L. — Milieux additionnés d’hémoglobine

10 grammes d’hémoglobine du commerce sont dissous dans 90 centimètres cubes d’eau distillée additionnée de 10 centimètres cubes de solution de soude à 10 p. 100. On stérilise à l’autoclave. On ajoute 1 centimètre cube de ce mélange à 9 centimètres cubes environ de milieu nutritif (gélose fondue, etc...).

On peut préparer soi-même l'hémoglobine en recueillant aseptiquement du sang de cheval ou de bœuf dans un bocal contenant 2 volumes d'eau salée physiologique pour 1 volume de sang. On laissé reposer à la glacière pendant 24 heures et on décante pour séparer les globules rouges. Ceux-ci sont additionnés d’une petite quantité d’éther. Par agitation, l’'hémolyse se produit très rapidement. On évapore l’éther dans le vide et on filtre, à travers une bougie Chamberland (marque F), la solution d'hémoglobine qui peut être employée telle quelle en mélange, en proportions variables, avec les milieux de culture.

M. — Milieux additionnés d'exsudats ou d'extrait d’organes (Ascite, liquide d'hydrocèle ou de kyste ovarien, exsudats leucocytaires).

Les liquides exsudatiques doivent avoir été recueillis aseptiquement. On les mélange en proportions variables avec les milieux de culture stérilisés. Les exsudats leucocytaires, pleuraux, péritonéaux, etc., dont la stérilité n’est pas certaine, peuvent être mélangés avec parties égales de glycérine à 309 Bé et on les conserve ainsi pendant plusieurs semaines avant de les utiliser. Pour s'en servir ensuite, on les mélange dans la proportion de 0,5 à 1. p. 100 aux milieux de culture liquides ou préalablement liquéfiés et on les maintient à l’étuve à 37° pendant 48 heures avant de les ensemencer.

Milieux à extrait alcoolique de foie.

Le foie de cheval est rapidement lavé à l’eau du robinet, découpé en petits morceaux et broyé finement au mortier de porphyre jusqu'à obtention d'une purée. On ajoute ensuite au foie son poids d’alcool à 900 et l’on continue à

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broyer pendant un quart d'heure. La purée alcoolique est placée dans des bocaux à large goulot où elle est agitée deux fois par jour. Au bout de trois jours, on filtre sur papier. Cet extrait alcoolique de foie se conserve très longtemps à la température ordinaire à l'abri de la lumière. L’extrait est ajouté au bouillon ordinaire en voie de préparation, immédiatement avant sa stérilisation. Le milieu ainsi préparé ne renferme donc pas d’alcool qui s'évapore pendant le chauffage. Si l’on veut obtenir des milieux tout à fait limpides, sans précipité, il suffit d'ajouter l'extrait avant la filtration du bouillon. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec le bouillon renfermant 10 à 12 p. 100 d’extrait.

L’extrait alcoolique de foie de cheval renferme 0,885 grammes de glucose par litre ; son acidité totale est de 0 gr. 390 p. 1000; l'extrait sec est de 0,475 grammes p. 100.

N. — Milieux vitaminés.

Recevoir du sang dans un flacon stérile contenant des perles de verre ; agiter pour défibriner ; mesurer la quantité de sang défibriné et étendre de trois à quatre fois le volume avec de l’eau physiologique ; chauffer à 80° pendant 15 minutes. Filtrer sur papier pour retenir les substances précipitées et stériliser par filtration à la bougie.

Ajouter ce liquide aux milieux de culture dans la proportion de 5 à 10 % (XX gouttes dans un tube de bouillon et X gouttes dans un tube de gélose en culot).

O. — Milieux de cultures anaérobies.

a) Le procédé le plus pratique pour cultiver les microbes anaérobies en milieux liquides consiste à répartir ces milieux (bouillon par exemple) en tubes ou en ballons et à recouvrir leur surface d’une couche épaisse de 10 à 15 millimètres environ d'huile de vaseline. On stérilise et on laisse refroidir dans l’autoclave fermé. On ensemence à la pipette, après refroidissement, à travers la couche d'huile.

C’est le procédé de choix pour le b. du tétanos (voir chapitre xL).

b) Pour les cultures sous cloche, on peut, soit faire le vide, soit absorber l'oxygène par le mélange suivant :

ACTU HVFOPAIIAUE Ne PR EL 10 gr.

Potasse caustique. 2 08 CEUX 10 gr.

ÉROECIS EI RS TRE PRE 100 ce.

Ce mélange doit être préparé et versé dans les vases immédiatement avant la fermeture de ceux-ci.

Il est commode d'avoir, toutes préparées, deux solutions : l’une de potasse caustique à 20 p. 100, l’autre d’acide pyrogallique à 20 p. 100. On les mélange en parties égales dans le récipient dont il s’agit d’absorber l'oxygène.

On peut aussi, très simplement, faire des cultures anaérobies en se servant de deux tubes concentriques : l’un, intérieur, bouché à l'ouate, contient le milieu de culture ensemencé {liquide ou solide) ; dans le tube extérieur ona versé 1 gramme d'acide pyrogallique en poudre. On y ajoute, avec une pipette, 1 centimètre cube de solution à 10 p. 100 de soude caustique et on bouche aussitôt avec un bon bouchon de caoutchouc qu'on recouvre de cire Golaz ou de paraffine fondue.

c) Substances réductrices susceptibles d'être incorporées aux milieux liquides ou solides (indicateurs de l'absence d'oxygène) :

Glucose, me Re M0 4015 p. 100: (Liborius, San Felice, Veillon).

Sulfo-indigotate de soude à 0,1 p. 100 : Salomonsen). Formiate de soude. . . . 0,3 à 0,5 p. 100 (Xitasato- Weil) Bleu de méthylène, sol. alcool. à 1 p. 100 qq. gtt. jusqu à faible coloration bleue.

d) Tubes de Veillon (procédé de choix pour les anaérobies intestinaux) :

On prépare de la gélose, additionnée de5 à 15 p. 1.000 de glucose et de 1 p. 1.000 de nitrate de potasse ”, que l’on répartit dans de gros tubes à essai (tubes de 2 centimètres

1. Le nitrate de potasse empêche la production de bulles de gaz hydrogène qui fragmenteraient la gélose et géneraient l'isolement ultérieur des colonies (Vellon et Marzé). On peut ajouter au nitrate, comme matière azotée animale, 1 centimètre cube de

sérum stérile de cheval ou de lapin, par tube Cette addition de sérum doit alors être "faite après la stérilisation de la gélose glucosée, lorsque celle-ci est refroidie aux environs de 90°.

de diamètre X 20) sur 10 à 12 centimètres de hauteur. On stérilise à l’autoclave, sans dépasser 120, pendant 20 minutes (pour éviter la caramélisation du glucose) et on solidifie rapidement en position verticale dans un courant d’eau froide.

On ensemence par piqüre profonde. La couche de gélose est assez épaisse pour empêcher l’accès de l'air au milieu et au fond du tube.

Le prélèvement des colonies s’effectue en piquant cellesci avec une pipette à effilure très fine.