DIAGNOSTIC BACTÉRIOLOGIQUE DE LA DIPHTÉRIE

On peut être amené à rechercher le B. diphtérique dans deux sortes de circonstances : tantôt on est en présence d’un malade atteint d’une diphtérie bien caractérisée ou douteuse, tantôt il s’agit de convalescents ou de sujets sains susceptibles d’être des porteurs de bacilles. Jusqu'à ces dernières. années, on se contentait en pratique d’ensemencer les produits suspects sur sérum coagulé; la culture donnait-elle en 24 ou 56 heures des bacilles prenant le Gram, on faisait le diagnostic de bacille diphtérique. Dans ces conditions, le diphtérimorphe d’'Hofmann passait presque toujours pour un B. diphtérique court. Néanmoins, tant que la recherche n’était pratiquée que chez les malades, ce diagnostic sommaire était exact. L. Martin à, en effet, constaté que 95 pour 100 des bacilles provenant d’angines et de eroups sont virulents, donc sûrement diphtériques. Il est bien établi d’ailleurs que le B. d’Hofmann au cours de la diphtérie pharyngée s'efface devant le B. de Lôffler pour reparaître lors de la convalescence. Mais, avec les porteurs, il en va tout autrement el l'expérience de la guerre a montré à quels résultats fantaisistes cette méthode simpliste pouvait aboutir : n’a-lon pas trouvé ainsi, dans certaines garnisons, jusqu’à 79 pour 100 de porteurs de bacilles alors qu'il s'agissait chez la plupart de B. d’Hofmann comme l’'apprirent ensuite des identifications plus précises.

De telles erreurs ont amené les chercheurs à perfectionner le diagnostic bactériologique auquel plusieurs moyens permettent de parvenir aujoutd'hui avec plus d’exactitude.

Avant de recourir à des procédés plus compliqués, il faudra d’abord se fonder sur l'étude de la morphologie microscopique. Après examens répétés de cultures pures de B. diphtériques et de B. d'Hofmann identifiés par les méthodes modernes, Aviragnet et Mile Le Soudier (!) ont constaté que dans la majorité des cas, les caractères microscopiques suffisent à obtenir: un diagnostic, sinon d'une absolue certitude, tout au moins d'une très grande probabilité, diagnostic qu’on contrôlera dans les cas douteux par les épreuves de la fermentation des sucres et de l’anaérobiose, d’une sûreté plus grande, mais qui réclament une purification préalable du germe isolé, toujours longue à obtenir.

Avant de décrire la technique, il importe de souligner que la bactériologie de la diphtérie, simple en principe, exige dans chacun de ses détails une grande minulie pour procurer au clinicien les renseignements dont il a besoin; il faudra donc opérer suivant une technique rigoureuse, tant pour le prélèvement des exsudats et leur ensemencement que pour. l'examen macroscopique et microscopique des colonies.

Examen direct des exsudats. — Si nous mentionnons cette méthode de recherche du bacille, c’est surtout pour mettre en garde contre elle. Si elle a l'avantage de fournir parfois un renseignement média il ne faut pas oublier que dans la moitié des cas de diphtérie, l'examen reste négatif, le

1. E.-C. AviraAGxer et Mlle LE Soupter. Archives de méd. des enfants, XXT, 1918, p. 337,

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bacille ne se trouvant guère qu'à la surface de la fausse membrane et le frottis étant fait souvent avec une partie quelconque de cette dernière ({). Lorsqu'on voudra employer cet examen, on devra procéder ainsi :

Cueillir la fausse membrane avec un tampon monté ou une pince, si elle est adhérente; la placer dans une boîte de Petri; la diviser avec des pinces, éponger les fragments au buvard pour enlever la salive; frotter un de ces fragments sur une lame. Laisser sécher, fixer à l’alcool-éther, sécher et colorer par la méthode de Gram avec recoloration de contraste (v. p. 551). Les bacilles apparaissent en violet avec leur groupement spécial. On élimine ainsi un certain nombre d’autres espèces de bacilles du pharynx qui ne prennent pas le Gram.

Méthode des cultures. — Pour faire un diagnostic certain, il est dans tous les cas indispensable de recourir à la culture dont nous exposerons la technique avec tous les détails nécessaires pour éviter les causes d'erreur.

Posons d’abord en principe que le médecin traitant doit lui-même faire la culture, car la manière de l’effectuer varie suivant les localisations cliniques et on s’exposerait aux erreurs les plus graves en interprétant l'examen bactériologique sans les renseignements cliniques.

Prélèvement des exsudats. — On se sert d'un gros fil de platine ou de nickel chromé (nichrome) moins coûteux, terminé en spatule à bords mousses de quatre millimètres de largeur, fixé sur un manche de verre ou de métal. Il faut proscrire l'emploi des tampons d’ouate montés sur tige métallique pour faire l’ensemencement; 1l est impossible d'obtenir ainsi des colonies isolées et, d'autre part, le développement du bacille peut se trouver gêné par l'abondance des autres germes. On réservera l'emploi des tampons aux cas où l’on est obligé d'envoyer le prélèvement au loin pour la culture (?) et on devra alors pour l’ensemencement avoir recours à la spatule qu’on passera sur l’extrémité du tampon.

La spatule étant stérilisée à la flamme et bien refroidie, on fait le prélèvement au lieu d'élection qui varie suivant les cas

1° Pour une angine pseudo-membraneuse commune, on touchéra avec la spatule, non pas la fausse membrane, mais la muqueuse environnante ;

2° En présence d’une angine érythémateuse, Si on soupçonne la diphtérie, on frottera la face postérieure de la luette, le sommet de l'amygdale ou les piliers postérieurs ;

9° Le diagnostic des coryzas suspects nécessite souvent un examen de laboratoire, mais le B. d'Hofmann est si fréquent dans le nez qu’il sera plus

1. Lomry. Ann. de l'Inst. Pasteur, XXXIIT, 1919, p. 713, déclare obtenir 85 pour 100 de résultats positifs, en employant la méthode de coloration des corpuscules polaires pour les frottis.

2, On utilise alors un écouvillon d’ouate monté sur une tige de fer galvanisé, placé dans un tube de verre bouché à l’ouate qui laisse dépasser l'extrémité libre de la tige. Le tout est stérilisé au four Pasteur. Le tampon passé sur le pharynx aux points “d'élection, en évitant de le mouiller de salive et de lui faire toucher les lèvres, est replacé dans le tube qui est expédié, conformément aux règlements postaux, sous enveloppe métallique, contenue elle-même dans une boite en bois au laboratoire chargé de l’'ensemencement. Les bacilles se conservent vivants sur les tampons pendant trois et même quatre jours. Si le tampon était sec, l’humecter d’eau physiologique stérile. Ensemencer alors avec la spatule ou l’anse triangulaire de Costa et Troisier. On peut, à défaut de ces tampons, prélever une fausse membrane, l’entourer d’un morceau de taffetas gommé ébouillanté au préalable et la placer dans un flacon.

E.-C. AviraAGneT, B. WeizL-HALLÉ et P,.-L. Mare.

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prudent de contrôler par une culture de gorge faite comme précédemment,

4° Dans le croup sans angine, la recherche du bacille est difficile ; il faut ensemencer non pas les amygdales, mais la base de l’épiglotte ou l’orifice supérieur du larynx. Chez les tubés, on peut avec avantage cultiver le tube dès son expulsion ;

5° Dans les angines malignes à fausses membranes putréfiées, fétides, on

trouve souvent sur les lames un grand nombre de germes tandis que le B. diphtérique est rare ou absent. Dans ce cas, on ensémencera Success

vement trois tubes de sérum numérotés sans recharger la spatule: Dans le

ou les premiers tubes, on ne trouve souvent alors que du B. d’'Hofmamn et des cocci tandis que les B. diphtériques longs ou moyens se montrent sur le troisième (Aviragnet). |

Ensemencement des tubes. — L’ensemencement doit remplir certaines conditions pour que les colonies soient suffisamment espacées; trop nombreuses, leurs caractères macroscopiques, très importants quand il faut se contenter d’un diagnostic rapide, deviennent impossibles à apprécier. Be plus, l'obtention de colonies bien isolées facilite la purification de la culture nécessaire à une identification éventuelle.

On utilisera des tubes de sérum coagulé de bœuf ou de cheval(t}. I faut rejeter

l’usage de la gélose ordinaire; on n’obtient sur ce milieu que des colonies de strepto-.

coques ou de staphylocoques qui poussent mieux que le B. diphtérique et l’étouffent. La spatule introduite dans le tube sera plongée dans l’eau de condensation sans l’agiter, ce qui la priverait d’une certaine quantité de bacilles par dilution. On la promène alors à plat sur toute la surface du sérum en faisant des stries longitudinales et parallèles bien serrées et toujours dans le même sens. Le tube rebouché et placé

verticalement, on en ensemence un second, puis un troisième sans recharger la spa.

tule. Les tubes, numérotés et étiquetés, sont mis à l’étuve réglée soigneusement entre 39 et 57, toute température inférieure à 55° retardant la culture.

Avec ces précautions, il est exceptionnel, quand 1l s’agit de diphtérie y)

que l’'ensemencement des produits pathologiques ne donne pas de résultats.

positifs dès le premier examen. Lorsque les Lubes restent stériles, alors que l'aspect chinique fait penser à la diphtérie, il faut songer aux causes d'erreur suivantes : ensemencement pratiqué avec une spatule trop chaude; spatule dépouillée du produit pathologique par le frôlement des lèvres ou de la langue; prélèvement fait après gargarisme ou badigeonnage antiseptique; enfin déréglage de l’étuve. Quand un examen négatif se trouve en désaccord avec la clinique, il faudra en refaire un nouveau: si ce dernier, convenablement pratiqué, reste négatif, on peut conclure à lPabsence de diphtérie. <

Examen macroscopique des tubes. — Le bacille pousse sur sérum en.

18 à 24 heures, mais son développement étant parfois plus lent, chez les

porteurs « sains » en particulier, il y a lieu d’envisager ces deux cas diffé-

rents :

1° Au bout de 18 à 24 heures presque rien n’a poussé sur le tube.

4. On peut facilement préparer un bon milieu en utilisant un sérum thérapeutique périmé qu’on fait coaguler dans un tube stérile incliné au-dessus d’un récipient d’eau en ébullition. A défaut de sérum, on pourrait encore employer du blanc d'œuf coagulé.

DIAGNOSTIC BACTÉRIOLOGIQUE DE LA DIPHTÉRIE. Fasc. II. — 551

a) Si la culture provient d’une angine cliniquement banale, on peut attendre au lendemain; remettre donc le tube à l’étuve sans l’examiner.

b) Si la culture provient d’une angine suspecte où le diagnostic est hésitant,-.dans ce cas seulement, on est autorisé à racler la surface du tube sans attendre le développement de colonies distinctes.

2 Au bout de 24 heures il existe des colonies isolées.

Le B. d'Hofmann et certains microcoques poussant presque aussi vite que le B. diphtérique, il faut étudier avec soin l'aspect des différentes colonies. Celle‘du B. diphtérique est blanche, opaque, surélevée au centre, sèche; celle du B. d’'Hofmann est d’un blanc jaunâtre, aplatie, translucide, humide; celle du streptocoque est opaline et plus fine; celle du staphylocoque doré est franchement jaune; celle du staphylocoque blanc est très plate et porcelainée. Ces différences s’accentuent dans les cultures plus âgées.

L'étude de toutes les colonies du tube serait fort longue s'il fallait colorer chacune d'elles. Avec un peu d'habitude, -on les groupe facilement d’après les caractères indiqués et on ne colore que les différents types. L'examen de la culture ne présente pas de difficultés si le B. diphtérique est abondant, mais si on ne trouve sur les premières lames que du B. d'Hofmann, il faudra, pour que le diagnostic ait de la valeur, contrôler avec soin chaque colonie douteuse, c'est-à-dire moins humide ou un peu surélevée. Il importe aussi de ne pas prélever plusieurs colonies à la fois; en présence de B. diphtérique et de B. d'Hofmann mêlés, le diagnostic deviendrait fort délicat.

Examen microscopique des colonies. — La colonie choisie, on en prélève une parcelle avec le fil de platine et on la porte sur une lame dans une gouttelette d’eau distillée, on étale en couche uniforme, on laisse sécher et on fixe à la flamme, ou mieux à l’alcool-éther. |

Cette coloration peut être faite dans deux buts différents, soit pour séparer le B. diphtérique des bacilles qui sont décolorés par la méthode de Gram, soit pour étudier les détails de sa structure.

La méthode de Gram doit être appliquée avec certaines précautions, le B. diphtérique se décolorant assez facilement. On procédera ainsi :

Colorer une minute avec le violet de gentiane phéniqué(t), égoutter le colorant, et, sans laver, recouvrir de liquide de Lugol fort(?); laisser en contact une. minute, puis égoutter. Sans laver, différencier par l’alcool-acétone(5); dès que l'alcool versé sur la préparation cesse de se colorer en violet, arrêter la différenciation rapidement en

lavant-à l’eau. Enfin on fera une recoloration de contraste avec la fuchsine de Ziehl diluée à 1 pour 50. Laver, puis sécher.

Les B. diphtériques apparaissent uniformément colorés en violet noir avec leurs groupements spéciaux.

1. Violet de gentiane, 1 gr.; alcool à 959, 10 c. e.; acide phénique cristallisé, 2 gr. ; eau distillée, 100 gr. Dissoudre le violet dans l’alcool, ajouter l'acide phénique et triturer au mortier; puis ajouter les deux tiers de l’eau par très petites portions à la fois, sans cesser d’agiter. Verser dans un flacon, puis rincer le mortier avec le dernier tiers de l’eau qu’on ajoutera au reste. Filtrer après 24 heures de repos.

2. Iode, 1 gr.; iodure de potassium, 2 gr.; eau distillée, 200 gr. Dissoudre l’iodure dans un peu d’eau; ajouter l’iode, le dissoudre: ajouter peu à peu le reste de l’eau.