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est ensemencée sur milieu liquide stérile à base de glucose, de sels minéraux, de peptone et de nitrate de soude, porté à p-H = 6 à 7. Ce milieu est placé dans des boîtes de Roux de 1 à 2 litres, dans des récipients en céramique ou comme en Angleterre dans de simples boîtes à lait en verre Pyrex, le tout maintenu dans des étuves à 24°. Le champignon se développe en surface en aérobiose. Il se forme un voile mycélien épais à partir duquel la pénicilline diffuse dans tout le milieu de culture. On surveille la production de pénicilline en effectuant des dosages périodiques.

Le taux maximum est en général atteint vers le quatrième jour, on sépare alors le mycélium par décantation et on extrait la pénicilline du liquide obtenu.

Etant donné l’encombrement et l'énorme maind'œuvre que nécessite l’étuvage et la manipulation des dizaines de milliers de boîtes, le rendement de cette méthode reste faible.

Culture en profondeur. — Les Américains ont isolé de nouvelles souches de pénicillium susceptibles de se développer en profondeur, ce qui accroit notablement la production.

On utilise dans ce procédé un milieu de culture fait essentiellement de carbone et de « Corn-Steep » qui résulte de la concentration des liqueurs du trempage du mais obtenues au cours de la fabrication de l’amidon.

On ensemence tout d’abord avec la spore un milieu de culture à base de gélose glucosée, quand la culture est développée on la verse dans le milieu précipité qui favorise la sporulation. Un fermentateur est ainsi ensemencé. Ce fermentateur est un cylindre étanche dont le contenu peut être agité et dans lequel on fait barboter

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un violent courant d'air. Il est maintenu à une température de 24°.

Le contenu de ce premier fermentateur est ensuite versé stérilement dans un second dont le rôle est d’assurer un développement du mycélium plus important. Après 48 heures on a obtenu l’ « inoculum » et on passe à la fermentation proprement dite. L'’inoculum est transvasé dans des fermentateurs plus grandi (45.000 litres) comprenant des agitateurs intérieurs. C'est là que va se fabriquer la pénicilline à la faveur d'un courant d'air qui assure l’aération de la masse liquide.

Toutes ces opérations nécessitent un contrôle constant de la stérilité afin d’éviter la destruction de Ja pénicilline par les diastases des micro-organismes.

Le liquide, après passage sur des filtres-presses qui en séparent le mycélium, est dirigé dans des réservoirs de stockage. On le reprend dans une opération .ultérieure pour procéder à l’extraction de la pénicilline.

Extraction - Purification. — Les jus obtenus sont refroidis à basse température. On les acidifie à l’aide d’acide sulfurique ou phosphorique jusqu’à pH = 2. La pénicilline est libérée de ses sels alcalins par l’acétate d’amyle. Puis la solution amylique est épuisée à l’aide d’une solution diluée de phosphates alcalins. Le produit obtenu contient encore de nombreuses impuretés qu'il ‘est nécessaire d'éliminer; on le purifie donc par passages successifs en milieux organiques et en milieux aqueux. Le produit est ensuite neutralisé avec la soude. On congèle la solution à - 40° puis on évapore dans le vide à cette température. Cette opération est d’une importance capitale car la pénicilline est d’autant plus stable qu’elle contient moins d’eau,

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On obtient ainsi le sel de sodium de la pénicilline, poudre jaune-brun, très hygroscopique qui est la pénicilline ordinaire, composée, comme nous le verrons pius loin, d’un mélange en proportions variables de 4 pénicillines F, G, X, K. A l'heure actuelle comme on a reconnu un® supériorité thérapeutique à la pénicilline G on l'extrait, à l’état pur, du mélange par une suite de précipitations et de cristallisations fractionnées.

Ainsi préparée, la pénicilline, avant d’être livrée dans le commerce, est soumise à un contrôle de son activité antibactérienne et de sa toxicité. C’est le titrage

et ls contrôle physiologique.

TITRAGE. —- Comme il n’y a pas de réaction chimique spécifique de la pénicilline, les différentes méthodes de titrage sont essentiellement biologiques. Elles consistent, d’une manière générale, à mesurer l’action inhibitrice de la pénicilline sur une souche microbienne donnée.

La plupart des méthodes utilisent une culture de staphylocoque doré (souche d'Oxford).

Les savants d'Oxford ont préconisé là méthode des dilutions: on ensemence chacun des tubes avec O,I d’une dilution au centième de la culture. La pénicilline est diluée dans une série de tubes ainsi ensemencés. Son titre est donné par le dernier échantillon dans lequel on n'observe aucun développement microbien. On compare ensuite avec une gamme de pénicilline étalon.

Heatley a employé le procédé des zones d’inhibition basé sur l’évolution et la vitesse de diffusion de ta pénicilline dans un milieu solide (gélose) ensemencé avec la souche standard de staphylocoque d'Oxford. La pénicilline est placée dans de courts tubes de verre posés

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sur le milieu ensemencé, elle diffuse et inhibe la culture dans un cercle périphérique dont on mesure le rayon.

Cette méthode a été simplifiée. Certains ont taillé à l'emporte-pièce, dans la gélose, des cavités qu'ils remplissent de solution de pénicilline. D’autres placent sur le milieu un papier filtre circulaire qu’ils imbibent de pénicilline.

Ces deux techniques ont permis de préciser la notion d'unité. L'unite Oxford correspond à la quantité minima de pénicilline qui, diluée dans 50 cc. de bouillon de viande, inhibe la culture du staphylocoque d'Oxford, elle équivaut à 1/1660 milligramme du sel de sodium pur de pénicilline conservé à Washington par la Fédéral Food And Drug Administration.

L'unité Heatley est par définition la quantité de pénicilline qui provoque une zone d’inhibition de 22 millimètres de diamètre environ après un passage de 12 à 18 heures à l’étuve à 37°. Ces deux unités sont

sensiblement égales.

D’autres méthodes qui n’utilisent plus les cultures de staphylocoque ont été utilisées. Heilman détermine le taux de substance pénicillinée empêchant la pousse des cultures cellulaires. Turner et Heath mettant à profit l’inhibition de l’uréase par la pénicilline mesurent les différences dans la quantité d'ammoniaque libérée de l’urée par des solutions contenant de l’uréase et par d’autres solutions contenant de l’uréase et de la pénicilline. Levaditi et Perault mesurent la cosommation d'oxygène des microbes à l’appareil de Warburg; cette consommation est variable suivant que le développement des germes est plus ou moins inhibé par la solution de pénicilline. Prévot a mis au point une méthode de titrage par inhibition de Welchia perfrengens qui a le pouvoir

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de réduire le vert janus, puis avec l’aide de Peyre et Digeon il utilisa le clostridium butyricum plus stable que le précédent. De leur côté Sanchez et Lamensans utilisent l’inhibition du développement du Lactobacillus bulgaricus.

Comme nous le signalions plus haut ces différentes méthodes ont permis la création d’une unité biologique. Cependant les résultats sont souvent entachés d'erreurs ; aussi une conférence réunie à Londres a-t-elle choisi un étalon correspondant à une pénicilline parfaitement . étudiée. C’est l'unité internationale (U. I.) qui correspond à l’activité déployée par 0,6 microgramme de sel de sodium de pénicillins G. Ces métodes permettent un contrôle in vitro assez précis de son activité, mais avant son emploi la pénicilline doit encore être éprouvée in vivo. ;

CONTROLE PHYSIOLOGIQUE. — Il s'effectue tout d’abord sur la souris infectée par le staphylocoque. On vérifie ainsi son activité. Pour contrôler sa toxicité on injecte à la souris blanche un échantillon de pénicilline à la dose de 100 U.O. par gramme. Il ne doit en résulter aucun trouble.

Cependant la toxicité de la pénicilline étant due dans la majorité des cas à des substances pyretogènes qui ont échappé à la purification, on injecte, pour déceler leur présence, dans la veine marginale de l'oreille d’un lapin dont on a vérifié la stabilité thermique, l’échantillon de pénicilline. On prend la température un quart d'heure après, puis toutes les deux heures. Si la température augmente de 0° 6 et plus, la pénicilline est considérée pyretogène.

Après avoir subi ces diverses épreuves l’antibiotique est utilisable en thérapeutique.