TECHNIQUE

1° Transformation des acides aminés en les hydroxyacides correspondants

Cette transformation correspond à la réaction :

R CHNH, COOH+NO,H=R CHOH COOH+N,+H,0

Elle est faite selon la méthode de Kendall et Friedemann.

Appareillage : L’appareillage comporte un flacon jaugé (100 cc. à 200 cc.), en verre Pyrex, et une boule à brôme dont l'extrémité est étirée en capillaire, et suffisamment allongée pour pouvoir atteindre le fond du flacon.

Réactifs : Les réactifs utilisés sont les suivants : une solution d’urée pure à 7,5 %, une solution de nitrite de sodium pur à 2,5 %, et de l’acide sulfurique normal.

Mode opératoire : On introduit dans le flacon jaugé le milieu soumis à l’analyse et contenant de 10 à 60 mg. du mélange des acides aminés ; on ajoute ensuite de l’eau distillée, de telle sorte que l’on ait un volume de 75 cc. puis 0,25 cc. d’acide sulfurique normal. Le flacon renfermant ainsi la solution acide des acides aminés est placé au bain-marie bouillant où il atteint une température voisine de 95°. On ajoute alors 15 cc. de la solution de NO,Na ; cette addition se fait de la façon suivante : la solution de nitrite étant placée dans la boule à brôme, on la laisse lentement couler dans la solution des acides aminés, à raison de 1 cc. par minute, et en ayant soin que l'extrémité de la boule à brôme descende bien jusqu’au fond du flacon ; ce dernier est agité fréquemment. Dès

que la boule à brôme est vide, on y introduit 15 cc. de la solution d’urée que lon fait couler dans le flacon jaugé dans les mêmes conditions et avec les mêmes précautions que précédemment. Quand l’addition de la solution d’urée est terminée, on enlève le flacon du bain-marie, on en rince soigneusement le col avec de l’eau distillée, et le laisse refroidir avant de compléter au trait.

Remarque. — Si, en dehors des acides aminés, il se trouvait dans la solution des substances qui, comme les hydrates de carbone, peuvent gêner le dosage ultérieur de lacide lactique, il conviendrait de les éliminer en introduisant, avant de compléter le volume du flacon jaugé, 10 cc. d’une solution à 20 % de sulfate de cuivre et 10 cc. d’une suspension d’hydroxyde de calcium à 20 % dans l’eau ; on agite énergiquement, puis on complète au trait. On filtre ensuite dans un flacon sec et prélève des fractions aliquotes pour les opérations suivantes :

2° Oxydation des hydroxyacides

avec production des aldéhydes correspondants

Cette oxydation est représentée par la réaction :

R CHOH COOH+O=R CHO+H,0+CO,

Appareillage : On utilise ici l’appareil classique de Th. E. Friedemann, M. Cotonio et A. Shaffer [5] pour le dosage de l'acide lactique.

Réactifs : On emploie les réactifs suivants : solution de MnOKO0,2N ; solution de SO,Mn à 10 % ; solution de POH,2N; solution saturée de CO,;NaH; solution de SO.NaH à 1 % :; solution titrée d’iode ON; solution titrée d’iode 0.01 N ; solution de (CH,COO), Hg à 5 % ; cette dernière solution contient en outre 1 cc. d’acide acétique pur pour 100 cc. ; empois d’amidon.

Mode opératoire

a) POUR L'OBTENTION QUANTITATIVE D’ACÉTALDÉHYDE A PARTIR DE L'ACIDE LACTIQUE SEUL : DOSAGE DE L’ALANINE SEULE.

L'appareil étant monté comme d’habitude, on y introduit un volume connu de la solution des hydroxyacides obtenus au cours de l’opération précédente ; on ajoute 10 cc. de la solution de PO,H,, puis la quantité de SO,Mn nécessaire pour que le milieu renferme 2 % de SO,Mn (soit 10 cc. pour un volume total de 50 cc.) ; on introduit enfin dans le milieu le dixième de son volume de la solution d’acétate mercurique, puis une pincée de talc. L’appareil est alors mis en marche dans les conditions habituelles ; lorsque l’ébullution commence, l’on introduit la solution de MnO.,K à raison d’une goutte toutes les secondes, pendant 10 minutes. On maintient lébullition pendant une dizaine de minutes après la fin de l’addition du réactif ; on arrête ensuite l’appareiïl et après les lavages usuels, on ajoute de l’emploi d’amidon à la solution de bisulfite, détruit celle-ci d’abord par l’iode 0,1 N puis par l’iode 0,01 N, selon la technique classique. On ajoute ensuite 10 cc. de la solution saturée de CO,NaH, et détruit exactement le bisulfite libéré par l’iode 0,01 N.

b) POUR L'OBTENTION QUANTITATIVE D'ACÉTALDÉHYDE A PARTIR DE LA SOMME ACIDE LACTIQUE-+ACIDE GLYCÉRIQUE+ ACIDE MALIQUE : DOSAGE DE LA SOMME ALANINE-+-SÉRINE+ ACIDE ASPARTIQUE.

L’oxydation par le permanganate diffère ici de ce qu’elle est dans le cas précédent, par les points suivants :

— La réaction se fait en absence d’acétate mercurique.

— La concentration du sulfate de manganèse introduit est double (20 cc. de la solution de SO,Mn pour un volume total de 50 cc.) de ce qu’elle est pour le dosage de l’alanine seule.

ls —

— La solution de permanganate est introduite à raison d’une goutte toutes les trois à quatre secondes, pendant 60 minutes ; l’ébullition étant maintenue 10 minutes après la cessation de l’introduction du réactif.

3° Dosage de l'acétaldéhyde

Le dosage de lacétaldéhyde se fait par colorimétrie, en utilisant la réaction que donne cette substance avec le nitroprussiate de sodium en présence de pipérazine.

Appareillage : Nous nous servons ici du spectrophotomètre de Jobin et Yvon.

Réactifs : Une solution fraîche (immédiatement préparée) de nitroprussiate de sodium à 4 %, et une solution de pipérazine obtenue en dissolvant 25 g. de pipérazine dans 75 cc. d’eau distillée, ce qui correspond sensiblement à la solution saturée.

Mode opératoire : La solution obtenue au cours des opérations précédentes contient de l’aldéhyde libéré du bisulfite, ce dernier ayant été détruit ensuite par l’iode. On supprime toute trace de coloration bleue par addition d’une goutte d’hyposulfite 0,1 N et on transvase la solution, quantitativement, dans un ballon jaugé de 100 cc. On complète au trait.

Sur les 100 cc. ainsi obtenus, on prélève 6 cc. que l’on place dans un tube à essais susceptible d’être bouché à l’émeri, et dans lequel on introduit ensuite 0,5 cc. de la solution de nitroprussiate de sodium et 1,5 ce. de la solution de pipérazine ; on agite alors le tube énergiquement, puis on en verse le contenu dans la cuve d’absorption (épaisseur—1i cm.) du spectrophotomètre, avec les précautions d'usage. L’intensité de la coloration croît assez rapidement ; on la suit en se plaçant sur la longueur d’onde de 5.600 À. Après deux à trois minutes, la coloration atteint son maximum que l’on détermine par plusieurs lec-