I. Couleurs d’aniline

À. — COLORANTS BASIQUES

a) Fuchsine (chlorhydrate, acétate ou suifate de rosaniline, dérivé du triphénylméthane). Divers noms commerclaux : rubine, roséine, fuchsine-diamant, rouge magenta, rouge solférino.

Excellent colorant nucléaire. Très soluble dans l’alcool. L'eau n’en dissout que 0,3 p. 100.

Solution de Ziehl. — Triturer dans un mortier :

HUE SIM Rd et Ua. Te Acide phénique cristallisé. . . . . . . 5 gr. AILCO AS OO RE A OT LE Le 10 ce.

Reprendre dans le mortier par :

RAILS EEE TU 2 90 cc.

Filtrer.

Après coloration par le Ziehlon peut différencier, c'est àdire éliminer l'excès de colorant quin’est pas fixé sur les éléments électifs, soit par l’alcocl à 95°, soit par l'alcool aniliné (10 volumes d’aniline pour 90 volumes d'alcool absolu), soit par le gaïacol (solution à 10 p. 100 dans l'alcool à 90b).

b) Safranine (chlorhydrate de tolusafranine ou rose d’aniline). Peu soluble dans l’eau (0,6 p. 100), très soluble dans l'alcool. Excellent colorant nucléaire. Il est avantageux de la conserver en solution alcoolique saturée et de diluer quelques gouttes dans l’eau saturée d’aniline au moment de s'en

1. Les colorants sont actuellement préparés dans des usines françaises : Société des matières colorantes de Saint-Denis. Produit RAL des établissements Kuhlmann. Les produits RAL sont spécialement étudiés pour les recherches de laboratoires. Ils ont été mis au point à l'Institut Pasteur qui continue à les contrôler. On les trouve à la Société Kublmann, 16, rue de Miromesnil, à Paris, et aux établissements Poulenc frères, 122, boulevard Saint-Germain, chez Cogit, Jouan, etc.

servir. On différencie avec l'alcool à 95° ou avec l'alcool acidulé par 0,5 p. 100 d'acide chlorhydrique.

Formule de Babës (recommandée) : préparer d’avance, dans un grand flacon, de l’eau d’aniline saturée (une eau d’aniline ancienne donne, en effet, de meilleurs résultats qu'une eau préparée extemporanément). On la filtre, au moment de l'emploi, sur un filtre mouillé et on la sature de safranine.

c) Bleu de méthylène (thiazine, chlorhydrate ou chlorozincate de tétraméthyl-thionine). Marque RAL spécialement recommandée. C’est un colorant puissant, non toxique pour les éléments cellulaires, vivants, à forte action élective sur les noyaux, les granulations basophiles du sang, la substance protoplasmique basophile des leucocytes, des hématies, des plaquettes, la mucine et les granules de Nissl des cellules nerveuses.

Il est très soluble dans l’eau et l'alcool. Les solutions mères alcooliques saturées se conservent bien. Son pouvoir ünctorial est plus considérable en solution alcaline.

Bleu de Lüfjler :

Solution alcoolique saturée de bleu. . . 1 vol. Solution aqueuse de potasse à 1 p. 10.000. 2 vol.

Ou bien, au lieu dela solution de potasse, eau saturée d’aniline et filtrée (l’aniline est soluble à 3 p. 100 dans l’eau). Les préparations colorées au bleu de Lôffler doivent être différenciées par lavage rapide à l’eau acidulée par 0, 5 p. 100 d'acide acétique, puis par une solution aqueuse de 10 grammes de tanin (préparé à l’éther) dans 100 cc. d’eau (8 à 10 secondes).

Le bleu de méthylène pur n'est pas polychromatique. Un traitement chimique en milieu alcalin le transforme très facilement en dérivés d’oxydation (azur et violet de méthyle). Ces deux colorants, ou leur mélange avec du bleu de méthylène inattaqué, constituent des produits permettant d'obtenir des réactions métachromatiques très belles et des différenciations parfaites entre les éléments cellulaires.

Ce processus d’oxydation en milieu alcalin intervient dans la préparation des bleus Borrel à l'argent, de Lôffler à la potasse, des bleus boratés, des azurs de Giemsa, des préparations de Tribondeau à l’'ammoniaque, etc.

Préparation du bleu Borrel:

Dans une fiole de 150 cc. environ on met 3 ou 4 grammes de cristaux d’'azotate d'argent et 50 à 60 cc. d’eau distillée. Quand les cristaux sont dissous on remplit la fiole avec une solution de soude à 10 p. 100 eton agite. Il se forme un précipité d'oxyde d'argent qu'on décante et lave à plusieurs reprises à l’eau distillée, jusqu'à ce que le liquide qui s'écoule ne bleuisse plus le papier de tournesol. On verse alors, sur l’oxyde d'argent, une solution aqueuse à 1 p. 100 de bleu médicinal RAL. Le bleu de méthylène, ainsi oxydé, forme un mélange d'azur de méthylène et de violet de méthylène. On laisse en contact, pendant trois semaines au moins, en agitant à plusieurs reprises, et on filtre ; ou bien, si l’on est pressé, on mürit immédiatement la solution en la chauffant pendant 45 minutes, au moins, à 120°, à l’autoclave. Ce liquide colorant est très stable. Il convient particulièrement à la coloration du sang et de ses parasites.

Azur Î1(de Giemsa) :

Mélange de chlorhydrate d'azur de méthylène (azur [) et de chlorhydrate de bleu méthylène. Excellent colorant qu'on peut substituer avantageusement au bleu de Lôffler :

Solutions mères :

AREA ZUNE II TRE CENTER D, 2 Ipor: .

Eau phéniquée à 5 p. 1.000. . . . 100 ce B — Carbonate de sodium à 1 p. 100.

On dilue, au moment de s’en servir, 1 cc. de solution À dans 10 ou 20 cc. d’eau distillée (jusqu’à obtention d'une solution transparente). À 10 cc. de cette solution on ajoute 5 à 10 gouttes de B. Colorer 10 à 15 secondes. Laver à l’eau et sécher.

Pour les usages courants du laboratoire, on emploie géné ralement les solutions de bleu phéniqué de Kühne ou boraté de Kolle, qui se conservent bien :

Bleu phéniqué de Kühne :

On broie dans un mortier :

Bleu de méthylène médicinal. . . . . 2 gr.

Acide phénique cristallisé. . . . . . 2 gr.

AICOQl. 45950, 0 Ar RL 1UECC.

On verse dans un flacon bouché à l’émeri et on laisse la couleur se dissoudre lentement. Après 24 heures, on ajoute:

Pre disulliées 2 EE RER ER Ne 100: ec.

On agite et on filtre.

Bleu boraté de Kolle :

Solution de 2 grammes de bleu médicinal dans une solution aqueuse de borax à 5 p. 100. Les colorations sont meilleures avec un liquide préparé depuis quelques jours.

d) Le bleu polychrome de Unna (marque RAL) est une préparation spéciale très métachromatique, c'est-à-dire qui permet de colorer en nuances caractéristiques les différents éléments chromotropes des cellules ou des tissus (par exemple la substance amyloïde en violet, la mucine et les tissus cartilagineux en rouge). Après son emploi, on doit laver rapidement et différencier par l’éther glycérique de Unna étendu de 5 parties d’eau, puis laver à fond à l’eau distllée et déshydrater à l'alcool absolu.

e) La thionine (violet de Lauth) possède des propriétés métachromatiques analogues. Son emploi est très commode avec la formule de Maurice Nicolle :

Limité sy: SRE A PRRRNRENTES L'AHESTE 0 gr. 5 ë Alcoobabsolu SPACE 10 ce.

Acide phénique cristallisé. . . . . . . JBL.

Triturer et laisser dissoudre 24 heures dans un flacon, puis ajouter :

Lou distiilée. US RON ER 90 cc.

et filtrer.

Les colorations sont meilleures avec les solutions vieilles d’au moins 3 semaines. Pour différencier, on lave à l’alcool à 800 ou 90.

Le vieillissement étant assez inconstant, nous recommandons le mode opératoire suivant, qui permet d'obtenir une solution parfaite, immédiatement utilisable :

. Dissoudre la thionine à saturation dans l’eau distillée.

Précipiter par une solution de soude caustique à 10 p. 100. Recueillir le précipité sur un filtre et Le laver à l’eau distillée jusqu à ce que le liquide sortant du filtre ne soit plus alcalin.

Reporter le précipité dans un flacon et l'y dissoudre à saturation dans eau phéniquée à 2 p. 100. Laisser reposer 24 heures.

La solution est dès lors prête à l'usage.

F) Le bleu de toluidine (chlorozincate de diméthyltoluthionine) est également très utilisé et offre sensiblement les mêmes avantages que la thionine. On peut l’employer pour les colorations vitales, comme le bleu de méthylène, parce qu'il n'est pas toxique. Pour les préparations de frottis fixés ou de coupes, on se sert de solutions à 1 ou 2 p. 100 dans l’eau phéniquée, ou boratée à 1 p. 100. On différencie avec une solution aqueuse de tanin à 10 p. 100 ou avec l'alcool absolu additionné de 1 p.100 d’acide oxalique.

g) Violet de méthyle ou violet de Paris, violet 5 ou 6 B, mélange de chlorhydrates de tétra, pentaet hémaméthylpar arosaniline. Très soluble dans l’eau, l'alcool, le chloroforme.

Employé en solution dans l’eau saturée d’aniline (10 cc. de solution alcoolique saturée, dans 100 cc.)avec différenciaton par l'alcool ou par l’iode (solution de Lugol) et l’alcool Ou bien en solution acétique :

Solution saturée dans l’alcool à 96°. . . 10 ce. Eau distillée . . Mes TOUS 20 cc.

Acide acétique cristallheable DEC ra 2 ce. 5

Colorele protoplasma cellulaire en bleu, la substance amyloïde en rouge.

h) Violet de gentiane.

Mélange de violet de méthyle et de violet cristallisé (chlorhydrate d’hexaméthyl-pararosaniline avec un peu de dextrine).

Pour les frottis, exsudats, cultures et pour la réaction de Gram, on emploie la solution suivante, qui se conserve bien:

Solution alcoolique saturée de violet de

gentiane. . IN SEP EE" 10 «ec Eau phéniquée à 1 p. 100 RENE ONN ES:

Pour les coupes à différencier par le Gram, la formule , . FE d'Ehrlich est meilleure

Nioletide SEntIANe. M RU RL. LUE Alcool. ; RL AE ee DEA PRE ES 15 ce.

Eau saturée d’ Hi RS RENE Pr, TRS nee 85 cc.

i) Violet benzylé (ou violet méthyl 5B, 6B, TB, violet 6B). Mêmes techniques. Coloration plus bleue qu'avec le violet de méthyle.

j) Violet cristallisé (chlorhydrate d’hexaméthyl-pararosaniline). Très soluble dans l’eau et l’alcooi.

On peut employer une solution à 1 p. 30 dans l'alcool à 99° pour colorer le bacille tuberculeux parexemple, et différencier par l'acide azotique à 0,1 p. 100, puis rapidement par l'alcool. |

On l'utilise aussi pour la préparation du milieu de Drigalski-Conradi qui sert à isoler le bacille typhique (voir chap. xxxIH1).

k) Vert de méthyle (vert à l’iode).

Soluble dans l'alcool et l’eau, insoluble dans l’alcool amylique et le chloroforme.

Excellent colorant pour la chromatine nucléaire ; colore faiblement les microbes. On l’emploie en solution saturée dans l'alcool absolu, à laquelle on ajoute 0,5 p. 100 d’acide acétique cristallisable. Il faut ensuite différencier et déshydrater les préparations par l'alcool absolu additionné de 1 p. 100 d'acide acétique.

1} Le vert Malachite (chlorozincate, oxalate ou sulfate de tétraméthyldiamidotriphényl-carbinol, vert de Chine, vert diamant, malachite) est d’un usage courant. On l’emploie à l’état de chlorozincate pour la différenciation du bacille typhique selon la méthode de Lôfiler.

m) La pyronine est souvent utilisée comme couleur basique pour la préparation de mélanges neutres. Ses solutions aqueuses sont rouges et fluorescentes.

On l’associe parfois au vert méthyle (Pappenheim) pour colorer les éléments basophiles.

n) Vésuvine (colorant azoïque, brun de phénylène ou de crésylène, brun de Bismarck.) Colorant brun qu'on doit dissoudre dans l’eau à l'ébullition et qu'on filtre après refroidissement. S'emploie en solution aqueuse à 1 p. 100 pour teindre en brun les noyaux, les cartilages, la mucine et aussi les microbes. On différencie par l'alcool absolu. Surtout employé pour les doubles colorations et parfois pour les colorations vitales.

o) Rouge neutre (marque RAL). Très soluble dans l’eau qu'il teinte en rose légèrement violacé. Avec une faible trace

d'acide organique il devient rouge fuchsine et, avec les alcalis, jaune brun. La faible teneur en alcali des eaux de source suffit à le faire virer au jaune brun.

Ce réactif entre dans la composition de beaucoup de milieux de culture spéciaux. Il colore, comme les couleurs basiques, les noyaux et les substances basophiles. Il teint en rouge le protoplasma des leucocytes et des lymphocytes, les granules basophiles des mononucléaires, les granules de Nissl, la mucine.

On l’emploie également en solution à0,5 p.100 dans l’eau salée physiologique pour les colorations vitales dusang. Il colore en rouge les cellules et tissus vivants. Il n'est pas toxique, de sorte qu'on peut l’injecter dans l'organisme des petits animaux.

B. — COLORANTS DIFRECTS

Rouge congo. Azoïque (benzidine tétrazotée sur 2 molécules de naphtionate de sodium).

Employé pour les celluloses et les colorations vitales. Solution à 0,5 p.100 dans l’eau. Très sensible aux acides qui le font virer au bleu.

Benzo-bleu brillant 6 B ou bleu pur direct 6 B (dianisidine tétrazotée sur 2 molécules acide SS).

Non toxique. Employé pour les colorations vitales. Très soluble dans l'eau.