CHAPITRE II

La molybdomanganimétrie et ses applications analytiques quantitatives.

Le nom de molybdomanganimétrie a été donné à une nouvelle méthode de dosage volumétrique de certains corps réducteurs.

Une telle méthode, essentiellement microchimique, est née de l’impérieuse nécessité où se trouvent les e.xpérimentateurs biochimistes de limiter autant que possible la prise d’une humeur quelconque, de manière à pouvoir répéter fréquemment cette prise, sans danger ' ni perturbation pour l’organisme. Ainsi des analyses en série permettent de suivre pas à pas un phénomène déterminé et de l’enregistrer avec le maximum de fidélité.

En outre le labeur chimique à l’échelle microanalytique, — sur des quantités de substances inférieures au milligramme — devient d’une étonnante facilité lorsque l’esprit et la main se sont accoutumés à mettre en œuvre d’aussi minimes quantités de substances. L’obtention quantitative d’un précipité qui, en macrochimie, demande parfois des jours, se réalise en microchimie en quelques minutes, ou au maximum en quelques heures.Telle réaction encore mal con-

nue comme la réduction du glucose par un émétique cuivrique en solution alcaline, donne, avec quelques dixièmes de milligramme, un rendement en Cu"0 relativement plus élevé qu’avec 100 mg. de cet ose. 11 est inutile de multiplier ces exemples à l’heure où toute la biochimie est devenue microanalytique et où chacun sent que le progrès de demain est lié à un nouvel affinement des méthodes analytiques actuelles, comme en pourrait apporter par exemple une submicrochimie qui serait à l’échelle du millième de milligramme.

La molybdomanganimétrie repose sur les principes généraux suivants :

Lorsque à une solution incolore d’anhydride molybdique MoO^ on ajoute un corps réducteur, ce dernier passe à son maximum d’oxydation en empruntant son oxygène à Mo03.

MoO® est donc réduit. 11 passe à l'état de .sous-oxydes, intensément colorés en bleu et dont le plus important paraît être le bioxyde de molybdène MoÜ^.

En prenant l’exemple concret du fer, cette première réaction peut s’écrire schématiquement de la façon suivante :

2 Fe 3.Mo03 =Fe203 + 3 MoO'^.

Une telle, réaction est strictement quantitative.

Si, à ce sous-oxyde bleu (et stable à l’égard de l’air pendant des heures) on ajoute, goutte à goutte, en milieu phosphorique, une solution étendue de permanganate de potasse, le sous-oxyde est oxydé et repasse à l’état de MoO^ incolore. La disparition totale de la couleur bleue indique la fin de la réaction.

Comme en manganimétrie ordinaire, 2 molécules de permanganate de potasse interviennent en libérant 5 atomes d’oxygène. Cette seconde réaction, rigoureuse-

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ment quantitative elle aussi, est objectivée par l’équation suivante ;

5 Moc 3'+ 2 MnO^K + 5 PO^HS = 2 (PO*H2)®Mn + PO^K2H + 3 H^O -i-^Mo03.

En gardant toujours le cas concret du fer, on voit qu’en somme le fait important est celui de son oxydation :

2 Fe + O* = FeSQs.

L’oxygène étant en déiinitive apporté par le permanganate (à raison de 5 atomes d’oxygène pour 2 molécules de permanganate) et l’anhydride molybdique n’étant qu’un intermédiaire momentané qui se retrouve inchangé à la fin de la réaction.

Ainsi donc la molybdomanganimétrie mesure des déplacements d’oxygène.

Cette mesure s’effectue avec une précision absolue, et .si, en fait, l’application de la molybdomanganimétrie au dosage des corps qui seront énumérés ci-dessous, se solde par une erreur relative de l'ordre de 1 à 3 p. 100 par rapport à la quantité de substance mise en œuvre, ce n’est aucune des deux réactions précédentes qu’il convient d’incriminer.

Deux solutions suffisent à la molybdomanganimétrie : le réactif molybdique phosphorique et une solution de permanganate à 0 g. ,08 p. 1000 dont le titre exact est facile à déterminer grâce à une solution de sel de Mohr dont un volume connu réduit quelques cm^ de réactif.

Ces principes généraux ont été appliqués aux dosages suivants :

Cuivre métalliqne.

Sucres réducteurs par l’intermédiaire du sous-oxyde de cuivre.

Sels ferreux.

Fer métallique (avec application au dosage exact de l’hémoglobine).

Le dosage du sous-oxyde de cuivre et des sels ferreux, est aisé enmanganimétrie ordinaire et la molybdomanganimétrie permet seulement — c’est il est vrai un avantage appréciable — de l’eSectuer'vavec précision à l'échelle microanalytique. En ce qui concerne le dosage volumétrique direct des métaux, comme le fer et le cuivre, la molybdomanganimétrie apporte des possibilités entièrement nouvelles. La seule difficulté est d’obtenir ces métaux à l’état pur et suffisamment divisés pour que la dissolution dans le réactif molybdique soit aisée en milieu phosphorique et pour que la production de bleu de molybdène se fasse quantitativement, sans dégagement d’hydrogène. Ces conditions l'emplies, les métaux susceptibles de s oxyder sont à priori, dosables par molybdomanganimctrie. Seuls les dosages du cuivre et du fer ont été mis au point à cause de leur intérêt biologique.

I — Dosage du cuivre métallique

Deux solutions du problème ont été apportées :

1° La séparation du cuivre est faite par microélectrolyse selon Pregl. La cathode est constituée par un cylindre en toile de platine. L’anode est un fd de platine dans l’axe de la cathode. Le bain d’électrolyse est constitué par 5 cm^ de la solution cuprique acidifiée par SO^H^ + NO^H. L’électrolyse dure 10 minutes avec 0,3 à 0,5 ampère.

La cathode est lavée à l’eau puis plongée dans le réactif molybdique.

Le bleu instantanément apparu est titré au permanganate.

i mg. de cuivre donne environ 13 cm3,3 de permanganate à 0,08 p. 1000.

Le dosage de 0 mg.,1 est donc encore possible avec la microburette.

Sur ces principes R. Guillemet a résolu le problèmé du dosage de quelques centièmes de milligrammes de cuivre grâce à une série de perfectionnements qui lui permettent une excellente approximation. L’intéressant problème du métabolisme du cuivre peut dès lors être abordé dans tous les cas.

2° La séparation du cuivre est faite par l’a-nitroso-pnaphtol. On obtient un volumineux précipité qui est récolté sur un filtre, introduit dons une nacelle en platine, puis incinéré dans un micro-four à moufle de Pbegl. On obtient ainsi de l’oxyde cuivrique qui est ensuite réduit en cuivre métallique, à chaud, dans un courant d’hydrogène. Ce cuivre est enfin dissous dans le réactif molybdique et le bleu apparu est dosé au permanganate.

Dans les deux cas, l'erreur relative, pour des quantités de cuivre égales ou inférieures au mg., est de 1 à 2 p, 100.

IL — Dosage des sucres réducteurs par l’intermédiaire du sous-oxyde de cuivre.

En molybdomanganimétrie le dosage du sous-oxyde de cuivre ne souffre aucune difficulté. 11 suffit de le mettre en présence du réactif molybdique phosphorique. Instantanément le bleu de molybdène apparaît cependant que Cu^O se transforme en GuO et le permanganate permet d’apprécier exactement le déplacement d’oxygène ainsi réalisé.

En principe donc, le dosage d’un sucre réducteur est extrêmement aisé. On part d’une liqueur de Fehling quelconque, on la fait réagir à chaud avec une solution du sucre réducteur envisagé : du Cu^O apparaît. Du dosage de ce Gu*0 on déduit la quantité de sucre.

Cette apparente simplicité fit publier en 1921 et 1922 une microméthode de dosage du glucose et du lactose

dans laquelle le sous-oxyde de cuivre formé était enrolsé dans un précipité de carbonate de magnésie, centrifugé, lavé et enfin dissous dans le réactif molybdique.

A condition d’employer un témoin à chaque opération analytique et de ne pas être très exigeant sur la qualité du virage obtenu sous l’influence du permanganate, cette méthode donnait des résultats satisfaisants, avec une quantité de solution de MnO^K de l’ordre de 10 cm^ pour 1 mg. de glucose.

En fait, cette manière de procéder masquait de graves difficultés qu’une longue étude, à laquelle furent consacrées les années 1925 à 1927, permit de mettre en évidence et par conséquent de corriger, au prix d’environ dix mille résultats expérimentaux négatifs. Voici la liste des faits auxquels il vient d’être fait allusion :

A) Une liqueur de Fehling à base de sel de Seignette donne toujours une « autoréduction » c’est-à-dire que, chauffée en absence de sucre réducteur, elle laisse apparaître du Cu^O. Onpeut, sinon annihiler complètement, du moins rendre vraiment négligeable cette autoréduction en partant de tartrate acide de potasse qu’on dissout et qu’on garde dans une solution acidifiée par une quantité connue de SO^H^ titré. Le sulfate de cuivre est ajouté à cette liqueur. Il suffira au moment de l’emploi d’alcaliniser cette solution cupro-tartrique pour obtenir un réactif vraiment apte au microdosage d’un sucre réducteur.

B) La nature de cet alcalin est loin d’être indifférente. Avec une base forte, soude ou potasse, le rendement en Cu^O est inférieur à celui obtenu par le carbonate correspondant, à alcalinité titrimétrique égale. C’est donc que du sucre est détruit par la base en plus grande quantité que par le carbonate.

C) La quantité de carbonate ne laisse pas à son tour d’intervenir. Les rendements en Cu^O obtenus avec un

tel alcalin à partir de glucose se traduisent toujours, lors-‘ qu’ils sont portés en courbe, par une droite. Pour que celle-ci passe par le zéro des coordonnées, pour que, par conséquent, la quantité de Cu^O obtenue soit et reste proportionnelle à la quantité croissante de glucose mis en œuvre, il convient que la quantité de carbonate ne soit pas trop élevée. Faute de quoi du sucre est détruit.

D) La réduction du glucose s’accompagne de l’apparition, à partir des acides alcools tartrique et malique, d’une substance réductrice indéterminée qui donne du bleu de molybdène pour son propre compte. C’est elle qui est responsable du rebleuissement en fin de virage (et de l’insécurité de celui-ci) dans la méthode de 1921.

Les acides lactique et citrique n’ont plus un tel inconvénient. Mais la quantité de sous-oxyde obtenue est très faible et ne double plus lorsque double la quantité de sucre mise en œuvre.

Un dosage correct de sucre réducteur comporte donc la séparation du Cu^O et de la liqueur dans laquelle il a pris naissance.

Mais ici on se heurte à une nouvelle difficulté.

E) Un tel sous-oxyde, obtenu à partir d’une quantité de sucre réducteur inférieure à 1 mg. est extrêmement oxydable à l’air. C’est la raison pour laquelle, dans la méthode de 1921, il fallait à chaque opération se servir d’un témoin car deux opérations successives ne donnaient jamais le même rendement en Cu*0 et par conséquent en permanganate. Une telle difficulté fut surmontée en faisant floculer le Cu^O grâce à du sulfate de potasse et aussi grâce à un séjour de 20 minutes au bain-marie, du tube dans lequel se poursuit la réduction. Dans ces conditions le sous-oxyde peut être impunément soumis à l’action de l’air ou même de l’oxygène. Seule l’eau, qui le mettrait en suspension et le diviserait à nouveau, lui est préjudiciable.

Au total le Fehling microanolytique auquel ont conduit ces recherches se présente en trois solutions dont voici la formule :

Solution A.

Dissoudre dans 800 cm^ de SO^H^ N 50 g. de tartrate acide de potasse. Ajouter sulfate de cuivre cristallisé 25 g. dissous dans environ 80 cm® d’eau. Compléter avec de l’eau distillée à 1.000 cm®.

Solution B.

Sulfate de potasse pur à 80 g. p. 1.000.

Solution C.

Carbonate de potasse pur et sec à 280 g. p. 1.000.

On mélange, au moment de l’emploi, un volume de chacune de ces solutions. L’emploi d’une telle liqueur permet d’avoir le rendement en Cu^O le plus élevé qu on ait encore enregistré (33 p. 100 en plus qu avec le réactif utilisé par G. Behth.^nu et près de 50 p. 100 en plus que dans la méthode de 1921), cependant que toute une série de substances biologiques, réductrices mais non glucidiques, le laissent complètement inattaqué.

Pour récolter le sous-o.xyde, fut imaginé un appareil à filtration automatique essentiellement composé d’un petit tube portant un treillis de platine sur lequel est déposée une couche filtrante d’amiante. Une trompe à eau produit l’aspiration dont un flacon de garde muni d’un robinet permet à volonté de régler l’intensité. Un essorage soigneux par un courant d'air permet la séparation du sousoxyde et de la substance réductrice inconnue.

Basée sur cette série de faits, la méthode proposée en 1927 permet de doser des quantités de glucose comprises entre Omg.,05 et 1 mg.,25 avec une approximation presque toujours inférieure à 1 p. 100. La proportionnalité est

rigoureuse entre ces deux limites. Un nombre quelconque de dosages peut être mis simultanément en œuvre. Le rendement en Gu^O est toujours identique à lui-même, d’où suppression du témoin. On peut, tant sont visibles et aisés les différents temps du dosage, faire plus de 50 déterminations dans une après-midi.

Le dosage du lactose s’effectue dans des conditions identiques sans aucune modification de la technique.

Entre les mains d’autres expérimentateurs, d’autres sucres ont été dosés avec une excellente approximation, notamment le maltose par Guillemet et Schell.