MÉTHODE DE METCHNIKOFF, ROUX ET SALIMBENI

Enfin, ayant constaté que les six vibrions <l’El Tor (I) donnent dans le bouillon une toxine plus active que le vrai cholérique, et que le sérum des animaux vaccinés avec leurs produits solubles neutralise la toxine des cholériques authentiques, Kraus leur donna la préférence pour la préparation d’un sérum anticholérique qui fut appliqué à l'homme, à Saint-Pétersbourg, en 1908.

Detou le façon, étant donné que les produits toxiques, obtenus par Kraus en cultivant les vibrions d’El Tor dans le bouillon pcptonisé, ne sont pas plus actifs que ceux obtenus par la méthode de Metchnikolf, Roux et Salimheni, ou par celle de Brau et Denier qui utilisent les vrais cholériques, on doit, à notre avis, recourir de préférence à l une de ces dernières pour obtenir la toxine cholérique devant servir à la vaccination des animaux, en vue d’obtenir un sérum anlitoxique. Nous allons donc les décrire en détail.

Méthode de Metchnikoff, Roux et Salimbeni. — Ces auteurs ont montré, les premiers, que, pour obtenir à coup sûr une bonne toxine cholérique, il faut :

1° I n vibrion aussi toxigène que possible ;

2° Lin milieu de culture approprié ;

3° Des conditions de culture permettant un développement des microbes aussi rapide et aussi abondant que possible.

Choix du vibrion. — Au début de leurs recherches, Metchnikolf, Roux et Salimbeni s’étaient servis d’un vibrion dont la virulence a\ail été considérablement augmentée par la méthode classique des passages successifs dans le péritoine des cobayes. Le pouvoir toxigène de ce vibrion, très virulent, était, à vrai dire, minime.

C’est en le cultivant dans des sacs de collodion introduits dans la cavité péritonéale de cobayes, qu’ils purent très vile augmenter son pouvoir toxigène et l’entretenir.

Dans cette méthode des sacs, permettant de cultiver le vibrion in vivo et à l’abri des cellules de l’organisme, les auteurs avaient cru voir un moyen de renforcer et entretenir, d’une façon générale, la toxicité des vibrions.

De nombreuses recherches comparatives leur montrèrent dans la suite qu’il est inutile de recourir à la méthode des sacs, lorsque les

(1) On sait que les six vibrions d’Kl Tor furent isolés par tîoshlich de l’intestin de six pèlerins revenant de la Mecque et ayant succombé pour des causes diverses à l'hôpital de la station quaran lunaire. A l'autopsie, on trouva dans l’intestin des six individus des lésions de colite et de dysenterie. Les vibrions donnent, comme les vrais cholériques, le phénomène de Pfeilfer et agglutinent sous l’action d’un sérum spécifique préparé avec un vibrion cholérique authentique. Néanmoins, Kraus les sépare des vrais cholérigènes par le fait qu'ils donnent une hémolysine et parce que, dans certaines conditions, le sérum des animaux vacciné8 vis-à-vis des vrais cholériques ne neutralise pas les produits toxiques des vibrions d'EI Tor

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vibrions proviennent directement des déjections cholériques et n'ont jamais fait de passages parles animaux. De tels vibrions possèdent au maximum leur pouvoir toxigène qui varie souvent d'un échantillon à l'autre et qui n’est pas toujours en rapport avec la gravité de l'attaque du choléra qu’il a déterminée. 11 n'est pas rare, en effet, d'isoler des vibrions très toxiques des cas de choléra tout à fait bénin-, tandis que des cas de choléra très graves donnent parfois des vibrions très peu actifs sur les milieux de culture. De toute façon, lorsqu'on rencontre un vibrion bien toxigène provenant directement d’un cholérique, ce qu’il y a de mieux à faire pour lui conserverie plus longtemps possible sa toxicité, c’est de l’entretenir par de rares passages sur la gélose à la température de la chambre.

La méthode des sacs garde toute sa valeur pour remonter la toxicité d’un vibrion dont le pouvoir toxigène serait affaibli par des passages chez les animaux. Les résultats sont moins bons quand il s’agit de vibrions affaiblis par un long séjour sur la gélose.

Milieu de culture. — La solution de peptone à 2 p. 100, additionnée de 2 p. 100 de gélatine, 1 p. 100 de sel marin et 25 p. 100 de sérum de cheval, convient très bien au développementdu vibrion cholérique.

Comme peptone, nous conseillons l’emploi de la solution obtenue d’après la méthode de Martin, par la digestion de 200 grammes d’estomac de porc dans un litre d’eau additionnée de 10 centimètres cubes d’acide chlorhydrique pur. La peptone ainsi préparée donne des résultats plus constants que les peptones commerciales dont la composition est variable. 11 faut éviter avec soin, si l'on s’adresse à ces dernières, celles qui renferment des traces de sucre.

On ne doit pas ajouter le sel marin à la solution de peptones préparée d’après la méthode de Martin, car elle renferme déjà du chlorure de sodium dans les proportions voulues.

De toute façon, après avoir ajouté à la solution de peptone, de la gélatine dans la proportion de 2 p. 100, on chauffe à 100° pendant quelques minutes, jusqu’à ce que la gélatine soit fondue, et on alcalinise. L’optimum comme alcalinité est obtenu en ajoutant à la solution gélatine-peptone neutre au tournesol d’orcine, 12 centimètres cubes de soude normale par litre.

Le milieu alcalinisé est chauffé à l’autoclave à 1 15° pendant vingt minutes. Au sortir de l’autoclave, il est filtré sur papier, réparti en llacons de 500 centimètres cubes, gradués de 50 en 50 centimètres cubes et de nouveau chauffé à H0°-1 12° pendant vingt minutes pour le stérilise!'.

Une fois stérilisé, on le laisse refroidir avant d’y ajouter le sérum de cheval dans la proportion de 25 p. 100. Le sérum de cheval «toit

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être vieux de trois semaines et il doit être resté une semaine au moins à la glacière au contact du caillot.

U ne reste plus, pour que le milieu soit prêt à être ensemencé, qu’à le répartir dans les flacons-boîtes Roux à raison de 50 centimètres cubes par boîte, et à le chauffer pendant trois heures à 60u, pour détruire les substances bactéricides du sérum normal de cheval qui gêneraient le développement des vibrions.

Conditions de culture qui favorisent la production de la toxine. — Melchnikotr, Roux et Salimbeni ont montré que, pour avoir une bonne toxine cholérique, il laut réaliser des cultures rapides, très abondantes, et en retirer latoxine avant que celle-ci soit modifiée. Pour cela, un milieu approprié ne suffit pas. Il laut encore que le milieu soit largement ensemencé avec des microbes jeunes et en pleine activité, et que la culture se fasse en couche mince et en large surface pour faciliter l’aération, qui joue un rôle très important dans le développement des microbes et la production de la toxine.

Pour l’ensemencement, on se sert de vibrions provenant de cultures sur gélose en boîte Roux, âgées de seize à dix-huit heures, mis en suspension dans quelques centimètres cubes de milieu.

Les vibrions provenant de la culture dans une boite Roux sont suffisants pour ensemencer quatre boites, soit 200 centimètres cubes de milieu.

La culture en couche mince et large surface est réalisée grâce à la forme des boîtes Roux et à la petite quantité du milieu employé (50 centimètres cubes par boîte).

Pour augmenter l’aération, les boîtes sont agitées tous les jours pendant les quatre premiers jours au moins.

Une fois ensemencées, les cultures sont placées à l’étuve à 38°. Déjà après vingt-quatre heures un voile épais s’étend à la surface du liquide qui est fortement trouble dans toute son épaisseur.

Dès le deuxième jour, on observe un léger dépôt glaireux qui couvre le fond de la boîte et qui augmente de plus en plus jusqu'au cinquième jour, le liquide étant toujours très fortement et uniformément trouble.

A partir des troisième et quatrième jours, le liquide est manifestement toxique.

La toxicité augmente les jours suivants pour atteindre le maximum vers le septième jour. Elle diminue ensuite, à mesure que les cultures deviennent très alcalines et odorantes.

L'est donc au septième jour qu’il faut utiliser les cultures pour avoir un liquide toxique présentant son maximum d’activité. 11 est

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absolumenl. indispensable de les filtrer sur papier avant de les passer à travers une bougie Chamberland ou Berkefeld.

Méthode de Brau et Denier. — Brau et Dénieront obtenu sur un milieu spécial une très bonne toxine cholérique.

Le milieu de Brau et Denier n’est autre chose que du sérum de cheval additionné de 10 p. 100 de sang de cheval défibriné, toudeux vieux de trois semaines.

Au moment de s’en servir, on chauffe le mélange à 60° pendant trois heures, on ensemence largement et on filtre après sept jourd’étuve à 39°.

La toxine obtenue sur ce milieu répond en tout aux caractères de celle obtenue par Metchnikoff, Roux et Salimbeni. On doit reconnaître cependant que, sur le milieu de Brau et Denier, le rendement toxique est plus constant, et cela lient très probablement à ce que la composition de leur milieu n’est pas sujette aux petites variations inévitables des solutions artificielles.

Propriétés de la toxine cholérique. — La toxine cholérique n’est pas modifiée par un chauffage à la température de l'ébullition pendant vingt minutes. Elle est, au contraire, considérablement affaiblie par un chauffage de vingt-quatre heures à 60° et par le vieillissement à la température ordinaire à l'air et à la lumière. A la glacière et à l’abri de l’air, elle garde, au contraire, très longtemps son activité.

Nous signalerons enfin que le poison cholérique dialyse à travers une membrane de collodion; il est précipité de ses solutions par le sulfate d’ammoniaque et l’alcool fort.

Le liquide filtré, le septième jour de la culture, est alcalin et dégage une odeur spéciale. D’une manière constante on obtient une toxine qui fait périr sûrement le cobaye, en seize à dix-huit heures, à la dose de 1 centimètre cube. C’est la toxine d’activité moyenne qu’on a couramment.

Très fréquemment on obtient cependant des toxines tuant au 2/3 et au 1/2 centimètre cube, exceptionnellement au 1/10 de centimètre cube.

Action de la toxine cholérique sur les animaux. — De

tous les animaux de laboratoire, les cobayes sont sans doute les plus sensibles à la toxine cholérique, surtout quand leur poids ne dépasse pas 230 à 300 grammes. Le poison agit aussi sûrement et aussi rapidement sous la peau que dans le péritoine. La dose minima mortelle lue en quatorze à seize heures, rarement en vingt-quatre à trente heures.

Une quantité deux ou trois fois plus grande amène la mort en six à

IMMUNISATION DES ANIMAUX.

dix heures. Avec des doses plus fortes ou avec de la toxine concentrée,les animaux meurent en quelques minutes. L’effet est vraiment foudroyant, surtout si l’injection est faite dans la cavité abdominale.

L’abaissement de la température commence en général une heure après l’introduction du poison, et il continue jusqu’à la mort. Lorsque celle-ci est imminente, le thermomètre marque parfois 24° à 25°. Quelquefois, les animaux restent dans le collapsus pendant deux heures et plus, avec une température inférieure à 30°.

Si la quantité de toxine est trop faible, une élévation fugace de la température précède l’abaissement et l’animal se rétablit.

Les symptômes de l’empoisonnement cholérique par la toxine soluble sont très semblables à ceux qui suivent l’introduction des cultures vivantes de vibrion dans le péritoine du cobaye; mais ils surviennentplus rapidement. Aussitôt après l’introduction du poison soluble, l’animal est triste, hérissé et pousse de petits cris. Puis son ventre est distendu et douloureux à la pression, et il rend des excréments abondants et humides. Ses extrémités se refroidissent, le corps est secoué de petits frissons, la respiration devient courte et fréquente. Bientôt les membres restent inertes, l’abdomen est flasque, les muqueuses se cyanosent, la sensibilité s’affaiblit et la mort survient.

A l’autopsie, on trouve au point d’inoculation un léger œdème gélatineux, parfois teinté de rouge. L’intestin grêle est hyperémié, distendu par un liquide diarrhéique. Le gros intestin n’offre rien de particulier. Les parois de l’estomac, le foie, la rate, les reins sont congestionnés; les capsules surrénales, très rouges, présentent souvent de petites hémorragies. Les poumons n’ont aucune lésion.

Les lapins supportent mieux que les cobayes la toxine cholérique, el il faut toujours recourir à l’injection intraveineuse pour tuer les lapins adultes, dont le poids dépasse 1 300 grammes. Les lapins intoxiqués présentent les mêmes symptômes que les cobayes, avec cette différence que, chez eux, la température ne descendguère au-dessous de 30°, et que la diarrhée est la règle. Les lésions sont les mêmes dans les deux espèces; cependant le contenu du gros intestin des lapins est toujours fortement diarrhéique.

Le rat, la souris, le pigeon et la poule sont, pour ainsi dire, insensibles au poison cholérique.

Immunisation (les animaux. — C’est aux grands animaux et de préférence au cheval qu’il faut s’adresser pour préparer un sérum antitoxique. 11 est, en effet, très difficile de vacciner les petits animaux (chèvre, lapin, cobayes), et, d’autre part, le pouvoir antitoxique de leur sérum est toujours très faible.

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Sous lapeau, la toxine cholérique, même à petite dose, est très mal absorbée et elle détermine toujours des œdèmes considérables qui durent longtemps.

D’autre part, l’immunité ne s’établit que très lentement et le pouvoir antitoxique du sérum reste toujours faible.

On a donc, à tous les points de vue, grand avantage à recourir dès le début aux injections intraveineuses.

Il faut, bien entendu, commencer avec de toutes petites doses, et. à cause de la forte alcalinité du liquide toxique, il est bon de le diluer dans son volume d’eau physiologique stérile.

On répète l’injection lorsque le cheval est complètement rétabli, et on augmente les doses, en tenant compte de la réaction thermique et des troubles amenés par la dernière injection.

On arrive ainsi peu à peu, en six mois environ, à faire supporter aux animaux la dose vaccinale maxima, dose qu'on nepeut pasdépasser sans risquer de les tuer. Celle-ci varie suivant la sensibilité individuelle des animaux entre 50 et 60 centimètres cubes.

Peu après l’inoculation, les animaux présentent du tremblement, des coliques, de la diarrhée ; ils sont tristes, abattus, refusent la nourriture et se couchent très souvent. En même temps la température monte à 40° et plus ; mais, dans une vaccination bien conduite, elle tombe, à la suite d’une forte transpiration, huit à dix heures après l’injection.

il faut, nous le répétons encore une fois, attendre le rétablissement complet de l’animal avant défaire une nouvelle injection.

11 fautaussi peserlesanimauxet,si l’on constate un amaigrissement notable, il vaut mieux suspendre momentanément tout traitement. Si tout va bien, les injections vaccinales peuvent être répétées tous les huit à dix jours.

Les saignées sont failes la première douze et la seconde seize jours après la dernière injection. Les sérums de la première et de la deuxième saignée ont le même pouvoir antitoxique.

Propriétés <lu sérum anticholérique. — Le sérum des animaux immunisés contre la toxine cholérique est a la fois agglutinant, précipitant, préventif et antitoxique.

.Mélangé invitro avec des vibrions vivants, il les agglutine, mélangé

ou jours in vitro, avec de la toxine, il détermine la formation d un précipité plus ou moins abondant, suivant l’activité du sérum et les proportions du mélange.

Injecté préventivement, en même temps et. dans certaines limites, après une inoculation de vibions, il est capable de prévenir et guérir la septicémie vibrionienne.