, de quelques rares vibrions non cholérigènes sont cependant assez fortement hémolytiques. Celles du vibrion de Nasik sont le plus actives à 3 semaines. Pour mesurer l’activité de cette hémolysine qui est généralement labile, il ne faut pas filtrer les cultures, mais les centrifuger fortement et longtemps pour éliminer la plupart des éléments microbiens. Le liquide décanté est ensuite mis en contact à doses variables [0 cc. 01 à O0 cc. 5 par exemple) dans une série de tubes à essai, avec un volume COnART d'émulsion de sang, par en 0 cc. 5 d’émulsion à 5 p. 100 de sang de mouton défibriné. On complète partout au même volume, 3 centimètres cubes, avec de l’eau salée physiologique ; on porte dans un bain-marie à 37° et on lit les résultats après des temps variables, de 5 en 5 minutes.

Il faut savoir que, dans certains cas, les Cultnres renferment des substances qui empêchent l’hémolyse, de telle sorte qu'avec de très petites doses de ces cultures, l'hémolyse se produit, tandis qu'avec de fortes doses elle est empêchée.

NX +

B. — Diagnostic des vibrions cholérigenes par l'agglutination.

Il faut disposer d’un immun-sérum actif au moins à 1 p. 4.000 ; celui de l’Institut Pasteur agglutine jusqu’à 1:p40/000!

On prépare une série de dilutions de cet immun-sérum dans l’eau physiologique au taux de 1 p. 500, 1 p. 1.000, etc.

On met, dans une série de petits tubes à essai, 1 centimètre cube de dilution sérique; puis, dans chacun d’eux, on délaye, en ayant soin d’agiter de façon à obtenir un trouble homogène, une anse d’une culture sur gélose, âgée de 18 heures, du vibrion à essayer, provenant d’un isolement sur milieu de Dieudonné ou sur plaques de gélatine. On porte à l'étuve à 37° et on observe les résultats au bout de deux heures.

On considérera, comme ayant donné une réaction positive, toute dilution pour laquelle les vibrions sont réunis en grumeaux déposés au fond du tube et laissant au-dessus d’eux un liquide clair.

Il faut faire, dans les mêmes conditions, deux essais témoins : l’un avec la culture à identifier et du sérum normal de l'espèce animale qui a fourni l’immun-sérum, l’autre avec l’immun-sérum et un vibrion cholérique authentique.

Tout vibrion agglutiné par le sérum à un taux inférieur à 1 p. 500 ne doit pas être considéré comme cholérigène authentique.

L'Institut Pasteur de Paris envoie aux microbiologistes qui en désirent, du sérum de cheval anti-cholérique agglulinant. Mais on peut aisément préparer, pour les réactions d'agglutination, un sérum actif en inoculant à un lapin ou à une chèvre, sous la peau d'abord, une petite quantité (une demi-culture sur tube de gélose inclinée) de vibrions cholérigènes authentiques chauffés à 58° pendant 30 minutes, puis quelques jours après, des quantités progressivement croissantes de cultures vivantes (à partir de 1 dixième de culture sur tube de gélose). Le sang recueilli huit jours après la cinquième ou sixième injection fournit généralement un sérum déjà très agglutinant. Ce sérum ne doit pas être chauffé. On l’essaye d’abord et on titre son pouvoir agglutinant avec un ou plusieurs vibrions cholérigènes

authentiques.

DIAGNOSTIC DU CHOLÉRA PAR LE PHÉNOMÈNE DE PFEIFr- FER, — On injecte à un premier cobaye (de 300 à 350

grammes environ), dans le péritoine, un mélange de :

Un dixième de culture de 24 heures (sur gélose) du vibrion suspect,.émulsionné dans 2 centimètres cubes d'eau salée physiologique, avec 0 cc. 5 ou même 0 cc. 1 de

sérum anticholérique agglutinant à 1 p. 4.000, par exemple.

À un second cobaye de même poids, on injecte, dans le péritoine, la même quantité de la même émulsion du vibrion suspect, mélangée à 0 cc. 5 ou 0 ec. 1 de sérum normal de la même espèce animale qui a fourni le sérum anticholérique.

15 à 30 minutes après, on fait une ponction abdominale à la pipette, sur la ligne blanche, l'animal étant tenu par un aide le ventre bombé en bas, de telle sorte que l’exsudat péritonéal s’accumule au voisinage de Tombilic. Par de légers mouvements de va-et-vient, l'extrémité de la pipette pénètre dans le péritoine et, par capillarité, aspire un peu d’exsudat. On examine celui-ci, d’abord à l’état frais en goutte pendante, puis après coloration à la thionine phéniquée ou mieux suivant la technique ci-après :

On fait agir sur la lamelle, sur laquelle une gouttelette d’exsudat a été étalée et séchée à l’étuve à 37°, d’abord une solution concentrée d'acide picrique, pendant 2ou3minutes, puis une solution à 1 p. 100 d’éosine dans l'alcool à 959, 2 à 3 minutes ; enfin, pendant 1 à 2 minutes, une solution aqueuse concentrée de bleu de méthylène ou de bleu Borrel.

S'il s'agit d'un vibrion cholérique vrai, l’exsudat provenant de l'animal qui a reçu le sérum anticholérique en mélange avec la culture, montre des vibrions (immobiles en goutte pendante, agglutinés et transformés en granules sphériques), tandis que, dans l’exsudat de l’animal qui a reçu le mélange de culture et de sérum normal, les vibrions sont intacts, mobiles et parfaitement colorables.

On peut réaliser in vitro cette réaction en mélangeant, dans de petits tubes à essai stériles, deux gouttes d’émulsion de vibrions avec 1 centimètre cube de dilution au dixième de sérum anticholérique inactivé par chauffage à 56° et 2 gouttes d’alexine fraîche de cobaye. On porte à l’étuve à 97° pendant 2 heures, puis on examine en goutte pendante et sur lame après coloration par la thionine.

Bien entendu, on fait une épreuve de contrôle avec l’émulsion de vibrions, de l’alexine fraîche de cobaye et du sérum normal inactivé par chauffage.

Solution de Rogers pour injections intraveineuses chezles cholériques :

Chlorure de sodium. 1Ygr:t5 Chlorure de calcium O0 gr. 45 Chlorure de potassium. . DNpr07t Eau distillée . : 1 lire

. Dose, 1 litre 500 à 2 litres 500; à la température de 37°. On injecte lentement, à raison de 10 minutes pour 1 litre En 1911, à Palerme, Rogers a employé les injections intraveineuses d'un liquide hypertonique composé comme suit :

Chlorure de sodium. . . . . 7 gr. 68 Pour Chlorure de calcium . . . . 0 gr. 25 ) 1 seule Chlorure de potassium. . . . 0 gr. 38 ( injection Hamistériur TOI 7 2011 567'ec / lente

Noia. — En 1911 également, en Tunisie, Naamé a obtenu

d'excellents résultats de l'injection intraveineuse de 2 à 3 milligrammes d’adrénaline, même en période d’algidité.