CHAPITRE PREMIER

TECHNIQUE

1° Choix:du Champignon. — J'ai eu recours, comme sujet d'expérience, au Penicillium glaucum (Link). C'est, des Champignons, le moins délicat sur le choix de ses aliments, dit Duclaux et le plus ubiquiste, comme l'écrit Alfred le Renard. De plus, Le cycle de son développement est plus long que celui de l'A spergillus niger, mis tant à contribution depuis Raulin, ce qui permet de suivre plus facilement l’utilisation des acides qu'on lui fournit.

2° Milieu de culture adopté. — Le milieu de culture de Raulin à élé adopté, avecquelqueslégères modificationsindispensables : le sucré et l'acide lartrique ont été supprimés et les carbonates de potassium et de magnésiumremplacés parles sulfates correspondants ; de plus, un peu de calcium a été ajouté, selon la recommandation de Duclaux.

Voici d’ailleurs la formule exacte de ce Raulin modifié :

Grammes.

Tate d'aMMONIUM LE ARR ou 0,266.

Phosphate acide d’ammonium... .......... 0,04. Dulale de MabnEsIuM... 1. 72... 0,026 CO DORRSSIU ST Le sed tu 0,0+.

A ONE ne 4 ui 0,017.

—- EU OS Se, RE Re (ei 0,0046 AUS et PE PRE 0,0046.

SES EM 0e OT 1 TR 0,0046.

ASTON CRE (ON PRE Le SO 0,01.

ÉArSHIIées Pme, PE er 100 cent. cubes.

dans lequel ne rentre aucune trace de carbone. Tout développement de Champignon est done absolument impossible dans un tel milieu sans carbone.

3° Concentration des acides organiques à expérimenter. — Les acides organiques a étudier sont introduits dans 100 centimètres cubes de ce milieu, à des doses telles, équimoléculaires pour la plupart, que toutes les cultures renferment rigoureusement la

mème quantité de carbone ainsi que la même acidité (1). Ces conditions physico-chimiques sont surtout très importantes à réaliser ici, où, contrairement aux Phanérogames et Algues, leurs solutions sont très concentrées. Cependant je crois être le premier qui, dans de telles recherches, ait appliqué ces règles : les divers auteurs se sont contentés, eu effet, de dissoudre dans leurs milieux de culture poids égaux d'acides. Ceux-ci possédant des poids moléculaires assez différents, 1l en résulte que les quantités de carbone offertes au végétal, les acidités et les forces osmotiques sont très inégales. Il est donc bien téméraire, en procédant ainsi, de comparer entre elles les valeurs nutritives de ces composés organiques.

Pour mieux fixer les idées sur les résultats obtenus, j'ai fait des cultures témoins avec du glucose dont la teneur en carbone était exactement la même que celle des acides.

J'ai déterminé, tout d'abord, par des essais préliminaires, les concentrations acides favorables au développement du Penicillium qu'il ne faut pas dépasser, sous peine de voir intervenir une action par trop toxique. Ces concentrations limites sont le 1/25 des poids moléculaires p. 100, sauf pour l'acide oxalique. J'ai, dès lors, adopté pour la plupart des acides organiques, les 1/25, 1/50€ et 1/100€ de leurs poids moléculaires (P. M.) p. 100, dont voici la représentation en grammes :

1/25° du P.M. 1/50e du P. M. 1/100€ du P. M.

Acide malique........ 5,36 2,68 1,34 —aritriquer-cr 6 3 1,50 RCITTIqUue re 5,60 2,80 4,40 — succinique ...... 4,12 2,36 1,18 LOGIQUE 0 10,08 5,0% 2,92

GIUCOS EEE EEE 5,28 2,64 192

Pour l'acide citrique et le glucose, ces chiffresnecorrespondent pas à ces fractions de leurs poids moléculaires, mais bien à des teneurs égales en carbone, ce qui entraine pour le premier une acidité égale à celle des autres acides (2). Je dirai de suite, pour ne plus y revenir, que l'acide oxalique a été constamment mortel à ces doses pour le Penicillum. À celle de 08,25 mème,

(1) Sauf pour l'acide oxalique, qui d’ailleurs n'a fourni aucune culture.

(1) Sauf pour l'acide oxalique. — Voir au sujet de ces particularités la note 2, page 16.

il ne permet le développement que d’un léger duvet blanchâtre dont le poids sec a atteint 087,03 au bout de trente Jours de végétation.

4° Préparation des milieux de culture renferinant les sels acides elneutres. — Les sels acides et neutres ont été préparés en neutralisant, comme il convient, les mêmes poids d'acides organiques, dissous dans le minimum d’eau redistillée, avec une solution de soude suffisamment concentrée pour que le volume total soit inférieur à 50 centimètres cubes. On parfait ce volume avec de l'eau redistillée et on ajoute 50 centimètres cubes de liquide de Raulin d’une concentration deux fois plus forte que celle du milieu dont j'ai donné la formule. Le sodium a été choisi de préférence, pourlesmotifs suivants : il ne possède, au point de vue nutritif, aucune action et, de plus, ses combinaisons organiques sont toutes très solubles.

5° Récipients employés pour le développement des cultures. — Les milieux de culture, dont le volume est, je le répète, de 100 centimètres cubes, ont été contenus d'abord dans des matras de 750 centimètres cubes, aussi semblablesque possible : la couche liquide avait environ trois centimètres d'épaisseur. Pendant deux ans, les nombreux développements de mon Penicillium se sont parfaitement effectués à 26°; puis, brusquement, les mycélium se sont ensuite immergés. J'ai donc abandonné ces vases et ai adopté Les boîtes de Roux deun litre, dans lesquelles la hauteur du liquide n'était plus que de quelques millimètres et que J'ai placées sur une table du laboratoire, dont la température était de 20-22°, Comme Alfred le Renard, j'ai remarqué que la lumière accélérait la sporulation, tout en lui donnant un ton vert plus vif et augmentait notablement la transpiration.

6° Ensemencement des milieux de culture. — Toutes ces solutions, ainsi préparées, sont ensuite stérilisées à l’autoclave et ensemencées. L'ensemencement, dans ce genre d'expériences comparatives, est, comme chez les Algues, assez délicat, car 1l faut, autant que possible, répartir dans tous les vases, je ne dirai pas un nombre égal de spores, c’est évidemment impossible, mais des quantités aussi peu différentes les unes des autres. Voici comment J'ai opéré : d’une culture sur carotte,

renouvelée aussisouvent qu'il était nécessaire, je prélevais, avec une üse, des spores de Penicillium que je transportais dans un petit matrasrenfermant 50 centimètres cubesde Raulin modifié, glucosé à 1 p. 100 et quelques morceaux de ponce; le tout était stérilisé, au préalable. Le Penicillium se développait donc dans un milieu non acide et quand les spores étaient bien mûres, c’est-à-dire vert foncé, on décantait le liquide et on le remplaçait par de l’eau redistillée. Après plusieurs lavages, toujours aseptiquement faits, onajoutaitenviron 50 centimètres cubes d’eau stérilisée et on agitait le matras énergiquement. Le mycélium, peu épais, facilement désagrégé par la ponce, abandonnait ses spores au liquide. On filtrait ensuite, toujours aseptiquement, dans un petit appareil stérilisé, composé d’un petit matras dont le goulot était obturé par un gros tube effilé entouré de colon. Ce tube bouché à l'ouate contenait, reposant sur sa partie rétrécie, un petit tampon de coton hydrophile très peu tassé. Le tout constituait ainsi un appareil de filtration aseplique, qui laissait passerles spores dans le matras et retenait la presque totalité du mycélium. On était dès lors en possession d’une suspension très riche de spores, de couleur verdâtres dont on prélevait un centimètre cube pour ensemencer chaque liquide de culture.

1° Biécolte du mycélium. — Détermination de son poids sec. — Calcul du rendement pour 100 grammes d'aliment consommé. — Pour récolter le Champignon, on retournait brutalement le vase sur une capsule à fond plat dans laquelle le liquide l’entrainait avec lui. Saisi avec une pince pour le laisser égoutter, on le comprimait dans la main afin d'en extraire la solution nutritive le plus possible. Après trois courtes macérations successives de son mycélium dans l’eau distillée qu’il absorbe comme une éponge et suivies d'expressions, on pouvait le considérer comme suffisamment bien lavé. Les eaux de lavage recueillies et réunies au liquide nutritif de façon à obtenir, au besoin avec de l’eau distillée, un volume total de 150 centimètres cubes, étaient portées à l’ébullition et filtrées soigneusement : ce sera la liqueur A. Le mycélium asséché ensuite entre deux feuilles de papier-filtre était porté et maintenu dans l'étuve à 105° pendant quarante-huit heures, puis enfin pesé.

Connaissant le poids sec et la quantité d'acide consommé, il est facile de calculer le rendement p. 100 d’aliment utilisé.

8° Dosage des acidités totale, fire et volatile des milieux constilués avec les acides libres. — Quand il s'agissait de suivre qualitativement la destruction progressive des acides, afin de récolter le Champignon lorsque ceux-ci étaientcomplètement brûlés, J'ai utilisé, pour les milieux renfermant les acides-alcools, malique, tartrique, citrique, la réaction suffisamment sensible el très simple de Berg et Gerber. Pour l'acide succinique, sur lequel ce réactif n'agit pas, j'ai employé le perchlorure de fer, en liqueur neutre.

Mais quand il fallait déterminer la quantité d’acide organique qui restait dans la culture, à un moment donné du développement du Champignon, j'ai procédé d’une façon différente de celle suivie jusqu'ici et qui consistait à doser l'acidité du milieu tel quel; à l’aide d’une liqueur alcaline titrée. Cette méthode est entachée d'une erreur qui peut atteindre 08T,20 p. 100 en plus et qui tient à ce qu’elle englobe un acide minéral, l'acide nitrique (1), libéré de sa combinaison ammoniacale parle Penicillum glaucum. La présence de cet acide, à l'état libre, est très intéressante : elle a déjà étésignalée à diverses reprises comme probable, mais jamais ses variations dans le cours d'un développement mycélien n’ont été étudiées. Je reviendrai d’ailleurs sur ce point dans un travail ultérieur, car 1l à une importance réelle et à cetitre il mérite d’être examiné de plus près.

On prélève dans la liqueur A précédente, refroidie à la température du laboratoire, 25 centimètres cubes dont on détermine l'acidité que j'appellerai «totale », en présence de la phtaléine, avec une solution normale ou décinormale de soude, selon la plus ou moins grande quantité d'acide existant. Cette solution neutre est mise de côté pour servir au dosage de l’ammoniaque. -

D'autre part, on fait un second et égal prélèvement de la liqueur A que l'on évapore dans une capsule à fond plat, d’abord au bainmarie jusque réduction à 5 centimètres cubes environ et ensuite dans une étuve réglée à 35-40°, où la capsule séjourne aussi

(1) Les autres acides minéraux peuvent également être mis en liberté, en partie, mais ils n’existent dans le milieu Raulin qu'en proportions minimes.

longtemps qu'on ne perçoit plus l'odeur d'acide nitrique. Il n'y à aucun inconvénient à laisser ainsi pendant plusieurs jours les divers acides organiques, sauf l'acide succinique qui, dans ces conditions, est volatil. Ce dernier temps de l'opération est très important à exécuter à cette basse température, car, au bainmarie, l'acide nitrique libre décomposerait une partie de l'acide organique, ou bien celui-ci pourrait déplacer un peu d’acide du nitrate ammoniacal. Et, dans le vide, sa volatilisation ne serait pas suffisamment complète. Le résidu sec, ainsi obtenu, est dissous dans un peu d’eau distillée neutre et son acidité est dosée par acidimétrie : c’estce que je nommerai « acidité fixe », uniquement due (1) à l'acide organique. Il est maintenant facile de rapporter les acidités précédentes au volume total du milieu, en multipliant les résultats trouvés par six.

L'acidité fixe soustraite de l'acidité totale, donnera «l'acidité volatile » attribuée à l'acide nitrique, comme je m'en suis rendu compte et que j'exprimerai en centimètres cubes de solution décinormale de soude. Unesemblable appellation peut ne pas êlre heureuse, mais, si je l’ai adoptée, c'est parce qu’elle contraste avec l'acidité fixe et que, de plus, cet acide est dosé par volatilisation. Jamais, dans les milieux de culture acides et glucosés, il ne s’est formé d'acide oxalique, ni d'acide organique volatil, ni d'azotite. Dans les seuls milieux renfermant les citrates mono et bisodiques j'ai décelé la présence d'acide oxalique.

La quantité totale d'acide nitrique que renferme le liquide de Raulin modifié correspond à 34 centimètres cubes de solution décinormale.

9° Dosage des acides organiques libres et combinés dans les milieux renfermant les sels acides organiques. — La détermination de. l'acidité telle quelle de ces milieux, qu'on ne peut plus dénommer tolale, mais plutôt «apparente », s'effectue par simple dosage acidimétrique. Elle n'a d'ailleurs qu'un intérêt relatif, car elle ne donne aucune indication sur la teneur en acide combiné et, de plus, elle est faussée par la mise en liberté d'acide organique que déplace, de sa combinaison sodique, l'acide nitrique libéré. Néanmoins, elle me permettra de suivre la réac-

(4) Et aussi à quelques traces d'acides phosphorique et sulfurique.

tion des milieux de culture et surtout d'obtenir des solutions neutres afin d'Y doser l'ammoniaque restant. Quant à la connaissance du poids {total d'acide organique libre et combiné, que renferment ces liquides de culture pendant le cours du développement du Penicillium, elle peut se faire au moyen de l'artifice suivant : on déplace entièrement l'acide organique combiné par addition, en léger excès, d'acide nitrique pur ou dilué, en présence d’un orangé 3 Poirier qui ne vire neltement qu’au contact des acides minéraux forts. On se trouve ainsi dans les mêmes conditions que pour le dosage de l'acidité fixe des milieux acides précédents.

Il est impossible; en suivant la méthode décrite plus haut, d'apprécier la teneur en acide nitrique libre, puisque celui-ci ne peut exister à cet étal dans une solution renfermant un sel organique.

10°, Dosage de l’'ammoniaque existant dans les nulieur de culture durant le développement du Penicillium. — F'ai appliqué, pour suivre les variations de l’ammoniaque dans le liquide de culture, le procédé de Ronchèse, devenu classique, qui consiste à ajouter à une solution neutre d’un sel ammoniacal, une solution également neutre de formol : le mélange devient acide par mise en liberté de tout l'acide combiné à l'ammoniaque et formation d’hexaméthylène-amine. De la quantité d'acide que l'on détermine par acidimétrie, en présence de la phtaléine du phénol, on déduit celle de l'ammoniaque. Ce dosage est exécuté dans la liqueur qui à fourni l'acidité apparente, pour les milieux renfermant les sels-acides et dans la liqueur qui à fourni l'acidité totale, pour les milieux acides.

La teneur en ammoniaque de ces milieux, qui ne contiennent aucun acide amidé ou autre corps précipitable par le formol, sera représentée en centimètres cubes de solution décinormale alcaline. Quant à celle du milieu Raulin modifié, de nombreux dosages l'ont fixée à 37e%e,5 pour 100 centimètres cubes.