TABLEAU XI
Acétaldéhyde en y d D k 124 1,0 39,2 0,408 186 0,5 46,7 0,330 248 0,5 34,9 0,457 310 0,5 26,0 0,585 372 0,5 19,5 0,710
La courbe tracée à partir de ces chiffres est très sensiblement une droite. L’interpolation entre deux valeurs est donc parfaitement justifiée.
2. — DoSAGE DE L’ALANINE ET DE LA SÉRINE+ACIDE ASPAR- TIQUE DANS 200 MG. DE PROTÉINE.
A. — Description de la méthode.
a) Hydrolyse. — 200 mg. de protéine environ sont hydratés 36 heures avec 2 à 3 cc. d'acide sulfurique 6 N. L’hydrolysat est dilué à 200 cc. et l’acide sulfurique quantitativement précipité par de la baryte fraîchement recristallisée. Le sulfate de baryum séparé par centrifugation est lavé 5 fois à l’eau bouillante. Les eaux-mères et de
lavage sont réunies et évaporées sous vide jusqu’à 50 cc. Quelques dixièmes de centimètre cube sont prélevés pour un dosage d’azote (microkjeldahl) et le reste est soumis à la désamination.
b) Désamination. — On dilue à 200 cc. avec de l’eau et on ajoute 10 cc. d’acide sulfurique 2 N. On chauffe au bain-marie bouillant puis on laisse {tomber goutte à goutte, pendant une demi-heure, et en agitant bien, 25 cc. d’une solution à 5 1% de nitrite de sodium. On laisse ensuite 1/4 d'heure au bain-marie. Pendant ce temps la réaction de désamination se termine et une partie de l’acide nitreux en excès se décompose. On ajoute alors, goutte à goutte, et pendant 15 minutes, 7,5 cc. d’une solution d’urée à 30 % qui détruit l’acide nitreux en excès. L’addition d’une plus forte quantité d’urée est inutile et nuirait même au moment de l’oxydation permanganique. La liqueur est alors évaporée sous vide jusqu’à 100 cc.
c) Oxydation permanganique. — Le dosage spécifique de l’alanine et de la somme sérine+acide aspartique se fait conformément aux indications données précédemment. Toutefois l’addition de quantités légèrement plus fortes d’acétate mercurique s’est révélée nécessaire : il faut ici 2 cc. d’acétate mercurique à 5 % par 10 cc. de liquide à oxyder, soit deux fois plus que dans la méthode originale.
d) Dosage colorimétrique. — Il est effectué selon la technique utilisée pour l’obtention de la courbe de référence.
B. — Justification de cette méthode.
a) Dosage d'une quantité connue d'alanine. — 200 mg. d’alanine sont dissous dans 200 cc. d’eau et désaminés. On amène le volume à 100 cc.; 5 ce. de cette solution sont oxydés par le permanganate de potassium en présence d’acétate mercurique. Volume de la solution aldéhydique: 100 cc.
NI
a = 6 cc. d =0,5 D = 29,3 k = 0,553 soit 288 y-acétaldéhyde
Quantité d’alanine retrouvée :
— 193 mg. ou 96 % de la quantité 4.5.6
initiale.
b) Dosage de l'alanine et de la somme sérine + acide aspartique dans l’édestine (Hoffmann-La Roche). — Quantité de protéine hydrolysée (microkjeldahl) : 1,55 g. calculée en prenant N = 18,7 9%).
Volume total : 500 cc.
a) Désamination : prise d’essai : 75 cc. (232 mg. de protéine) ; volume final : 100 cc.
b) Oxydation permanganique :
a) dosage de l’alanine.
Prise d’essai : 40 cc. qui sont additionnés de 10 cc. de UMR Aa 210,2 5Uecc de PO; 27M et 11 "cc "de (CH,COO), Hg à 5 :%. Ebullition 50 minutes. Volume de la solution aldéhydique : 75 cc.
a-= 6-cc. d =0,5 D = 43,0 k = 0,367 soit 205 -acétaldéhyde
Acétaldéhyde total dans les 500 cc. initiaux :
0,20575 "100. > 500 = 42,6 mg.
6 . 40 . 75 Quantité d’alanine correspondante : 86 mg. ou 5,55 %. B) Dosage de la somme sérine + acide aspartique. Prise d’essai : 20 cc. qui sont additionnés de 20 cc. de SO,Mn 10 %, et de 5 cc. de PO,H, 2 M. Ebullition 65 minutes. Volume de la solution aldéhydique : 75 cc. a — 6 cc. d = 0,5 D — 35,7 k — 0,448 soit 245 y-acétaldéhyde
Acétaldéhyde total dans les 500 cc. initiaux :
Lane.
— 102,0 mg.
GA 20/2 070 La somme sérine + acide aspartique correspond donc à: 102,0 — 42,6 — 59,4 mg. acétaldéhyde.
Les teneurs de l’édestine en alanine, sérine et acide aspartique telles qu’elles sont admises actuellement, sont respectivement de 3,6 %, 0,33 % et 10,4 %.
Les chiffres concernant l’alanine et la sérine ont été obtenus par E. Abderhalden [9]. Cet auteur estérifie les acides aminés provenant de l’hydrolyse acide de la protéine et soumet les esters à la distillation fractionnée. Il obtient ainsi quatre fractions qu’il saponifie. L’alanine est ensuite séparée par cristallisation fractionnée et la sérine par l'intermédiaire de son dérivé f-naphtalène-sulfonylé. Or ces manipulations sont toujours, même si l’on opère sur de grosses masses, accompagnées de fortes pertes dues à des réactions secondaires.
IT n’est donc pas étonnant, comme le fait remarquer Desnuelle, que la valeur de 3,6 % indiquée par Abderhalden pour l’alanine soit sensiblement inférieure à celle obtenue par la méthode actuelle ; et étant donnée la spécificité de cette méthode, il apparaît que c’est cette dernière valeur qui doit être considérée comme exacte.
D'autre part, le chiffre de 0,33 % pour la sérine est probablement entaché d’une erreur encore plus considérable du fait que l’obtention du dérivé f-naphtalène-sulfonylé d’un acide aminé est loin d’être une opération quantitative. Si l’on prend le chiffre sensiblement double de 0,7 % comme expression de la véritable teneur de l’édestine en sérine, on peut déduire du dosage colorimétrique précédemment indiqué une teneur en acide aspartique de 10,6 %. Cette valeur est en parfait accord avec celle de 10,4 % indiquée par D. B. Jones et O. Mœller [10]. Ces auteurs précipitent l’aspartate de baryum par l'alcool et isolent ensuite cet acide par son sel de cuivre. Cette tech-
Egg
nique est susceptible de donner des résultats quantitatifs, et la valeur ainsi obtenue doit être considérée comme correcte.
Ces considérations permettent de conclure que si le dosage colorimétrique de l’alanine et de la somme sérine + acide aspartique dans l’édestine donne des résultats plus forts que ceux fournis par les techniques d’isolement, les divergences observées ne sont pas telles qu’on ne puisse raisonnablement les attribuer au manque d’exactitude de ces dernières.
c) Dosage de l'alanine et de la somme sérine + acide aspartique dans la caséine d'apres Hammarsten.
Quantité de protéine hydrolysée (microkjeldahl) : 1,40 g. (calculée en prenant N — 15,7 %).
Volume total : 250 cc.
Désamination : prise d’essai : 35 cc. (196,5 mg. de protéine) ; volume final : 100 cc.
Oxydation permanganique :
a) dosage de l'alanine.
Prise d’essai : 65 cc. qui sont additionnés de 10 cc. de HO Mn 411019; 52cc. de! POH,:2.M, et de. 15 ce'7de (CH,COO),Hg à 5 %. Ebullition 50 min. Volume de la solution aldéhydique : 75 cc.
a = 6 cc. d=1 D = 35,2 k = 0,454 soit 137 y-acétaldéhyde
Acétaldéhyde total dans les 250 cc. initiaux :
0,137 . 75 . 100 . 250 Re 1S Sen 6.65. 35
Quantité d’alanine correspondante : 38,1 mg. =2,7 %.
B) Dosage de la somme sérine + acide aspartique.
Prise d’essai : 35 cc. qui sont additionnés de 20 cc. de
HEITZ l 3
SO, Mn à 10 % et de 5 cc. de PO,H, 2 M. Ebullition 65 min. Volume de la solution aldéhydique : 75 cc.
a = 6 cc. d = 0,5 D = 445 k= 0,392 soit 197 y-acétaldéhyde
Acétaldéhyde total dans les 250 cc. initiaux : 0,197 . 75 . 100 . 250
= 50,1 mg.
6 . 35 . 35 La somme sérine + acide aspartique correspond donc à: 50,1 — 18,8 — 31,3 mg. d’acétaldéhyde.
Les teneurs indiquées par F. W. Foreman [11] sont pour l’alamine de 1,8 %. Pour la sérine de 0,5 % et pour l'acide aspartique de 4,1 %. Le tableau XII permet de comparer, traduites en acétaldéhyde, ces dernières valeurs et celles obtenues par dosage colorimétrique.
TABLEAU XII Quantités d’acétaldéhyde ÂAcides aminés trouvées par Wire aie colorimétrie crues de Foreman ATATITEENERSS MR AR NT ee 18,8 mg 12,5 mg Somme sérine + Acide aspartique 31,3 mg 22,3 mg
On doit admettre ici encore, que, comme dans le cas de l’édestine, ces divergences proviennent du manque d’exactitude des techniques d'isolement. Si l’on admet comme exacte la valeur de 4,1 pour l'acide aspartique, les chiffres précédents permettent de calculer une teneur en sérine de 2,3 (%.
Application à la protéine du ferment jaune
Un échantillon de ferment jaune soigneusement purifié a été scindé par le méthanol bouillant en ses deux constituants. Le support protéique, qui précipite en gru-
meaux, est séparé par centrifugation du liquide jaune fluorescent contenant l'acide lactoflavinephosphorique. Sans être séchée, cette protéine est hydrolysée 36 heures avec 3 cc. d’acide sulfurique 6 N.
On effectue deux dosages parallèles sur chaque fois 198,1 mg. (cette valeur est déterminée par microkjeldahl en prenant le pourcentage d’azote du ferment égal à 16,8).
Volume total : 200 cc,
Désamination : prise d’essai : 200 cc. ramenés après désamination à 100 cc.
Oxydation permanganique :
a) Dosage de l'alanine.
Prise d’essai : 45 cc. qui sont additionnés de 10 cc. de On 10.9 5 cc de POH, 2M et. de, 12, cc. , de (CH,COO),Hg 5 %. Ebullition 50 min. Volume de la solution aldéhydique : 75 cc.
a—6 cc. d =—0,5 D, = 29,2
D, =:28;8 k, = 0,535 soit 287 y-acétaldéhyde k, = 0,541 soit 290 +-acétaldéhyde
Acétaldéhyde total dans les 200 cc. initiaux : 0282222100
1) RTE RTS 6 . 45 0,290 . 75 . 100 2) BR en 4 ANT 6. 45
Quantités d’alanine correspondantes : 16,15 mg. et 16,42 mg.
Moyenne : 16,28 mg., soit 8,2 %.
B) Dosage de la somme sérine + acide aspartique.
Prise d’essai : 30 cc. qui sont additionnés de 20 cc. de SO,Mn 10 % et de 5 cc. de PO,H, 2 M. Ebullition 65 min. Volume de la solution aldéhydique : 75 cc,
a = 6 cc. d = 0,5 D, = 31,5
D, =30,4 k, = 0,501 soit 270 y-acétaldéhyde k, = 0,518 soit 279 y-acétaldéhyde
Acétaldéhyde total dans les 200 ce. initiaux : 11,25 mg. et 11,62 mg. Moyenne : 11,43 mg.
La somme (sérine + acide aspartique) correspond à 11,43 — 8,03 — 3,4 mg. d’aldéhyde.
Kuhn et Desnuelle [12, 13], partant d’environ 1 g. de ferment, ont isolé 1,9 % d'acide aspartique. Ce chiffre ne représente qu'une valeur limite inférieure de la teneur véritable du ferment en cet acide. Si, comme il est probable, cette teneur est de l’ordre de 3 %, le dosage précédent permet de calculer, en première approximation, un pourcentage de sérine égal à 1,7 %.
Dans une molécule de ferment jaune (P. M. — 70.000), il y aurait donc 65 molécules d’alanine et environ 11 molécules de sérine et 16 d’acide aspartique. Grâce à ces résultats, joints à ceux déjà obtenus par Kuhn et Desnuelle, 76 % de l’azote protéique du ferment jaune se trouvent ainsi caractérisés.
Essais de séparation quantitative de l'acide aspartique à partir d’un mélange contenant, outre cet acide, de l'alaine et de la sérine
On dissout dans un volume d’eau suffisant :
102,0 mg. alanine, 105,2 mg. sérine, 103,4 mg. acide aspartique, 100 mg. glycocolle, 100 mg. nitrate d’arginine, 100 mg. acide glutamique, 100 mg. tyrosine.
do —
Les acides aminés dicarboxyliques sont séparés sous forme de leur sel de baryum suivant la technique de D. B. Jones et O. Moeller [4]. Après élimination du baryum par l’acide sulfurique, on obtient deux liqueurs, L, et L,. L, provient des sels de baryum solubles dans l'alcool et doit contenir l’alanine et la sérine ; L, provient des sels de baryum insolubles dans l’alcool et doit contenir ainsi l'acide aspartique. :
Après désamination, les liqueurs L, et L, sont oxydées au permanganate en présence et en l’absence d’acétate mercurique.
Les quantités d’acétaldéhyde obtenues dans chaque cas sont les suivantes :
L, avec acétate mercurique .. 47,5 mg.
L, sans acétate mercurique .. 86,6 mg.
Différence." 39,1 mg.
L, avec acétate mercurique .. traces indosables
L, sans acétate mercurique .. 33,1 mg.
Les valeurs finales dent respectivement à l’alanine, à la sérine et l’acide aspartique, sont données dans le tableau XIII.
TaABLEAU XIII
Calculés Retrouvés
Acides aminés us PAT à % ATaninemer 20e 102,0 96,0 94,0 Série M mie cr oue 105,2 93,2 88,6 Acide aspartique .... 103,4 100,1 96,5
Ces résultats montrent que les trois acides aminés, alanine, sérine et acide aspartique, peuvent être dosés séparément dans une protéine en combinant les méthodes de Jones et Moeller avec celles que nous avons mises au point, dès que l’on possède de 2 à 5 g. de cette protéine.
