MÉTHODE DE NEISSER (COLONIES DE 24H. SUR SÉRUM

Bleu de méthylène Se Fe 1 TEA 1 gr.

Alone DOM Mr AP Mean er 20 ce.

Ajouter après dissolution :

Eau distillée. . . 00 ec.

Acide acétique glacial. ANS vie HE FE DUREE AREA 50 ce.

Faire agir quelques secondes sur les préparations de frottis ou de cultures. Laver, puis colorer 3 à 5 secondes dans solution de vésuvine à 0,2 p. 100 (faite dans l’eau bouillante). Laver à l’eau et examiner.

Pour la coloration des granules polaires, R. Debré, R. Le-

tulle et L. Sergent préfèrent employer la méthode suivante, dérivée de celle de Neisser.

Fixer à la chaleur, colorer avec :

Bleu de méthylène. . . . . . . 1 gr. ) Dissoudre le bleu dans AICONL RSR rl rt crie « 20 cc. : l'alcool puis ajouter Eau distillée . . . . . + + 900 cc. | l’eau et l'acide.

Acide acétique Pet 11 EPRSRES 50 ce.

Chauffer sur la lame jusqu’à émission de vapeurs, changer la couleur et chauffer deux fois, puis laisser 5 minutes en contact. Laver rapidement à l’eau distillée.

Recouvrir le frottis avec solution de vésuvine préparée d'avance comme suit :

Vésuvine. . 0e 0 gr. 50 Filtrer bouillant.

Eau distillée bouillante. . : 250 ce.

Laisser 10 secondes en contact. Laver rapidement à l'eau distillée.

MÉTHODE DE FALIÈRE

Bleu. desméthyléné 4 PTE CRE Se: 1 gr.

BOLAL ST 0 de to et Ne UT 0,5

Eau fdistiliée. 94e SCENE EURE RER CO ECTS Alcool absolu...1546 ex 2 MESA VERTE

Triturer dans un mortier le bleu avec l'alcool, ajouter le borax puis, par petites quantités, l’eau jusqu'à dissolution. Faire agir ce colorant pendant quelques secondes, laver à l’eau et colorer le fond avec solution aqueuse de vésuvine à 0,1 p. 100.

Méthode de Ljubinsky (très recommandée) :

On fait agir sur la préparation, préalablement fixée par l'alcool absolu, la solution suivante (pendant 1/2 à 2 minutes) :

Pyoctanine. . . AE 0, 25 Acide acétique, sol. aqueuse à 15 P: ‘100.: . 100 cc.

Laver à l'eau, puis colorer pendant 30 secondes avec une solution de vésuvine à 1 p. 1.000 (aqueuse).

Les granulations du bacille diphtérique se colorent en bleu foncé. Elles apparaissent volumineuses. Les contours du bacille sont colorés en violet foncé.

Il n’y a pas de rapport étroit entre la présence de granulations et la virulence ; les faux diphtériques peuvent présenter parfois une granulation. Cependant, le plus souvent, ils n'en présentent pas. La valeur de cette réaction, quoiqu'importante, est relative.

DIAGNOSTIC DIFFÉRENTIEL PAR LA CULTURE POUR DÉ- TERMINER L'ACTION FERMENTATIVE SUR LES SUCRES. RE- CHERCHE DES PORTEURS DE GERMES.

Le bacille diphtérique fait fermenter le glucose et le lévulose, jamais le saccharose ni la mannite. Les bacilles

pseudo-diphtériques ne font fermenter ni le glucose, ni le saccharose, ni la mannite. Il est commode de se servir des milieux différentiels suivants :

Milieu de Thiel :

Peptone ne

Nutrose 1Ngre

Glucose mn

NaGi ET AA ES AE 0 5

Sol. de tournesol. . . . . 5 cc.

PAR NEUTRE ne. ST 00

Répartir en tubes qu'on ensemence avec chaque colonie suspecte, isolée à l'état pur. S’il y a fermentation, le tournesol rougit, la nutrose se précipite et le milieu se coagule.

Milieu de Rothe. — Mélanger 90 parties de bouillonsérum (4 parties de sérum de bœuf et 1 de bouillon neutre) avec 10 parties de solution de tournesol contenant 1 p. 10 du sucre à étudier et préalablement stérilisée.

Ce milieu, en tubes ou coulé en boîtes de Pétri, est coagulé par la chaleur comme le sérum de bœuf simple. Il est particulièrement commode pour la recherche des porteurs de germes.

Le bacille diphtérique fait virer au rouge les tubes ensemencés contenant glucose et lévulose. Il ne fait pas virer ceux qui renferment du saccharose ou de la mannite.

Milieu de Drigalski et Bierast (recommandé).

A 600 centimètres cubes de sérum de bœuf, on ajoute 174 centimètres cubes de bouillon contenant 1 p. 100 de glucose, et 26 centimètres cubes de bile de bœuf pure préalablement filtrée sur papier Chardin.

Ce mélange est versé, à raison de 16 centimètres cubes environ, dans des boîtes de Pétri et coagulé vers 90 à 95», à plat, puis stérilisé, trois jours de suite pendant une heure à 80°, comme le sérum gélatinisé ordinaire.

On frotte directement, à la surface de ce milieu, les tampons d’ouate qui ont servi à faire les prélèvements d’exsudat pharyngé : les colonies de bacilles diphtériques y sont déjà très apparentes après 16 heures à la température de 37°.

L. Martin et Loiseau ont montré que la culture en milieu de Veillon (gélose glucosée en tubes droits) permet de distinguer à coup sûr les vrais bacilles diphtériques des faux. Les vrais diphtériques se développent uniformément dans”

toute la masse de gélose sucrée, sur toute la hauteur du tube, sans étalement à la surface, tandis que les faux diphtériques, au contraire, se développent abondamment à l'air libre et envahissent toute la surface du milieu en formant une couche crémeuse, épaisse.

Milieu de Costa, J. Troisier et Dauvergne. — Le procédé de ces auteurs permet d'isoler et de déterminer le germe à identifier. Il est basé sur les propriétés fermentatives que le bacille diphtérique exerce sur le glucose, alors que les faux diphtériques sont sans action. Le milieu est le suivant :

Sérum'de chévals (st SM LINE 4 PIOCINRNONRRRIONNEC: Sol de glucose à 30 % stérilisée. . . . rent le 10 cc. Teinture de tournesol concentrée et stérilisée. POLAA As gtte Sol. d’acide sulfurique à 10 gr. p. 1.000, stérilisée.. . . . 3 cc.

L'acide sulfurique a pour effet de saturer partiellement l’alcalinité naturelle du sérum. L’addition d’acide et de glucose ne change rien aux propriétés électives du sérum pour la culture du bacille diphtérique.

Tous ces produits, après mélange, sont répartis en boîtes de Pétri à fond régulièrement plat, à raison de 10 à 12 centüimètres cubes par boîte. On coagule le milieu dans une étuve à sérum ou dans l’autoclave en élevant la température lentement et progressivement jusqu'aux environs de 80°. On l'y maintient pendant 1 heure 15. On rejette ensuite l’eau de condensation ; les boîtes peuvent être utilisées immédiatement.

Pourles ensemencer, on frotte une anse de platine triangulaire contre le coton ayant servi au prélèvement. On essuie l’anse sur toute la surface du milieu, par segments parallèles, sans la recharger.

Les boîtes ainsi ensemencées sont placées à l'étuve à 37°, le couvercle en dessous. |

Après 24 heures, les colonies du bacille diphtérique ont les dimensions d’une tête d’épingle ; elles sont rouges au centre, roses à la périphérie. Vues par transparence à l’aide d’une loupe, elles donnent l’image de travées sous la forme d'une petite croix. Légèrement glebuleuses, de consistance plutôt ferme, elles s’enfoncent dans le milieu à la façon de clous de tapissier.

Les colonies des bacilles diphtérimorphes sont opaques, blanc grisâtre et plus étalées.

Quelques heures plus tard, les colonies du bacille diphtérique restées circulaires ressemblent à une pustule variolique, tandis que les colonies des bacilles diphtérimorphes prennent une forme irrégulière, à bords dentelés.

Cet isolement doit être complété par l'examen des ‘colenies rouges, les seules parmi lesquelles peut se trouver le bacille diphtérique.

B. — Milieu de culture pour l'obtention de la toxine diphtérique.

Prendre 1 kilogramme de viande de veau qu’on passe au hache-viande et qu'on mélange à 2 litres d’eau. Laisser macérer pendant 20 à 24 heures à 36° au bain-marie (pour supprimer le glycogène, par fermentation).

Filtrer sur un linge, ajouter parties égales de bouillon de peptone L. Martin et 5 grammes de chlorure de sodium.

Stériliser pendant 45 minutes à 120°. Filtrer. Neutraliser exactement au tournesol. Alcaliniser ensuite en ajoutant 7 centimètres cubes par litre de solution de soude normale à 40 p. 100.

Stériliser à 120° pendant 20 minutes. Filtrer et répartir dans de grands ballons à fond plat, en couche ne dépassant pas 3 centimètres cubes d'épaisseur, pour assurer une large aération en surface. Porter à l’étuve à 37° après ensemencement, Le bacille diphtérique doit se développer en voile sur ce milieu. On filtre les cultures à travers les bougies Chamberland (marque F), du septième au neuvième jour.

Pour entretenir les propriétés toxigènes du bacille diphtérique, il faut le réensemencer dans ce bouillon en tubes à essai tous les deux jours.

Le bacille toxigène de choix est le bacille dit Américain (isolé par W. Park et William à New-York), qu'on utilise dans presque tous les Instituts sérothérapiques. d

Il est toujours prudent d’en conserver quelques semences sur sérum coagulé, en tubes scellés, à la glacière.

Pour rechercher la virulence des diverses souches de bacilles diphtériques, il est commode d'employer le procédé

de Zingher par injection intracutanée chez le cobaye : On épile la paroï abdominale et on injecte, à la dose de 0 cc. 15, une émulsion de culture de 24 heures dans l’épaisseur de la peau. Une inflammation nécrotique apparaît dans les 48 à

72 heures, s’il s’agit d'une race microbienne virulente.