II

En supprimant, volontairement ou parce qu'on y est forcé par les liquéfactions intempestives, les plaques de gélatine au bout de la première semaine, on néglige de tenir compte d'un quart des colonies : c'est une erreur de 25 pour loo dont il faut que le micrographe soit bien averti.

Si, au lieu de 20 îlots bactériens, une plaque en offre 5oo, 1000 et davantage, on comprend à quelles erreurs en moins Téxpérimentateur s'expose. D'après mes propres essais, une plaque de i décimètre carré de surface, qui renferme 5oo colonies venues des eaux, n'est plus lisible après le quatrième jour, c'està-dire que l'analyste ne peut, dans de semblables conditions, tenir compte que de 38 à 89 pour 100 des bactéries vivantes contenues dans le liquide

34 CHAPITRE m.

soumis à ses dosages. On conçoit combien ces lectures prématurées sont regrettables et combien il est difficile d'échapper à cette conclusion, que les facteurs résultant de ce mode d'expérimentation défectueux sont toujours trop faibles, par conséquent inexacts. C'est pour parer à cet inconvénient qu'on a fait quelques tentatives afin de refréner l'activité envahissante de certains microbes, mais il n'est pas parvenu à ma connaissance que ces efforts louables aient été couronnés de succès.

Le remède à cet état de choses consiste à ensemencer dans les plaques le moins de germes possibles, autrement dit à fractionner et à diluer les eaux, à peu de chose près, comme dans la méthode qui me sert depuis treize à quatorze ans.

Contrairement à la façon d'agir de plusieurs de mes contradicteurs, avant de tne prononcer sur la valeur d'une méthode, j'ai pour habitude de l'étudier longuement, plusieurs années si cela est nécessaire, et d'apporter ensuite à l'appui de mes affirmations un nombre de faits toujours respectable.

Pour appuyer la thèse que je soutiens, je vais produire une statistique recueillie en 1889 et 1890, indiquant combien de plaques de 20*"^ de surface, peuplées de 1,2, 3, l[ et o colonies, ont pu atteindre le quinzième jour sans devenir le siège d'une liquéfaction assez étendue pour gêner le dosage quantitatif.

Statistique. — i3954 plaques, coulées en flacons coniques de o",o5 de diamètre à la base, sont utilisées du mois de janvier 1889 au mois d'octobre 1890 pour l'analyse microscopique des eaux par la méthode qui sera décrite plus loin, sous le litre de Procédé mixte.

DE l'analyse quantitative. 35

Sur ce nombre de plaques ensemencées, 820 d'entre elles ont montré des moisissures associées ou non à des colonies bactériennes; je les élimine, par la raison que, sur ces 820 plaques, 662 ont été fluidifiées avant le iS» jour, et je ne veux considérer ici que les liquéfactions provoquées par les bactéries.

Il reste donc i3i34 plaques de gélatine qui ont donné les résultats suivants :

6468 n'ont montré aucune colonie.

6071 ont montré i à 5 colonies.

595 se sont peuplées de 6 colonies ou d'un plus grand nombre.

Comme je désire rester dans le cas le plus défavorable à la thèse que je soutiens, j'élimine encore les 695 plaques qui ont accusé plus de 5 colonies, et 26 pour 100 de cas de liquéfaction avant le i5* jour.

Nous restons en présence de 6071 plaques altérées par i, 2, 3, 4 ou 5 colonies, dans les proportions suivantes :

Colonies.

3oo5 plaques se sont peuplées de i

!• Sur 3oo5 plaques altérées par une colonie, 194, soil 6,4 pour 100, se sont fluidifiées avant le i5" jour.

2*' Sur 1407 plaques altérées par 2 colonies, i35, soit 9,6 pour 100 se sont liquéfiées avant le i5' jour.

3* Sur 930 plaques peuplées par 3 colonies, 121, soit i3 pour 100, se sont fluidifiées avant le i5' jour.

4* Sur 422 plaques montrant 4 colonies, 67, soit i5,8 pour 100, se sont liquéfiées avant le i5" jour.

5" Enfin, sur les 307 plaques altérées par 5 colonies, 53, soit 17,2 pour 100, se sont liquéfiées avant le i5* jour.

Je crois inutile de répéter que les ensemencements qui donnent sur toutes les plaques 5 colonies ou plus présenteront à l'analyse au moins 26 pour 100 de cas de liquéfaction avant la fin de la quinzaine, durée indispensable pour l'éclosion des bactéries.

Il résulte donc de la statistique qui précède qu'on

36 CHAriTRE m.

doit s'efforcer de réduire le chiffre des bactéries appelées à se développer sur les plaques de gelée à i, 2, 3 colonies au maximum par plaque de 20"i, ou à 5, 10, i5, si la plaque est 5 fois plus grande et offre I décimètre carré de surface.

Les résultats négatifs ne doivent préoccuper en rien l'observateur qui opère sur de nombreuses plaques à chaque expérience : trop de colonies, au contraire, lui procurent toujours des désagréments.

Cela dit, il me semble que nous retombons dans la méthode des ensemencements fractionnés avec cette différence, et c'est là le seul avantage que présente la gélatine en plaques, de mettre l'opérateur à l'abri d'une surprise quand le chiffre des bactéries est 10 à i5 fois supérieur à celui qu'il avait prévu.

Avec les conserves de bouillon, pour obtenir un résultat satisfaisant, la quantité des ensemencements négatifs doit osciller de 76 à 85 pour 100; ces limites sont réellement trop peu élastiques et forcent, même les expérimentateurs les mieux exercés, à pratiquer plusieurs séries d'expériences instituées de façon telle qu'ils aient la facilité de choisir la série des ensemencements, qui offre seulement 20 pour 100 de cas d'altération ; ce qui réclame parfois la mise en œuvre de plusieurs centaines de conserves de bouillon et exige la présence d'un ou de plusieurs aides.

Ma méthode n'a pas évidemment trouvé grâcedevant les partisans résolus des plaques de gélatine; mais qu'on l'ait critiquée en France ou à l'Etranger, j'ai toujours constaté qu'elle était mal comprise, mal appliquée et qu'enfin mes contradicteurs ne se sont jamais mis dans les conditions opératoires où je me place. MM. Pétri, Meade Bolton, notamment, qui ont

DE l'analyse quantitative. 37

cherché à la mettre en défaut, n'ont pu y parvenir qu'en opérant au delà de la zone où le procédé des ensemencements fractionnés ne donne plus de résultats certains; au contraire, toutes les fois qu'ils ont expérimenté er\ deçà de cette zone, les chiffres qu'ils ont eux-mêmes obtenus ont été meilleurs que ceux que leur a fournis comparativement la gélatine en plaques, et encore dois-je ajouter qu'ils ont établi leurs expériences de contrôle sur un nombre de conserves de bouillon qui atteint à peine celui qui me sert à un essai préliminaire.

En dehors des causes d'erreur que je signale, et qui ne manquent pas de se produire dès qu'on ensemence un chiffre trop élevé de germes sur les plaques de gélatine, il en existe d'autres que je dois également mentionner. L'une d'elles tient à l'impossibilité où l'on se trouve d'élever la température des plaques au-dessus de 23° à 24° sans voir le substratum devenir liquide. On connaît cependant beaucoup d'organismes, et des plus importants à étudier, qui ne se développent jamais d'une manière sensible à 22-24°. Parmi eux, on peut citer le bacille de la tuberculose, de la diphtérie, les naicrobes thermophiles et bien d'autres espèces vulgaires qui fournissent de belles cultures dans les bouillons chauffés à 3o°, 4o° et 60°.

Il existe également plusieurs catégories de microorganismes pour lesquels la gélatine se montre un notilieu infécond. Citons, en passant, quelques bacilles ferments de l'urée, plusieurs organismes nitrifîcateurs, étudiés par Winogradsky, qui a même fondé sur cette faculté négative un procédé fort curieux pour les séparer des microbes vulgaires; ce procédé consiste à chercher les agents organisés de la nitrification, pré- M. 4

cîsément là où la gélatine ne présente pas la plus petite colonie.

Je dois également avertir Texpérimentateur que les taches microphytiques ne sont pas habituellement constituées par des cultures à Tétat de pureté; il suffit pour s'en convaincre de saisir ses colonies, de les ensemencer dans le bouillon, puis, avec ce bouillon altéré, de fabriquer des plaques. La plupart du temps, on voit apparaître sur la gelée des colonies hétérogènes d'aspect, que le microscope, comme la culture et l'examen des fonctions biochimiques, démontre appartenir effectivement à des organismes très différents.

Je pourrais encore signaler d'autres inconvénients relatifs à la trop grande^fusibilité de la gélatine, parler de ses liquéfactions générales qui peuvent s'observer en été dans les laboratoires, lorsque la température s'élève au-dessus de 25°, et causer de véritables hécatombes de plaques quand celles-ci ne sont pas placées dans des caves ou des étuves froides à l'abri des chaleurs des mois de juillet et d'août. Mais mon intention n'est pas de décourager par avance le débutant ; je préfère lui dire que le procédé., imaginé par le D' Robert Koch, constitue certainement un progrès dans l'étude des infiniment petits; ce procédé n'était pas assurément indispensable au développement de la science due aux mémorables travaux de M. Pasteur; cependant, en facilitant, par l'application des substrata solides à l'étude des bactéries, l'accès de la microbiologie à un grand nombre d'élèves, ce savant allemand est pour beaucoup dans l'essor rapide que cette science a su acquérir durant ces dernières années.

DE l'analyse quantitative. 39

n. — Dosage quantitatif et du matériel qu'il nécessite.

La plupart des eaux naturelles contenant un chiffre de bactéries assez élevé, en tout cas très variable, le premier embarras de l'analyste est de savoir à quelle dose il devra ensemencer Téchantillon qu'il a reçu pour obtenir dans les bouillons ou sur les plaques un nombre convenable de cas d'altération ou de colonies : si ce chiffre est trop bas, le facteur pourra se ressentir considérablement d'un ensemencement fortuit; s'il est trop élevé, on a vu dans les pages précédentes quelles causes d'erreurs en moins peuvent se produire ; savoir à quel degré doit être portée la dilution est le premier problème à résoudre.

Les eaux de source, considérées comme très pures, peuvent contenir de i à loo microbes par centimètre cube, les eaux de source contaminées accidentellement ou périodiquement par la pluie ayant balayé le sol, par un cours d'eau devenu e siège d'une forte crue, sont beaucoup plus impures; le chiffre des bactéries qu'elles offrent peut varier de loo à looo et aller parfoisjusqu'à plusieurs milliers. Les eaux des rivières et des fleuves ont des richesses microbiennes qui varient généralement de loooo à looooo. Les eaux d'égout contiennent une dizaine de millions de bactéries sous le même volume; enfin, les eaux ménagères, sales et fétides, qui stagnent dans les ruisseaux, les I iquides des fosses d'aisances fixes, peuvent en montrer plusieurs centaines de millions par centimètre cube. L'origine d'une eau est une indication précieuse à connaître dès l'abord, car elle peut éviter à l'expérimentateur, avec les tâtonnements, les frais des expé-

riences préliminaires. Mais souvent cette indication peut faire défaut; celui qui demande un essai bactériologique d'une eau croit, quelquefois, de son devoir de laisser ignorer à l'analyste la nature du liquide fourni, de façon, sans doute, que les résultats obtenus ne puissent être influencés par une idée préconçue. D'autres croient même, et c'est absolument juste, que les idées préconçues doivent céder le pas aux faits observés; aussi est-ce pour ce motif qu'ils placent sur les flacons de fausses étiquettes intervertissant les indications exactes. Enfin il existe une dernière catégorie de personnes qui se plaisent à compliquer le travail déjà si ardu du bactériologiste, en effectuant des mélanges d'eaux propres et d'eaux sales, en ajoutant à des eaux de source d'une magnifique limpidité quelques gouttes d'un liquide putréfié, tout cela évidemment dans l'intention d'exercer la sagacité de l'opérateur et peut-être aussi de se moquer agréablement de lui, s'il ne découvre pas ces contaminations grossières. Les procédés bactériologiques sont heureusement assez sûrs aujourd'hui pour déceler ces fraudes; un micrographe novice pourrait tout au plus, si l'échantillon lui était arrivé dans de bonnes conditions, croire à une erreur de sa part ou à une stérilisation incomplète des milieux mis en œuvre par lui. Cependant, il est des cas, relativement très fréquents, où les eaux données à essayer, je fais allusion à celles qui portent les étiquettes d'eaux de puits, de citerne, ne disent rien à l'opérateur qui puisse utilement le guider. Une eau de puits peut se montrer aussi pure qu'une eau de source, comme renfermer autant de bactéries que l'eau de rivière ou de canal la plus impure. Dans ces cas douteux, on ne doit pas

DE l'analyse quantitative. 41

hésiter à procéder d'emblée à une quadruple ou à une quintuple analyse avec des dilutions dont le titre varie de i : looo à i : looooo. Les essais préliminaires peuvent abréger cette besogne, mais ils ont le tort de retarder de vingt-quatre heures au moins l'analyse proprement dite.

Dilution des eaux, — On appelle ainsi une opération qui a pour but de porter i*^*^ d'une eau donnée à 10 fois, 100 fois, looo fois son volume et davantage au moyen d'un excipient purgé de germes par la chaleur. L'excipient liquide peut être de l'eau distillée ou de l'eau ordinaire stérilisée à Tautoclave à iio°. L*eau ordinaire donne habituellement un précipité assez abondant de carbonate neutre de chaux, qu'on peut éliminer en la faisant bouillir quelques minutes et en la filtrant ensuite.

Pour diluer une eau au i : lo, il faut ajouter à i^^ de cette eau 9^*^ d'eau stérilisée; pour la diluer au I : 100, 99*^*^; au I : 1000, 999*^*" d'eau purgée de germes, etc., mais, comme pour la diluer au i : 1 000000 il faudrait ajouter i^^ de l'eau à doser à 100 litres d'eau stérile, cette opération deviendrait peu praticable, aussi tourne-t-on cette difficulté de la façon suivante :

L'eau est d'abord diluée au i : 1000, puis de cette eau au i : 1000 on introduit i**= dans un second litre d'eau stérilisée. Ainsi, pour diluer une eau au I : 1 000000, il n'est utile d'employer que 2 litres d'eau. Bien que ces opérations soient d'une très grande simplicité, elles demandent à être faites avec beaucoup de soins : l'eau à analyser sera longtemps agitée de façon à répartir dans sa masse, d'une manière

aussi homogène que possible, les bactéries mobiles que le froid a pu précipiter au fond du flacon, ou celles qui, étant privées de locomotion, gagnent naturellement la paroi inférieure des vases en raison de leur densité supérieure à celle de l'eau. C'est alors seulement que l'on fait un prélèvement pour Tensemencement direct dans les milieux nutritifs ou dans le ballon d'eau qui doit servir à la dilution. Ce dernier ballon est à son tour agité longuement avant d'en utiliser le liquide qu'il renferme, soit pour les ensemencements directs, soit pour une dilution à une seconde puissance.

Si on néglige de suivre ces indications, d'abord on prélèvera dans l'échantillon d'eau naturelle un liquide trop pur ou trop impur, selon que la pipette plongera dans les couches superficielles ou profondes de l'eau ; de leur côté, les dilutions ne présenteront aucune homogénéité et on saisira au hasard des courants peu ou pas de germes, alors que la théorie de la dilution est de répartir aussi exactement que possible le même nombre de microbes dans chaque centimètre cube d'excipient; je sais bien qu'il en est rarement ainsi en pratique; cependant, en manipulant soigneusement, on arrive à obtenir des résultats très approximatifs, parfois même identiques dans les expériences faites en double dans un but de contrôle.

Pour diluer convenablement les eaux, j'emploie des matras et des flacons d'une capacité variant de 20*^ à 2**^ : le col de ces vases est garni d'un capuchon rodé tubulé (voiry?^. 4); j'ai adopté de préférence le matras M, que sa conformation rend très stable, et dont le ventre très large facilite l'agitation du liquide et permet d'effectuer la dilution dans d'excellentes

DE l'analyse quantitative. 43

conditions. On peut également faire usage de simples ballons à fond plat dont le col est muni d'une forte bourre d'ouate, qu'on enlève au moment d'opérer la dilution pour permettre l'introduction de la pipette contenant Teau à diluer, et qu'on replace immédiatement après pour pratiquer l'agitation. Il est utile d'avoir ainsi à sa disposition plusieurs séries de ces

Fier f.

Vases à cultures et à dilutions.

vases de grandeurs diverses contenant des volumes déterminés d'eau stérilisée, et prêts à servir. Je terminerai ces instructions en conseillant de fractionner les prélèvements, de retirer par exemple i*'* de l'eau à analyser par quart de centimètre cube, c'està-dire en quatre fois (plutôt qu'en une), de façon à obtenir un échantillon moyen représentant exactement la composition de la masse liquide.

Pipeiles à ensemencements. — On peut se servir dans les analyses microbiologiques de pipettes de

i*^, 1^^, 3**, 4" et 5^*^> jaugées au trait, graduées en fractions de centimètre cube, ou non graduées, à la condition que ces instruments de verre soient exactement purgés de germes. On peut les stériliser par simple flambage, au fur et à mesure du besoin ; cependant il est infiniment plus commode et plus rapide d'avoir à l'avance une certaine quantité de ces pipettes parfaitement aseptiques. La fig, 5 montre la façon

Fig. 5.

Pipettes jaugées et graduées stérilisées.

dont je conserve ces appareils stérilisés à 200°, pendant u^e heure. Pour rester à l'abri de toute contamination ultérieure, ils sont, comme on le voit, contenus dans des tubes à essais fermés par un tampon serré de coton. Quand on veut en faire usage, ce tampon est enflammé, la pipette est retirée de sa gaine protectrice, exempte de toute impureté. Tous ces petits instruments sont étranglés à leur extrémité supérieure et munis d'une bourre 6, h^ de laine de

verre, afin de retenir les poussières venues du doigt et de Tair ambiaiit.

Pour le fractionnement goutte à goutte de Teau naturelle ou diluée, les pipettes graduées ou jaugées ne sont pas très recommandables, cette opération exigeant au préalable un exercice du doigt pendant lequel plusieurs gouttes s'échappent habituellement de l'appareil; je préfère, pour ma part, employer des pipettes unies, faites d'un simple tube de verre effilé, dont l'ouverture capillaire débite à peu près 25 gouttes au gramme. Chacun peut faire soi-même ces petits instruments en rejetant tous ceux qui donnent moins de 240 et plus de 260 gouttes d'eau distillée pour lo*"*. Ces pipettes, également munies d'une bourre de coton de verre au-dessus de l'étranglement supérieur, peuvent être stérilisées en bloc, au nombre de 100 à 200, dans un vase cylindrique où elles plongent la pointe en bas perdue dans une forte couche de laine de verre ; au moment de s'en servir on les flambe rapidement de façon à brûler les germes qui ont pu se déposer à leur surface extérieure.

Vases à cultures, — Pour c|)ntenir les bouillons destinés aux ensemencements et à la -culture des schizomycètes, je ne connais de véritablement pratiques que les flacons de Freudenreich {\o\r Jig, 4 'es flacons F, F', F" el/lg. 6) qui sont une modification heureuse du matras Pasteur et qui consistent en flacons de toutes grandeurs, munis de capuchons rodés et tubulés. On a préconisé pour le même usage les tubes à essais, les petits matras à col garni d'ouate. La plupart de ces vases sont d'une trop grande instabilité, et l'enlèvement des bourres est une opération

minutieuse qui entraîne de nombreuses chances d'infection, quelJes que soient les précautions dont on s'entoure.

Les premiers frais d'achat des flacons Freudenreich sont assez élevés ; la plupart des constructeurs ne con-

Fig. 6.

Flacon de M. de Freudenreich.

sentent à les livrer qu'au prix de 80^' la centaine; ce prix, est fort exagéré et pourrait être abaissé de moitié, si les commandes étaient suffisamment nombreuses pour exciter la concurrence.

Pour la fabrication des plaques, on se sert souvent des boîtes de Pétri, très répandues dans les laboratoires de bactériologie, mais je n'ai pas cru devoir les adopter dans mes recherches. Je leur reproche d'abord d'offrir une trop grande surface, et de présenter une fermeture insuffisamment aseptique; en diminuant le diamètre de ces boîtes enchâssées l'une dans l'autre, on peut, il est vrai, atténuer la portée de la première objection, mais la seconde subsiste tout entière; ensuite, si rapide que soit le prélèvement des microbes éclos dans ces boîtes, il est rare que les organismes de l'air ne viennent pas à ce moment se déposer à la surface de ces plaques, qui doivent être sacrifiées dès qu'elles ont été ouvertes plusieurs fois.

DE l'analyse quantitative. 47

Si beaucoup de colonies sont semées sur ces couches de gélatine, suivant une expérimentation que je condamne quand elle a pour but le dosage quantitatif, l'examen méthodique des colonies n'est pas possible en raison du temps que ces observations entraînent et du nombre élevé d'ouvertures et. de fermetures qu'exige la confection des préparations microscopiques. Ces ouvertures doivent être très peu fréquentes et pratiquées de façon à préserver la surface de la gélatine de la chute des poussières de lair; or l'appareil de Pétri ne répond pas à ces exigences k'gitimes.

Aux boites de Pétri, dont je viens de signaler les inconvénients, on peut substituer des flacons coni-

Fig. 7.

Flacon conique pour les cultures en plaques.

ques à capuchon rodé et tubulé (voir Jig. 7) d'un usage beaucoup plus commode ; pour mes essais, j'en ai fait construire de plusieurs diamètres, de o™,o3 ù o™, 1-2 à la base. Je conseillerai de s'en procurer d'un diamètre variant de o™,o5 à o™,o6, comme se prêtant beaucoup mieux aux nécessités de Texpérinientateur. Quand le diamètre de la base est trop large, l'apport des colonies sous le microscope est trop laborieux, tandis qu'il est aisé, avec les flacons

de o",o5 à o"*,o6 à la base, d'aller quérir avec un fil de platine flambé, rectiligne, ou légèrement cintré (si la colonie est placée à la périphérie), la quantité de culture nécessaire pour l'examen ou l'ensemenceraent.

L'étroitesse du col des flacons coniques garantit, ordinairement, contre les infections venues de l'extérieur, quand on prend le soin de renverser le vase ou de l'incliner latéralement. Si la plaque de gelée est envahie par une colonie liquéfiante, cette manœuvre n'est plus évidemment permise, mais enfin on conçoit que, par une ouverture d'un demi^centimètre carré, il tombe 200 fois moins de germes que par une ouverture de 100 centimètres carrés, ce qui est le cas des boîtes de Pétri.

Pour éviter les inconvénients qu'ofl'rent ces derniers appareils, Esmarch a préconisé les plaques roulées en tubes qu'on obtient en introduisant dans un tube à essai stérilisé le mélange encore liquide de l'eau à essayer et de la gélatine, et en tournant ce tube dans un vase d'eau froide, jusqu'à la prise complète de la gelée. Ce procédé est sans doute simple et ingénieux, mais le pêchage des colonies au fil de platine, si on peut employer cette expression, est très difficile et souvent impossible, même pour ceux dont l'œil et la main ne manquent pas de sûreté.