I.— CULTURE DU BACILLE DE LA DIPHTÉRIE

Klebs le premier signale un bacille spécial à la diphtérie et en décrit la disposition dans les fausses membranes à la surface des muqueuses malades; ce travail a été présenté en 1883, au Congrès de Wiesbaden.

L'année suivante, Lœffler (i) isole et cultive ce bacille et sa méthode reste la méthodede choix qui sert encore aujourd'hui.

Lœffler conseille d'employer comme milieu du sérum de bœuf coagulé ; sur ce milieu, la culture du bacille de la diphtérie se fait facilement, tandis que les autres microbes y croissent moins bien. Dans les premières heures qui suivent l'ensemencement, les bacilles diphtériques se développent d'abord, les premières colonies deviennent visibles après dix-huit heures; vers la vingt-quatrième heure, elles sont très apparentes, elles augmentent ensuite; mais, à partir de la trente-sixième heure, et surtout après quaranle-huit heures, d'autres colonies s'ajoutent à celles du bacille diphtérique et rendent l'examen et la purification difficiles.

Le sérum du bœuf coagulé par la chaleur présentant un tel avantage pour nous permettre d'isoler le bacille de la diphtérie, il importe de bien connaître sa préparation.

Préparation du sérum coagulé. — 11 faut autant que possible retirer le sérum d'un sang recueilli aseptiquement. Tous les sangs peuvent servir à préparer des sérums, mais on emploie de préfé-

(1) MitlheilimgÈn ans <lum Kiiisci'h GcsUndhcilsamlj, toi. 11. 1884, p. iCI.

CULTUHK nu BACILLE DE LA DIPHTÉRIE. 131

ronce le sans' de bœuf; on poul cependant utiliseï' le sang du mouton / et celui du clieval. ^

Le san;,' de bœuf est ordinairement recollé à l'abatloii'; quand ranimai a été abatlu, la carotide est dénudée et sectionnée, le san.y coule on jol ot il est l'acile de recevoir ce jet dans de grands cristallisoirs préalablement stérilisés au l'oui- à Hamber. Il serait mieux d'introduire une canule slérile dans la carotide avec un ajutage (caoutchouc et tube do verre) ; mais, en général, les bouchers ne se prêtent pas à celte opération.

Quand le sang est recueilli, on place les cristallisoirs dans un endroit frais à l'abri de toute trépidation pour permettre la séparation du sérum et du caillot ; vingt-quatre heures après, on aspire dans des ballons pipettes le sérum séparé et on le répartit dans des ballons qu'on ferme aussitôt à la lampe.

Si le sérum était stérile, l'opération serait terminée: on aurait ainsi une provision de sérum. Malheureusement dans les opérations que nous venons de décrire, qui se passent dans des milieux septiques, des germes tombent dans les vases et il est nécessaire de stériliser le sérum. Il existe pour cela deux procédés : on peut, après l'avou- séparé du caillot, le filtrer sur bougie Chamberland, ou bien , y i le stériliser en chauffant les boules de verre, remplies de sérum et ' lormees à la lampe, trois fois à deux jours d'intervalle, à 58° pendant une heure.

Quand on veut préparer des tubes de sérum coagulé, on répartit le sérum stérilisé dans des tubes de verre qui sont chaulfés à 80° • pendant tout le chauffage, on les maintient très inclinés, presque liorizontaux, pour augmenter leur surface libre qui servira à l'ensemencement. Pendant la coagulation, le chauffage doit augmenter progressivement mais lentement et ne jamais dépasser SO" pour con- / > W/'^

server au sérum loute sa transparence. ■ \A, ° ^

Voici le procédé classique aujourd'hui tel qu'il est pratiqué à Institut Pasteur. Lœtfler et d'autres auteurs ajoutent du sucre de la glycérine ou des peptones au sérum du bœuf; il est bien certain que, sur le sérum ainsi complété, les bacilles poussent un peu mieux, mais d autres microbes se développent aussi plus rapidement et gênent les examens. i ^i^inoui,

Si l'on veut préparer du sérum coagulé avec du sang de cheval il ufht e prendre le sang à la veine jugulaire; on a a nsi un sérum q m est le plus souvent privé de germes et peut être employ in Idtration m chauffage. Il faut bien savoir cependant que sur é nm ,

132 LOUIS MARTIN. — S-ÉROTHÉRAPIli: ANTIDIPHTÉRIQUE.

Ensemencement em" séi'in»? — Purification. — Qiiaiid on veut prépai-er la toxine diplitéi'ique, il faut ohlenir un u\\ca<>\h\ diphtén'iuc en culture pure, en parlant de la l;uiss(! inrnibi-ane humaine. Voici comment on opèrp : on prend un lil di! i)Iatin(! assez. Tort, aplati en l'orme de sjiatule à l'une de ses extrémités. On le l'ait rougir à la tlamme d'un bec Bunsen ou d'une lampe à alcool pour le stériliser et on le laisse rcfi-oidir dans un tube flambé avant de s'en servir. Quand on veut recueillir de la semence, on promène légèrement la spatule du lil de platine à la surface d'upe membrane diphtérique et l'on ensemence successivement trois tubes de sérum coagulé sans recharger la spalule. On doit faire sur (iliaques tube une dizaine de stries parallèles, sur toute la longueur du tube, de façon à bien étaler la semence. Dans la pi'atique, on n'étale jamais trop; les débutants ne font souvent qu'une ou deux stries sur chaque tubi; ets'élonnent de ne pas obtenir des colonies bien isolées; répétons donc qu'il faut bien étaler la semence sur les trois tubes.

Les tubes ensemencés doivent être placés dans une étuve à 37». Après vingt-quatre heures, l'examen permet de constater que sur les deux premiers tubes ensemencés, les colonies sont très serrées et qu'il est difficile d'en trouver de parfaitement isolées, qu'en tout cas, elles sont souvent très rapprochées, tandis que sur le troisième tube ensemencé, il s'en trouve de parfaitement isolées.

Les colonies diphtériques se présentent, après vingt-quatre ou trente-six heures d'étuve sous forme de petites taches arrondies, blanc grisâtre, dont le centre est plus opaque que la périphérie. i\Iais il ne faut pas se contenter de les reconnaître par l'aspect, il faut s'assurer par l'examen microscopique que les colonies qui paraissent cire diphtériques sont bien constituées par des bacilles ayant la fqrme d'un bâtonnet légèrement renflé aux extrémités, s'enchevètrant mutuellement à la façon d'un tf^s d'aiguilles; il faut colorer ces microbes et s'assurer qu'ils prennent le Gram.

Quand on a bien reconnu une colonie isolée, il importe d obtenir avec cette colonie la purification du microbe pour arriver à avoir une culture pure du bacille diphtérique.

Pour purifier un microbe, on pique la colonie reconnue diphtérique avec un fm crochet de verre ou avec un fd de platme, on délave soigneusement dans du bouillon les microbes qui sont restes adhérents au crochet, puis on agile vivement et longtemps le tube de bouillon. Cela fait, on trempe dans ce bouillon, qui contient des bacilles en petite quantité répartis dans tout le liquide, un lil de platine préalablement stérilisé et refroidi ; aussitôt sorti du bouillon, on promène le lil de platine à la surface dun tube de

l'UÉl'AUATION DK LA TOXINK DIl'HTÉUIQUK. 133

sérum coa-ulé en faisant sur le tube de très nombreuses stries pour répartir les germes sur toute la surlace, de fdçon à obtenu- des colonies bien isolées. Le tube de sérum est i)laré à l'étuvc à :i7'>. Après ([uarante-huit heures, on voit sur le tube de sérum des colonies très développées; avec le crochet de verre on prélève de la semence sutla colonie qui est la plus isolée et on ënsemence un tube de bouillon qu'on met à l'étuvc à S?». Après un séjour de vingt-quatre heures, on examine ce tube de bouillon pour bien s'assurer qu'il ne contient que des bacilles diphtériques, et qu'on a bien une culture pure d'un microbe provenant d'une fausse membrane humaine. Quand ce résultat est obtenu, on peut étudier les propriétés du nouveau bacille isolé et rechercher s'il produit de la toxine diphtérique.

La technique que nous venons d'indiquer est celle qui servit à MM. Roux et Yersin pour obtenir le poison diphtérique; nous l'avons empruntée à leurs mémoires qui parurent dans les Annales de l'instilut Pasteur en décembre 1888, juin 1889 et juillet 1890.