II. — Recherche des espèces anaérobies

L'anaérobiose découverte par M. Pasteur, contestée d'abord par M. Brefeld et plusieurs autres savants, est aujourd'hui universellement admise; Tobservation de l'anaérobiose chez les êtres infiniment petits nous offre un moyen très précieux pour caractériser certaines bactéries et effectuer la séparation de cette classe d'organismes des êtres appelés par opposition aérobies.

On appelle microbe anaérobie celui qui peut vivre à l'abri de l'oxygène gazeux et qui se montre capable de respirer au moyen de l'oxygène des substances plastiques ou hydrocarbonées. Plusieurs de ces êtres anaérobies peuvent également se multiplier au contact de l'air, y présenter même une végétation très luxuriante; ces êtres sont alors appelés anaérobies facultatif s ; on pourrait, il me semble, réserver le nom ^anaérobies parfaits aux micro-organismes qui ne peuvent croître qu'à l'abri absolu de l'oxygène de l'air, comme, par exemple, le microbe du tétanos et du charbon symptomatique.

Pour cultiver les êtres anaérobies on a vanté de nombreux procédés ayant tous évidemment pour objet de soustraire les micro-organismes et leurs

semences à l'action de l'oxygène gazeux. M. Pasteur a employé à cet efl'et des vases entièrement pleins de liquides fermentescibles, stérilisés, dont la tubulure effilée et recourbée en col de cygne plongeait dans du mercure purgé de germes. M. le D' Buchner a conseillé d'absorber l'oxygène gazeux dans l'enceinte même de la culture au moyen des pyrogallates alcalins. Le D*" E. Roux a pensé, avec raison, que les organismes aérobies pouvaient se charger de cette absorption laissée par M. Buchner au soin des substances chimiques oxydables. Le vide peut être, de même, employé avec succès, et à son défaut les gaz inertes, tels que l'azote, l'hydrogène purs amenés dans les milieux de culture pour balayer d'abord l'oxygène gazeux et ensuite pour les entourer d'une atmosphère inactive.

D'autres, je le répète, ont employé à tort l'acide carbonique gazeux et le gaz d'éclairage qui, s'ils ne s'opposent pas à la vie de plusieurs microbes anaérobies, frappent de mort ou paralysent le développement d'un grand nombre d'espèces.

De tous ces procédés, la méthode employée tout d'abord par M. Pasteur, est celle qui me semble donner les résultats les plus satisfaisants, car il est plus facile de chasser par la chaleur l'air dissous dans les substances nutritives ou adhérant aux vases, que par les pompes à vide, dont le fonctionnement n'est pas toujours parfait. Pour avoir un milieu propice aux anaérobies, il suffit donc de chasser complètement l'oxygène de l'air, et cela fait, de s'opposer à ce qu'il puisse revenir en contact avec le milieu nutritif.

On arrive aisément à obtenir des bouillons, des jçélatines, des géloses absolument privées d'air en les M. 9

recouvrant avant leur stérilisation d'une forte couche d'un mélange de paraffine et de vaseline.

Vaseline 98

Paraffine 2

On peut aussi ajouter à cette composition quelques centièmes de cire vierge, ce qui augmente l'infusibililé du mélange qui ne fond pas encore à la température de 40®.

Pour les cultures à haute température on se servira avec avantage du mélange suivant, rétractable, il est vrai, dans sa partie centrale, mais très adhérent au verre et infusible à 5o®.

Vaseline 90

Cire blanche 8

Paraffine 2

Ces compositions sont imperméables à l'air; elles sont assez plastiques pour prendre à la température ordinaire la forme des vases sous l'influence de la pression atmosphérique; elles permettent de plus aux liquides de se dilater sans cesser d'adhérer aux parois des vases de verre, par conséquent elles ne laissent jamais échapper la moindre goutte de liquide inclus. Par mesure extrême de précaution, on peut d'ailleurs, si l'on veut, verser au-dessus des couches solides une seconde couche de mercure de plusieurs centimètres de hauteur.

On a conseillé, pour remplir le même but, les huiles et les hydrocarbures liquides à la température ordinaire. Je ne crois pas qu'avec ces substances on puisse s'opposer d'une façon absolue à l'accès de l'air à la surface des milieux nutritifs. Les huiles sont

d'ailleurs d'un emploi très peu recommandable : souvent elles troublent les milieux de cultures, se saponifient partiellement à Tautoclave, ne présentant en un mot que des inconvénients et pas un seul avantage. Pour la recherche et la culture des organismes anaérobies, je conseille l'usage des flacons cylindriques de Freudenreich (voiry?^. i8) de 3 à 5 centi-

F'ig. i8.

Flacon de M. de Freudenreicli,

niètres de diamètre, munis d'une couche de gelée ou de bouillon de o°*,02 de hauteur sur laquelle on verse une couche d'égale épaisseur de vaseline paraffinée. On peut encore employer des petits tubes à essais non étranglés et de dimensions longitudinales très restreintes. Ces vases stérilisés à l'autoclave une fois refroidis sont prêts à servir.

Us peuvent être mis en expérience de la manière suivante :

Les vases contenant le terrain nutritif sont placés à l'étuve, chauffée vers 45% jusqu'à ce que la couche isolante blanche ait fondu et repris l'apparence d'un liquide parfaitement limpide. Alors, au moyen d'une pipette flambée graduée, très effilée, on porte le liquide à analyser dans la couche nutritive en imprimant à l'effilure un mouvement circulaire lent pen-

dant récoulement de Peau à analyser, de façon à la répartir aussi également que possible dans la gélatine. Quand on opère avec des bouillons, cette précaution est superflue.

L'espèce développée à l'abri de Pair dans les cultures liquides, on va à sa recherche, au moyen de pipettes à pointes très fines en traversant de part en part la couche isolante, ou, si c'est une colonie formée dans les gelées, on peut, au moyen de tubes de verre flambés à paroi mince, enlever la couche isolante dans la direction de la colonie ; ce tube creuse pour ainsi dire une sorte de puits jusqu'au substratum solide dans lequel on dirige un fil de platine pour prélever quelques parcelles de la colonie à la manière habituelle. Si l'opérateur a quelque habileté, au lieu de se servir du fil de platine, il continuera à enfoncer le tube de verre dans le terrain nutritif et saisira en son entier la végétation microbienne; il la ramènera aisément au dehors par un mouvement brusque et tournant du tube dont l'extrémité supérieure sera hermétiquement fermée avec le doigt. Le tube agit dans ce cas comme un emporte-pièce, et, en soufflant avec une certaine force par son extrémité supérieure, on en fait sortir le boudin de substance nutritive ayant englobé la colonie.

La quantité d'eau à introduire dans les milieux nutritifs pour étudier les espèces anaérobiennes, doit être environ loo fois plus élevée ,que pour la numération des bactéries par le procédé mixte.

L'eau de la Vanne, choisie comme exemple, renferme très peu d'organismes anaérobiens, de 2 à 10 par centimètre cube, alors qu'elle montre en moyenne 800 bactéries sous le même volume. Les eaux de

rivière devront être diluées au millième, et on ajoutera I centimètre cube de cette dilution dans les milieux tenus à l'abri de l'air. L'eau d'égout sera diluée seulement au i : loooo, etc.

L'observateur qui se livre à l'étude des anaérobies ne perdra pas de vue que la gélatine, tenue à l'abri de l'oxygène atmosphérique, bien que non visiblement peuplée de colonies, fourmille de germes invisibles qui n'attendent que l'afflux d'un peu d'air pour se développer manifestement. Cette considération devra donc l'obliger d'aller très soigneusement à la recherche de l'espèce anaérobie; il puisera la semence destinée aux cultures dans le sein même de la colonie, et, pour plus de sûreté, il procédera à des purifications successives effectuées à l'abri de Tair.

La plupart des microbes anaérobies que l'on récolte ainsi sont de même aérobies, les êtres anaérobies/?arfaits étant d'une grande rareté.

C'est par une étude ultérieure, c'est en pratiquant des cultures à 3o®, 4o° et 50** dans les bouillons et la gélose, qu'on parvient à caractériser ces diverses espèces. Ici particulièrement on doit se défier de la «gélatine qui se montre très souvent impropre à l'éclosion et à la multiplication des anaérobies parfaits, tandis que ces derniers croissent au contraire très bien dans les bouillons peptonisés chargés de sucre ou d'un peu de glycérine (2 pour 100 environ).

ni. — De la recherche des espèces zymogènes.

Il s'agît, dans le cas que nous envisageons, de déterminer les ferments figurés connus aujourd'hui sous

les noms de ferments lactiques, butyriques, acétiques : 'les microbes producteurs d'alcool, d'acide sulflndrique; les agents de la transformation de l'urée en carbonate d'ammoniaque, de la nitrifîcation, etc. Pour diagnostiquer ces espèces douées de fonctions biochimiques bien nettes, il importe de laisser àl'arrière-plan tous les caractères microscopiques tirés des modes de croissance de l'aspect des cultures, et de placer ces espèces dans les milieux où elles sont capables de produire en abondance les substances qu'elles savent élaborer. On devra donc pouvoir créer à volonté des milieux sucrés, alcooliques, chargés d'urée, de soufre, de sels ammoniacaux, etc. ; mais, comme il est difficile d'avoir à sa disposition à l'avance, même dans un laboratoire bien outillé, des milieux de cultures stérilisés chargés de toutes les variétés de sucres et de bien d'autres substances propres à caractériser les ferments, on pourra se contenter d'avoir sous la main un milieu nutritif solide et liquide type ou normal, auquel on ajoutera extemporanément au moment de l'ensemencement un volume connu de telle solution appropriée stérilisée à l'avance.

Si, dans 9*^*^ de gélatine fondue, on incorpore i*^*^ de sirop simple, on obtiendra un milieu renfermant environ 10 pour 100 de saccharose; si c'est un égal volume de solution d'urée à 5o pour 100 qu'on ajoute encore à 9*^^ de gélatine, le milieu formé contiendra une quantité d'urée équivalant à 5o pour 1000, etc. Pour mettre en évidence les qualités sulfhydiogènes de plusieurs microbes, on ajoutera aux bouillons ou aux gelées quelques centièmes d'un lait de soufre précipité; pour favoriser le développement de l'hydrogène phosphore que quelques bactériens peuvent détermi-

ner, le soufre sera remplacé par un lait rouge de phosphore amorphe. Le phosphore rouge résiste très bien à la stérilisation de l'autoclave, le soufre sera simplement purgé de germes à ioo°.

Quand on aura appris, par quelques essais préliminaires et la production de substances spéciales, la nature zvmogène de l'espèce, on procédera à l'étude de la fermentation que détermine le micro-organisme, de façon à établir indubitablement la réalité de ses fonctions, seulement jusqu'alors soupçonnées.

La nature et la quantité des produits de ces actes physiologiques permettront sûrement d'assigner une place aux microbes considérés, soit parmi les ferments étudiés, soit à côté d'eux, si la littérature ne les a pas encore mentionnés.

L'observateur sera souvent surpris de découvrir, au nombre des organismes qui tomberont sous sa main, des ferments qui différeront essentiellement par leur morphologie, Taspect de leur culture, des espèces connues jusqu'à ce jour; ces ferments auront une puissance d'action très variable, mais cela ne saurait être regretté, car je le répète, à côté des caractères physiques réellement trop précaires, communs à une foule de bactéries, cette inégalité de leurs facultés physiologiques permettra d'attribuer aux espèces trouvées un rang en rapport avec le degré de leur énergie.

Il ne peut évidemment entrer dans mon esprit la pensée de passer en revue successivement tous les ferments, d'en étudier les caractères, la puissance et les diverses qualités, je désire conserver à mon opuscule un petit nombre de pages, et le consacrer à tracer rapidement les grandes lignes d'une analyse bactériologique complète. Les indications que je ne donne

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pas ici, on les trouvera dans les traités de Chimie biologique, et mieuv encore dans les mémoires originaux fournis sur ces matières par les microbiologistes, auxquels est due la découverte des divers ferments; car j'ai maintes fois reconnu que, cédant à la nécessité de condenser en peu de pages beaucoup de faits, les auteurs qui ont la spécialité d'écrire des traités omettent, par la force des choses, bien des points importants qui sont loin d'être dénués d'intérêt pour Tanalyste.

Les microbes que nous avons vu résister aux agents physiques, et notamment à la chaleur, présentent visà-vis des réactifs chimiques une sensibilité de même très variable : les uns meurent ou du moins ne se développent pas en présence de i : looo d'acides minéraux, de 5 à lo pour looo d'acides organiques, tartriques ou citriques, tandis qu'il existe des bactéries qui peuvent croître très abondamment dans des terrains où la proportion de ces acides est notablement dépassée (2 à 3 pour 1000 d'acide sulfurique, chlorhydrique, azotique, 10 à 20 pour 1000 d'acide tartrique et citrique). On peut donc, en se basant sur ces faits, opérer des séparations d'espèces et établir par la même occasion des caractères très fidèles de diagnose. Parallèlement aux acides, on peut, au contraire, faire usage des alcalis, de la soude caustique de i à 5 pour 1000, du carbonate d'ammoniaque de i à 10 pour 100, etconstaterque si en général les alcalis sont favorables à la multiplication des bactéries, ils l'entravent dans plusieurs cas.

Les ressources que nous offre la Chimie sont pour ainsi dire illimitées; à côté des acides et des bases on emploiera avec succès les mercuriaux à dose très faible (i : loooo à I : looooo), les sels de fer, de cuivre, de

plomb; les antiseptiques : la saccharine, le phénol, le thymol, l'iodoforme et d'autres corps dont Ténumératien est ici inutile. Le procédé basé sur l'inégal pouvoir antiseptique de quelques corps sur les bactéries est précieux pour l'isolement des bactéries saprogènes. Depuis bien longtemps, j'emploie également dans ce but le sel marin dans des proportions variant de 5 à i5 pour loo, la glycérine dans les proportions de lo à 20 pour loo, le borate de soude et l'acide borique sous le poids de i : loo; les acides benzoïque, salicylique à la dose de i : 2000, l'acide cyanhydrique à celle de I : 5ooo. Gomme puissant modificateur des milieux deculturesjjeplaceenpremièrelignel'iode, qui, ajouté

en très faible quantité aux bouillons ou aux gelées nutritives, leur confère une infertilité des plus remarquables vis-à-vis d'un grand nombre d'espèces; le brome agit dans le même sens que l'iode.

Tous ces moyens d'investigation sont bons, surtout quand on désire faire porter l'analyse qualitative d'une eau sur un volume relativement élevé de liquide et rigoureusement il doit en être toujours ainsi, car il me paraît bien insuffisant d'étudier, au point de vue qualitatif, les micro-organismes contenus dans un cenlimètre cube d'eau ou une fraction de centimètre cube.

Gomme les milieux sucrés ou autres employés à la recherche des ferments, les milieux acides, alcalins ou antiseptisés peuvent se préparer également au fur et à mesure des besoins, en ajoutant, au moyen de pipettes llambées graduées, à un volume connu de gélatine la quantité voulue de solution de la substance chimique titrée et stérilisée. Pour maintenir ces solutions à l'abri des poussières de l'air et des contaminations accidentelles, on pourra employer des flacons munis

d'une fermeture aseptique; les flacons qui me semblent convenir le mieux sont ceux qui possèdent un capuchon rodé auquel est soudé une pipette et une tubulure latérale munie d'une bourre d'ouate, afin d'éviter la fuite du liquide par la pipette au moment de la stérilisation et d'assurer le rétablissement constant de la pression atmosphérique dans l'intérieur du flacon.

Je viens d'indiquer brièvement les divers moyens que le micrographe a à sa disposition pour aider à la découverte des espèces, quand les méthodes du fractionnement dans les bouillons et la dissémination de> bactéries dans les plaques sont des moyens peu pratiques. Tout en se livrant à ces diverses opérations d'analyses, le micrographe aura, non seulement, la satisfaction de découvrir dans les eaux les microbes déjà connus, mais encore beaucoup d'autres qui n'ont fait l'objet d'aucune étude; en pratiquant une analyse avec soin, il lui sera presque toujours permis de faire marcher de front, avec des recherches dont l'intérêt peut être contestable, des travaux qui seront fort utiles pour la science bactériologique.