CHAPITRE PREMIER

TECHNIQUE

1° Choir de la plante, sujet d'expérience. — Toute plante, dans les conditions où elle est placée et que je préciserai plus loin, ne peut être employée pour ce genre de recherches. 11 faut, en effet, que sa graine, de préférence sans albumen, se stérilise rigoureusement, sans nuire à sa germination ; que son développement se fasse assez rapidement, mais toutefois sans atteindre des dimensions disproportionnées avec la grandeur du vase, relativement petit, dans lequel elle est renfermée. En outre, il est indispensable que son poids sec, obtenu à la récolte, soit suffisarnment appréciable.

Toutes ces nombreuses exigences expérimentales font que peu de plantes soient utilisables, et, parmi elles, le Radis (Raphanus sativus, L.), variété ronde, rose à bout blanc, est certainement une des plus avantageuses : c’est donc lui que nous adopterons.

29 Tringe des graines de Radis. — Dans le cours de ce travail, nous serons amenés à comparer, entre eux ou avec ceux des milieux témoins, les poids secs des pieds récoltés dans les divers milieux organiques. Pour effectuer ces comparaisons d’une façon exacte, il faudrait partir de plantules ayant rigoureusement Ie même poids sec. Cette condition estévidemment irréalisable, mais on peut s'en approcher pratiquement d'assez près et connaitre le degré d'approximation. Pour cela, on choisit à la balance de précision les graines de Radis dont le poids est supérieur à 12 milligrammes et inférieur à 14. Dans ce lot, ainsi obtenu, nous prélevons, au hasard, quinze séries de trois échantillons (1) que nous pesons.

La plus grande différence de poids constatée entre ces séries est de 3M87,5, ce qui correspond à une moyenne de 1mgr,2 entre chaque graine. Si maintenant nous débarrassons ces

(1) Le poids sec moyen des pieds récoltés est également déterminé sur une série de trois échantillons.

graines de leur tégument, opération facile après une macéralion dr eau distillée pendant quelques heures et que nous déterminions les poids totaux des trois plantules desséchées à 1059, appartenant aux graines des mêmes triades précédentes, on constate que celles-ci diffèrent entre elles de 6M875,6 au maximum, ce qui entraine pour chaque plantule un écart de 2mgrs.2 en plus. Nous pouvons done, en procédant ainsi, comparer entre eux ou avec ceux des milieux témoins, les poids secs des pieds récoltés, avec une approximation connue et suffisante de 2 milligrammes. Le poids moyen d’une plantule desséchée est de 10m81s,3.

30 Stérilisation des graines de Radis. — Les graines de Radis, par groupes de cinquante environ, sont mises dans un tube à essai stérilisé, dans lequel on verse 10 à 15 centimètres cubes d'alcool absolu. Ce tube bien bouché avec la pulpe du pouce, préalablement lavé, est agité énergiquement pendant une munute. Cette opération très importante a surtout pour but de «décaper » le tégument de la graine en dissolvant l’enduit, probablement cireux, qui le recouvre et auquel adhèrent fortement les germes que l’on veut précisément éviter. Cet enduit, un peu hydrofuge (1), annihilerait, ou, tout au moins, atténuerait fortement l’action consécutive, si brève, de la solution aqueuse de sublimé. L'alcool absolu est alors décanté et remplacé par 10 à 15 centimètres cubes de solution aqueuse de sublimé corrosif au 1/100€. Après une nouvelle agitation durant une minute, le liquide est rejeté et on ajoute aussitôt de l’eau redisüllée (2) stérile. Ce lavage aqueux, qui exige le même temps que les traitements précédents, estrenouvelé dix fois de suite; puis, lesgraines sont transvasées dans un autre tube stérilisé, bouché à louate. Dès lors, comme la quantité de sublimé qui peut rester encore dans le tégument est infinitésimale, si tant il en . (1) En effet, les graines lavées à l'alcool et plongées dans l'eau se gonflent immédiatement et doublent leur volume en quelques heures, tandis que celles qui n'ont pas subi ce traitement mettent plus de vingt-quatre heures pour arriver au même résultat. L'existence de cet enduit est encore prouvé très facilement, en lavant à l'alcool une certaine quantité de graines ; après filtraou a de la liqueur, il reste un léger résidu, insoluble dans l’eau,

(2) Redistillée dans un appareil en verre. Je n'ai utilisé que cette eau pour {outes mes expériences.

reste, les lavages aqueux sont espacés de dix minutes pendant la première heure, de quinze pendant la deuxième et enfin de trente minutes durant la troisième. |

49 Ensemencement des graines. — Repiquage des plantules. — La dernière eau étant en grande partie éliminée, au moyen d’un fil de platine dont l'extrémité est enroulée en spirale conique, comprenant trois ou quatre spires, on prend, comme avec une cuiller, les graines une à une. Chacune d'elles est déposée sur un lit d'ouate humide renfermée dans un tube à pomme de terre, bouché au coton et dont la partie inférieure est garnie d'eau distillée : le tout est, au préalable, stérilisé à l’autoclave. Toutes ces opérations, comme les suivantes, sont conduites avec toute la minutie recommandée en bactériologie.

Les graines ne tardent pas à germer, sauf quelques-unes qui ont été tuées pendant la stérilisation ou qui sont mauvaises. Lorsque la radicule à atteint une longueur de un centimètre environ, ce qui demande deux ou trois jours, on repique les plantules à l'aide d’un crochet en fil de platine, chacune dans un tube dit « à culture », renfermant le substratum imprégné de solution nutritive additionnée ou non d'acide organique, le tout toujours soigneusement stérilisé.

Lorsque toutes ces manipulations sont exécutées avec beaucoup de soin, les contaminations sont assez rares. On peut même les réduire à 2 ou 3 p. 100, si l’on repique la plantule débarrassée du tégument de la graine, auquel adhèrent parfois des germes qui ont échappé à l’action du sublimé.

59 Description du tube « à culture ». — Milieux nutritifs employés. — Préparation des tubes « à culture ». — Exposition des plantes. — Le tube « à culture », dans lequel la plantule va se développer, a la forme indiquée par la figure 1. Son volume est de 300 centimètres cubes environ, sa hauteur totale de 25 centimètres et son diamètre de 5. Le goulot, long de 5 centimètres, est bouché avec de l'ouate peu serrée et recouvert d’un capuchon de verre.

Le milieu de culture, de beaucoup le plus employé, est celui de Knop, dont la formule est la suivante :

ArataterderCalCME RE ere i gramme.

UD DO SITE eme mameese cs Oer,25

Phosphate acide de potassium............... Cer,25 Chlorure delpDotaSSIUMe ere PR TE Or,25 Sulfate de MarnÉSIUM. rer 08,25 Solution de sulfate ferreux au 1/100€......... Il souttes. FauirediS tulle eee. Le MER ere 1 litre.

additionné des acides organiques libres ou de leurs sels polassiques, dans des proportions telles que volumes égaux renferment rigoureusement, pour la mêmesérie d'expériences, L: même poids de carbone.

Pour l'acide oxalique, libre et combiné, afin d'éviter sa précipitation, j'ai préparé un milieu sans calcium dont voici la composition :

A0 aber des POEASSIUMN 2 PER RE NES 0æ,50 Phosphate acide de potassium.............. 7 (UE GHiopure dé DORSAUM RER ER RES Cæ 10 DULEA TEL NAS UE RE 08r,20 Solution de sulfate ferreux au 1/1000....,..... IL gouttes. Fa: PédiStilie. 5 ee RR 1 litre.

Mais cet acide, même combiné (1), se décompose avec une si grande facilité, en présence de n'importe quel substratum, qu'au bout de quelques semaines d'exposition à l'air, il a complètement disparu de ses solutions. En raison de ce fait, je n'ai. pas cru devoir indiquer les résultats qu'il m'a donnés.

Des milieux témoins sont faits avec du Knop seul ou additionné de glucose, d’une part et de quelques sels de potassium, chlorure où sulfate (2), d'autre part. Les poids de ces Corps sont calculés de façon que le glucose ait même teneur en carbone que les acides et les composés polassiques, même teneur en métal que les sels organiques. Et cela, dans le dernier cas. afin de se rendre compte, aussi exactement que possible, de l’influence de l'apport potassique des combinaisons organiques.

Comme substrata, j'ai d'abord adopté la pierre ponce, puis le sable de Fontainebleau lavé aux acides minéraux et l’ouate débarrassée de ses impuretés par plusieurs traitements à l'eau redistillée bouillante.

Voyons maintenant comment les tubes «à culture » sont garnis pour recevoir la plantule. Dans chacun d'eux, on intro-

(1) L'oxalate neutre est cependant beaucoup plus stable.

(2) Ges sels ont élé choisis parce que le chlore est, à ces doses, indifférent au point de vue nutritif, et l'acide sulfurique, par contre, un excellent aliment.

duit 120 centimètres cubes de ponce ou de sable, on les passe ensuite au four de Pasteur. Après refroidissement, on ajoute 50 centimètres cubes de milieu à essayer pour la pierre ponce et 40 centimètres cubes seulement pour le sable. Ces volumes, déterminés par des essais préliminaires, sont entièrement absorbés par ces substrata, surtout après la stérilisation à l’autoclave à laquelle sont soumis tous les tubes. On obtient ainsi pour la culture du Radis, surtout avec la ponce, des milieux solides bien humectés, dans lesquels les racines se développent aisément.

Comme le sable se tassait et aurait pu opposer une trop grande résistance à la pénétration des radicelles, immédiatement avant le repiquage des plantules, J'ai percé un trou central, aussi profond que possible, à l’aide d’une tige de fer stérilisée. Quant à l'ouate, quatre grammes suffisaient pour absorber 50 centimètres cubes de liquide nutritif. Détail important à relater, {toujours pour faciliter l'accroissement des racines,

PSE RAR

Fig. 14. — Tube « à

l'ouate était utilisée sous forme de bandes de culture » avecsub-

PL : ne stratum ouate,

deux centimètres de largeur et placées HE FOREL

circulairement contre la paroi du tube les trouve un pied de radis.

unes sur les autres, de manière à ménager au centre un espace libre intéressant toute la hauteur de ce substratum..

Des cultures en air confiné, à l'abri de l'acide carboniquede l'air, étant nécessaires pour bien mettre en évidence l'action revenant uniquement aux acides absorbés par la voie radiculaire, comme je l'ai constaté, il suffisait pour les obtenir, de repousser simplement le tampon de coton dans l'intérieur du goulot et d'obturer hermétiquement celui-ci avec un bon bouchon de liège paraffiné. Puis, avec un pinceau, on déposait dans la rainure formée par le bouchon et le goulot, une couche épaisse de paraffine liquéfiée. Dans ces conditions, la plante n'avait plus à sa disposition, comme source de carbone étran-

gère aux acides organiques, que celui qu'elle rejette elle-même par sa respiration, à l'état d'acide carbonique et qui ne peut augmenter son poids sec. |

Aussitôt ensemencés, les tubes dont le coton est préservé contre la pluie par le capuchon de verre, sont tous placés à la même exposition, à l’'airlibre, ‘contre un mur regardant le nord. Les plantes recevaient ainsi une belle lumière diffuse, mais le soleil ne les frappait jamais directement. La partie du tube renfermant le substratum était, de plus, garnie de papier noir qui réalisait autour des racines une obscurité assez parfaite.

69 Détermination de la loricité des acides organiques. — Leurs concentrations adoptées. — J'ai dà, avant tout, ce qui a exigé de nombreux essais préliminaires, déterminer les doses toxiques en milieu Knop pour chacun des acides organiques, afin de me placer dans des conditions favorables pour le développement de la plante. Ces essais, effectués en 1910, avec la ponce comme substralum, m'ont appris qu'il ne fallait pas dépasser, pour beaucoup d'entre eux (1), la dose de 3 grammes p. 1000, sauf pour l'acide oxalique qui était encore nuisible à 1#°,50 p. 1000.

Les milieux organiques d’une même série, renfermaient tous, je le répète, rigoureusement la même quantité de carbone. Les diverses séries sont caractérisées par les concentrations suivantes : le 1/200€, le 1/100€ et le 1/50€ des poids moléculaires des acides par litre, sauf pour les acides citrique et oxalique dont les doses (2) étaient respectivement les deux tiers et le double des précédentes. Ces dilutions, pour là plupart équimoléculaires, avaient comme avantages, non seulement d'offrir à la plante une même quantité de carbone, mais encore de posséder des pouvoirs osmotiques et des acidités égales, condilions physico-chimiques importantes à considérer dans de telles recherches. Cependant je crois être le premier qui les ait réalisées systématiquement pour les essais de nutrition des composés organiques en général. Voici d'ailleurs, en un tableau,

(1) Ces acides peuvent être classés ainsi, par ordre de toxicité décroissante : succinique, malique ou citrique, Lartrique, oxalique.

(2) L’acide citrique est, en effet, un acide en Cet l'acide oxalique un acide en C#, landis que les autres sont en C4

les traductions en grammes p. 1000 des concentrations utilisées, y compris celle du glucose :

1re série. 2e série. 3e série.

Retde malique.<.2, 5 net 0,67 41,34 2,08 a CARD te 0,75 1,50 3 RP ICI IQUE LA us ie à 0,59 1,18 2,36 Eh itrique”E-H20 7: FM,0, 70 1,40 2,80 —. xalique + 2H20....... 1,26 RS »

GICOS MB O 75. Le en 0,66 1,32 2,64

19 Préparation des sels acides el neutres de potassium ainsi que de leurs milieur. — Les sels acides et neutres ont été préparés en ajoutant aux quantités précédentes d'acides, dissous dans très peu d’eau, des proportions, préalablement déterminées, d’une solution de potasse pure. Cette solution doit être suffisamment concentrée pour que le volume {otal, après neutralisation convenable, ne dépasse pas, pour chaque tube, 25 centimètres cubes pour la ponce ou l'ouate et 20 centimètres cubes pour le sable. On parfait ces volumes avec de l’eau redistillée et il ne reste plus, pour constituer définitivement les milieux, qu'à ajouter 25 ou 20 centimètres cubes de Knop d'une concentration deux fois plus forte que celle donnée plus haut. J'exprimerai les concentrations de ces selsen poids d'acide qu'ils renferment.

89 Riécolle des pieds de Radis. Leurs poids frais el sec. Dosage de l'eau et des cendres. — Les récoltes ont été faites au bout de 45, 50 ou 60 jours de végétation; la durée exacte de chacune d'elles sera d’ailleurs indiquée avec les résultats obtenus. Les pieds de Radis avaient à ces époques, en air libre, dix centimètres de hauteur environ et six feuilles bien vertes; en air confiné ils élaient beaucoup moins développés. Je reviendrai d’ailleurs sur leurs caractères morphologiques.

Pour retirer la plante du tube, 1l suffisait de la saisir à l’aide d'une longue pince : je me suis toujours servi d’une grande pince à forcipressure. Aucune difficulté avec la ponce; mais avec le sable il était mdispensable de bien lhumecter d’eau. Avec l’ouate, j'ai dû arracher les pieds aussi complètement que possible et les couper ensuite au niveau du collet, afin d'obtenir des échantillons comparables.

Les racines étaient lavées sous un filet d’eau, en les malaxant délicatement avec les doigts pour détacher les particules solides

qui y adhéraient, puis comprimées légèrement entre des feuilles de papier buvard jusqu'à disparition de toute trace d'humidité extérieure. Les pieds, renfermés aussitôt dans un tube en verre bouché à l'émeri, étaient alors pesés sur la balance de précision par série de trois. Le tiers de ces poids donnait le poids frais moyen du pied.

Le poids see moyen était ensuite déterminé après une dessiccation à 1059 pendant quarante-huit heures.

En possession des poids frais, P, el sec, p, du pied moyen, il est facile de connaître la proportion d’eau qu'il renferme. Je la rapporterai, afin de mieux fixer les idées sur le degré de turgescence du végétal, à un gramme de poids sec: il suffit d’appli-

5) quer la formule k ae Die

Les cendres ont été obtenues par caleination des pieds secs, dans une capsule en platine, à une température aussi peu élévée que possible : j'ai opéré, dans ce but, avec une lampe à alcool.

99 Détermination des diverses acidités végétales : acidité relative, acidité combinée et acidité totale. — Berthelot et André ont montré « qu'il n'existe aucune relation entre la dose totale des acides végétaux contenus dans une plante, à l’état libre ou combiné et le titre acidimétrique dessucs extraits de ses différentes parties ». Mais on peut obtenir des résultats très approchés, disent-ils, en prenant le titre alcalimétrique des cendres obtenues par l'incinéralion d’un poids connu de matière sèche et en Jui ajoutant le titre acidimétrique du suc. Autrement dit, la teneur en acides totaux d'une plante esttrès approximativement égale à l'acidité relative (acides libres et demi-combinés) plus l'alcalinité des cendres {acides combinés).

Ain de ne préjuger en rien de la nature de ces acidités, je les exprimerai en centimètres cubes de solution cinquantième nor-

male (5) de soude pour un gramme de poids frais.

L’acidité relative est dosée en broyant, dans un mortier en verre, un pied de Radis bien lavé, dont on connait le poids frais, avec un peu d’eau distillée neutre et de sable siliceux pur. La bouillie ainsi obtenue est diluée et transvasée dans une capsule

en porcelaine ; on rince ensuite convenablement le mortier de façon à parfaire le, volume de 40 centimètres cubes environ. Puis l’on porte la capsule au bain-marie bouillant pendant quinze minules et l’on filtre sur un tampon de coton (1) qu'on lave à l'eau distillée chaude et neutre. Le filtrat obtenu ainsi avec le Radis est le plus généralement incolore et limpide, aussi se prête-t1l parfaitement au dosage acidimétrique en présence de la phtaléine.

La détermination de l’alcalinité des cendres s'effectue de la façon suivante : connaissant le poids frais du végétal, on le dessèche et on le calcine (2) (les sels organiques sont transformés en carbonates et alcalis libres) ; les cendres sont délayées dans une petite quantité d’eau distillée neutre et on ajoute

un excès connu de solution sulfurique (x) soit À centimè-

tres cubes. On porte à l'ébullition pendant quelques minutes et on détermine l'acide sulfurique libre au moyen d’une solution

de soude (

soit B le nombre de centimètres cubes trouvé:

N à (A—B)est, en centimètres cubes de soude G). l'acidité com- J

binée.

Quant à l'acidité totale, il suffit, pour la connaître, d’additionner les deux acidités précédentes.

On rapporte ensuite toutes ces données à un gramme de poids frais.

100 Échanges gazeux à l'obscurité : coefficient el intensité resprratoires. — Les échanges gazeux ont été étudiés par la méthode de Bonnier et Mangin, devenue si classique qu'il serait superflu de la décrire, Disons seulement qu’elle consiste à analyser, au début et à la fin de l'expérience, l'atmosphère dans laquelle se trouve la plante. Soumise tout récemment par Maquenne et Demoussy à une vérification très approfondie, ces auteurs la considèrent comme susceptible de fournir des nombres comparatifs utilisables. Je n'ai pas omis de rapporter les quantités d'acide carbonique et d'oxygène à une proportion d'azote égale

(1) Lavé à l’éther et à l’eau chaude.

(2) J'ai utilisé les cendres précédemment oblenues.

à la proportion finale. La respiration produite par le pied entier s’est prolongée durant vingt-quatre heures. Ce laps de temps, nécessaire pour obtenir un changement appréciable de l'air confiné, dont le volume était de 30 centimètres cubes, c’est-àdire en rapport avec les grandes dimensions du végétal, peut paraître exagéré, mais en réalité la plante n’en souffre pas. J'ai remarqué que l'acidité relative dosée après la respiration élait, en général, très diminuée et même, dans quelques cas, transformée en une légère alcalinité. Astruc avait déjà signalé ce fait chez les Crassulacées après huit heures d'exposition à l'obscurité.

L'énergie respiratoire peut être mesurée par le volume, en centimètres cubes, de l'acide carbonique dégagé, n, ou de l’oxygène absorbé, x”, par un gramme de poids frais pendant une heure. Certains auteurs, se basant sur des expériences assez récentes qui prouveraient que l'acide carbonique peut avoir au moins une double origine, préfèrent l'exprimer en oxygène ; d'autres continuent à la représenter en acide carbonique. Je la calculerai des deux façons, ce quiest facile, connaissant la proportion p. 100, et”, de chacun des deux gaz après la respiralion ; le volume de l'atmosphère confiné, »: le poids frais du pied, p; et /, la durée de l'expérience. Il suffit d'appliquer les formules suivantes :

ss 10mv , 10m EE tp ru:

119 Analyse de l'äir confiné des tubes « à culture». — Molliard a indiqué, dans son travail sur « L'action morphogénique de quelques substances organiques », un procédé très ingénieux pour effectuer des prises de gaz dans les cultures en air confiné. En raison du grand nombre de tubes en expérience, qu'il aurait fallu boucher avec des bouchons en caoutchouc traversés par des tubes de verre recourbés, ce procédé devenait un peu trop onéreux el encombrant à employer. Voici le moyen simple que Jai utilisé : à l’une des extrémités d'un tuyau en caoutchouc de 0",50 environ de longueur et d'un diamètre intérieur un peu inférieur à celui du goulot des tubes « à culture », On fixe vélinitivement et solidement un tube de verre épais à deux

courbures. L'autre extrémité est adaptée successivement au goulot des vases « à culture » dont on veut analyser l'air. On a pris la précaution, après le repiquage des plantules, de fermer hermétiquement ces vases avec des bouchons en liège assez gros pour que la moitié seulement soit incluse dans le goulot et, au moment de la prise de gaz, de tailler l'autre moitié en double biseau, afin d'éviter l’occlusion complète du tube en caoutchouc. Dès lors, le tube « à culture » étant couché horizontalement et l'appareil maintenu vertical, on remplit entièrement ce dernier avec du mercure de façon à ne pas y laisser d'air. On bouche ensuite avec le doigt le tube de verre que l’on plonge dans une cuve à mercure, au-dessous d'une éprouvette pleine de ce métal et renversée. Puis l'on chasse le bouchon de son goulot en effectuant sur lui des pressions digitales. Le mercure coule alors dans le tube « à culture » en déplaçant l'air confiné qui se dégage dans l’éprouvette. On peut activer le dégagement en comprimant énergiquement et par saccades le tube en caoutchouc, ce qui produit un brassage de l'air.