C. — Vaccins mixtes

Castellani a préparé des vaccins mixtes dont l’utilisation s’est montrée inoffensive et efficace dans de nombreux essais effectués sur l’homme dans l'Inde. Ils sont constitués par des émulsions de cultures sur gélose dans l’eau physiologique, additionnées de 0,5 p. 100 d'acide phénique pur et non chauffées (sauf pour le bacille typhique et les paratyphiques qui sont chauffés à 53° pendant 30 minutes). On en fait 2 injections à une semaine d'intervalle, l’une de 1 centimètre cube, l’autre de 2 centimètres cubes (1/2 et 1 centimètre cube pour les enfants et les femmes).

Le vaccin mixte {yphique, paratyphiques À et B est titré à raison de 500 millions de bacilles typhiques et 250 millions de chacun des para par centimètre cube.

Le vaccin mixte choléra + peste est préparé avec des cultures de vibrions cholériques et de bacilles pesteux âgées de 3 jours, émulsionnées dans l’eau salée physiologique phéniquée à 0,5 p. 100, titrées chacune à 1 milliard de bacilles pesteux et2 milliards de vibrions par centimètre cube, abandonnées pendant 24 heures à la température du laboratoire puis contrôlées par réensemencement pour garantir leur stérilité avant l'usage.

Le vaccin mixte bacille typhique + par atyphiques A etB + peste + choléra est préparé de la même manière, mais les cultures de typhique et de paratyphiques, âgées seulement de 24 heures, sont chauffées à 53°, après avoir été émulsionnées dans l’eau salée physiologique phéniquée à 0,5 p. 100.

Le vaccin mixte bacille typhique + paratyphiques À et B + M. melitensis contient une émulsion de culture de mélitensis sur gélose âgée de 3 jours, non chauffée, titrée à 1 milliard il germes par centimètre cube. Les quatre espèces de microbes sont mélangées en parties égales. La dose à injecter est de 0 cc. 5 à 0 cc. 6 pour la première inoculation et de 1 centimètre cube à 1 cc. 2 pour la deuxième.

Le sérum des sujets injectés avec ces vaccins mixtes est agglutinant après 2 à 3 semaines pour chaque microbe, au même taux que s'ils avaient été traités par un seul microbevaccin isolément.

TECHNIQUE POUR LES VACCINS MICROBIENS 481

D. — Méthode de Sabouraud pour la préparation des vaccins staphylococciques.

Des cultures sur gélose-peptone glycérinée acétique (milieu de Sabouraud déjà indiqué) sont, après 48 heures de séjour à l’étuve à 37°, délayées dans de l’eau salée physiologique (environ 10 centimètres cubes par tube). L’émulsion est aspirée à la pipette et portée dans des tubes à centrifuger stériles. On centrifuge, on décante le liquide clair. Le culot, repris par 3 ou 4 centimètres cubes d’eau salée, est reporté à la centrifuge, mais cette fois dans un petit tube soigneusement taré avant l'introduction de l’émulsion microbienne.

On centrifuge, on enlève toute l’eau que la pipette peut aspirer, puis on pèse de nouveau le tube à la balance de précision. L'expérience montre que le culot contient environ 500 millions de cocci par milligramme.

Les microbes sont délayés dans de l’eau physiologique stérile à raison de 5 centimètres cubes de celle-ci pour 1 centigramme de dépôt. Chaque centimètre cube contient donc environ 1 milliard de cocci.

L’émulsion, ainsi faite au taux voulu, est portée dans un flacon bouché à l'émeri, stérile, et additionnée de son volume d’éther. On la conserve à la glacière pendant 24 heures et on l’agite de temps en temps.

On décante ensuite l’éther et on évapore ce qui en reste en portant le flacon immergé dans un cristallisoir contenant de l’eau tiède à 38°, sous une cloche à vide.

Le vaccin est alors réparti en ampoules qu’on scelle à la lampe et qu’on chauffe finalement pendant une heure dans un bain-marie à 600. Il est ainsi prêt à servir et se conserve longtemps. |

E. — Méthode de Ch. Nicolle et Blaizot.

Appliquée d’abord à la préparation d’un vaccin mixte antigono ét antisynococcique (voir chap. xxx1), cette méthode

MICROBIOLOGIE 31

a été adaptée par Ch. Nicolle et Blaizot à d’autres microbes (staphylocoque, coqueluche, etc.).

Elle consiste à émulsionner les cultures sur milieux sohides, raclées puis lavées par plusieurs centrifugations successives, non plus dans l’eau salée physiologique, mais dans une solution à 7 p. 1.000 de fluorure de sodium. La vitalité des microbes, et aussi leur toxicité, sont ainsi supprimées sans que le protoplasma soit altéré. Ils ne s’autolysent plus et conservent cependant toutes leurs propriétés antigènes.

Après 24 heures ou 48 heures de culture sur milieux appropriés, les microbes sont émulsionnés dans la solution de fluorure. puis centrifugés et lavés plusieurs fois dans cette même solution en vue d'éliminer toutes les substances toxiques (peptone, etc.) provenant des milieux nutritifs. L’émulsion finale est portée à la glacière où on la laisse pendant 48 heures à trois jours, puis on la titre par addition d’eau fluorée de telle sorte qu’elle renferme 500 millions de microbes par centimètre cube. Au moment de l’employer, on dilue ce vaccin dans deux volumes d’eau salée physiologique afin d'éviter la sensation légèrement douloureuse que provoque l'introduction du liquide fluoré dans les tissus.

Les vaccins antistaphylococcique et anticoquelucheux fluorés, contenant 250 millions de microbes par 1/2 centimètre cube (dose thérapeutique) sont chauffés 48 heures à 400. On les emploie en injections intramusculaires tous les 2 ou 5 jours.

F. — Méthode de Wright pour la numération des | germes contenus dans un vaccin microbien.

‘Cette méthode consiste à mélanger 1 centimètre cube d’'émulsion vaccinale (faite dans l’eau salée physiologique) colorée par une goutte de solution aqueuse à 1 p. 100 de bleu de méthylène, avec un égal volume de sang humain (dont on a déterminé, au préalable, la richesse en globules rouges 1) et avec 3 centimètres cubes d’eau salée physiolo-

gique.

: La teneur normale du sang humain en hémat:es est de 5 milliards par centimètre cube.

TECHNIQUE POUR LES VACCINS MICROBIENS 483

‘On prélève une goutte de ce mélange qu'on étale sur une lame porte-objet et qu'on laisse sécher. Les microbes apparaissent légèrement teintés en bleu parmi les hématies.

Dans plusieurs champs du microscope pourvu d’un oculaire micrométrique ou quadrillé, on compte, d’une part les hématies et, d'autre part, les éléments microbiens. Il ne reste plus qu à établir le rapport des uns aux autres pouren déduire le nombre de microbes contenus, par exemple, dans 1 centimètre cube du vaccin.

Si on trouve une moyenne de 36 hématies et de 20 bacilles par champ microscopique, le rapport est :

X (représentant le nombre de bacilles contenus dans 1 centimètre cube de vaccin) — 2.800.000.000 par centimètre cube,

On peut aussi, comme le fait M. Neisser, mélanger avec une pipette à tétine de Wright, 1 volume de sang, 1 volume de solution de citrate de soude à 1,5 p. 100 et 1 volume d'émulsion vaccinale. On fait, avec ce mélange, des préparations sur lames, on sèche à l’étuve et on fixe dans le sublimé saturé, puis on lave à l’eau et on colore par la thionine phéniquée. On compte ensuite 500 hématies dans un certain nombre de champs et les microbes qui se trouvent dans les mêmes champs. Supposons qu’on en ait trouvé 670. On établit alors la proportion suivante :

30Û — 6.700 000.000 de microbes par cc.

XtE==

Dans la pratique courante, la méthode de titrage par pesée

de Sabouraud ci-dessus décrite (D) est beaucoup plus expéditive et donne des résultats suffisamment précis.

G. — Méthode de numération à l’hématimètre (Salimbeni).

Employer l’hématimètre Thomas-Zeiss dont chaque carré correspond à 1/4000e de millimètre cube. Faire des dilutions de plus en plus étendues de l’émulsion microbienne avec de l’eau formolée au 1/100, légèrement

colorée par la fuchsine, de façon à obtenir un maximum de 10 germes par petit carré de l’hématimètre. On note le titre de la dilution, on prend lamoyenne des germes contenus dans un petitcarréet on multiplie par 20 millions. Ce chiffre de 20 millions correspond, pour le modèle d'hématimètre précédent, à la quantité de germes contenus dans 1 centimètre cube lorsque chaque petit carré en contient 1. En tenant compte du taux de la dilution employée, il sera facile de calculer la teneur en germes de l’émulsion mère et de la ramener ensuite au titre convenable en la diluant.

H. — Numération des germes par mesure de l'opalescence des émulsions.

On peut également préparer, pour un microbe donné, des émulsions- Out contenant un nombre déterminé de germes qui serviront à étalonner les émulsions de la même espèce microbienne en comparant leur degré d’opalescence. Les différences d’opalescence entre deux émulsions restent appréciables lorsque la différence du nombre des germes est supérieure à 25 millions au centimètre cube. Quand le titre microbien des émulsions est supérieur à 400 millions de germes au centimètre cube, leur opacité est trop intense pour que d'aussi faibles différences apparaissent avecnetteté.

Il est indiqué de préparer une série d’émulsions-tests en eau formolée à 0,5 pour 100 contenant de 50 à 400 millions de germes par centimètre cube et dont la concentration augmente de 50 millions par tube. On scelle les tubes à la lampe et on les conserve à l'obscurité. Les tubes servant à comparer les émulsions vaccinales avec les émulsions-tests doivent être de même calibre et de même verre.

I. — Dosage des vaccins bactériens par le diaphanomètre de Léopold Robert (Stiassnie, constructeur).

Léopold Robert a appliqué à la détermination du degré d’opalescence le principe de l’hémoglobinimètre de Gowers

TECHNIQUE POUR LES VACCINS MICROBIENS 485

et Sahli. Il a fait construire, à cette fin, par M. M. Stiassnie, un appareil: le diaphanomètre bactérien.

Ce diaphanomètre se compose de deux tubes de diamètres et de parois exactement semblables. Le tube A est gradué en quarts de centimètre cube de 0 centimètre cube à 15 centimètres cubes et coiffé d’un bouchon de caoutchouc qui en permet le renversement (il n'y a pas intérêt à descendre au delà de cette graduation en quarts de centimètre cube). Le tube B contient la suspension microbienne étalon qui va servir de point de comparaison. Il est scellé à la lampe et peut, par conséquent, être facilement agité. [Il y a autant de tubes B que de variétés de vaccins. Les deux tubes sont supportés dans un montanten aluminium brunidontla forme rappelle celle de l’hémoglobinimètre de Gowers et Sahli et qui a l'avantage de ne laisser passer les rayons lumineux qu'au travers des émulsions microbiennes, rendant ainsi la lecture très rapide.

Le principe consiste : 1° à faire, à l’aide des cultures, une suspension microbienne épaisse de volume connu ; 2° à prélever un volume également connu de cette suspension épaisse et à l’introduire dans le tube À ; 3° à amener par addition progressive du liquide de suspension (eau salée ou eau fluorurée) l'opalescence du tube A et du tube B à égalité.

Soit P le volume total de suspension microbienne épaisse, soit N le volume de cette émulsion sur laquelle on opère, soit R la quantité de liquide de suspension ajouté (R — le chiffre obtenu sur la graduation, diminué de N).

La quantité L du liquide de suspension à ajouter à l’émulsion microbienne épaisse totale pour obtenir un vaccin de même richesse que le tube étalon sera :

MPEG R LE Xk

J. — Vaccins anticholériques.

Pour la préparation des vaccins anticholériques, on peut admettre avec Kolle qu'une culture sur gélose inclinée en tube (ensemencée sur toute sa surface) fournit environ 20 milligrammes de vibrions. On délaye cette culture dans 10 centimètres cubes d’eau salée physiologique. Chaque centimètre cube correspond alors à 2 milligrammes de vibrions.

On chauffe cette dilution pendant 1 heure à 58°et on peut

y ajouter ensuite 3 pour 1.000 d'acide phénique. La dose vaccinale est, pour la première injection, 1 centimètre cube, pour la seconde (8 à 10 jours après), 2 centimètres cubes.

Pendant la grande guerre, afin d'obtenir un vaccin anticholérique aussi actif que possible en très grandes quantités, B. Fischer, L. Bitter et G. Wagner (de Munich) ont préparé leur milieu de culture tout simplement avec une décoction de 30 grammes delevure de brasserie dans 1.000 centimètres cubes d’eau de conduite, salée à 5 grammes par litre et solidifiée par15 grammes pour 1.000 de gélose. Au lieu de tuer les vibrions par chauffage au bain-marie à 53°, ce qui est assez difficile à réaliser sur de grandes masses d’émulsions sans laisser des germes vivants, ces expérimentateurs stérilisent leurs cultures en ajoutant à l’émulsion faite en eau salée physiologique, pour chaque litre, 37 cc. 5 d’HCI normal. Ils agitent, laissent en contact 10 minutes, puis neutralisent avec 24 centimètres cubes de lessive normale de soude.

On constate, par l’expérimentation sur les animaux, queles vaccins ainsi préparés déterminent la formation d'anticorps aussi activement que ceux provenant de cultures tuées par chauffage. Chez l’homme ils ne provoquent pas de phénomènes réactionnels plus intenses.

Le bacille dysentérique doit être chauffé 1 heure à 60°

— pesteux — — 65° Les streptocoques — — 60° Le pneumocoque — — 600

Les staphylocoques

Les « auto » ou « hétéro vaccins » microbiens destinés à l'usage thérapeutique sont généralement dilués et conservés dans une solution d'acide phénique à 0,5 p. 100 ou de lysol à 0,25 pour 100. Leur titrage est effectué de telle sorte que 1 centimètre cube renferme, d’après Wright :

Four le staphylocoque. . . . . 100 à 500 millions — stteptocoque Mr UE 5:à 19 — — pneumocoque. +. . . . 5 à 10 — — HONOÔCOQUE NE. Meter 5 à 10 — — acné M VeE 8 —

— vaccin mixte (acné et staphylocoque) 8 millions d’acné, 200 millions de staphylocoques.

— bac.Atyphique l'/20 8x 1à 2 milliards

Bacsicolili ORAN 5 à 50 millions

— bac. tuberculeux 0 mgr. 002 et 0 mgr. 005

j (émulsion bacillaire de Koch).

. TECHNIQUE POUR LES VACCINS MICROBIENS 487

K. — Entéro-vaccins,

a) Méthode de À. Lumière et J. Chevrotier. — On inclut dans de petites capsules de kératine de grandes quantités de corps microbiens, d’abord débarrassés par des lavages et centrifugations successifs, des exotoxines produites dans les milieux de culture, tués ensuite par une heure de chauffage à 50°, puis desséchés et réduits en poudre.

L'enveloppe de kératine n'étant pas attaquée par le suc acide de l'estomac, mais seulement par le suc intestinal, les corps microbiens ne se trouvent mis enliberté que dans l’intestin grêle, de sorte que leurs chances d'absorption sont ainsi beaucoup accrues, d'autant que chaque capsule ou sphérule contient une assez grande quantité de microbes (300 millions de bacilles d'Eberth, 120 millions de paratyphiques et 180 millions de Bacterium coli).

Ingérée à la dose de 3 milliards de corps microbiens par kilogramme d'animal, entrois fractions, à 8 jours d'intervalle, cette préparation, d’après les auteurs, confère au lapin et au cobaye l’immunité contre l'infection expérimentale par une dose sûrement mortelle en 24 heures de bacilles d'Éberth ou de paratyphique.

b) Méthode de Besredka. — Desexpériences effectuées sur le lapin ont conduit Besredka à user d’un artifice pour sensibiliser l'intestin de cet animal et faciliter ainsi l’absorption des bacilles tués par chauffage, en évitant, comme A. Lumière et Chevrotier en avaient eu les premiers l’idée, leur destruction dans l’estomac. Cet artifice consiste à utiliser la bile de bœuf stérilisée qu'on fait ingérer au lapin à la dose de 5 centimètres cubes, seule ou en mélange avec un peu de poudre de réglisse pour la rendre moins amère. Une ou deux ingestions de bile, quelques heures avant l’ingestion d’une quantité convenable de culture de bacilles tués par chauffage, suffisent à assurer l'absorption des microbes par la muqueuse intestinale et à réaliser l’immunité, même contre l’inoculation de virus dans les veines. Cette technique a été appliquée à la vaccination antidysentérique, antityphoïdique, anticholérique et antipesteuse.