Ê — TECHNIQUE

A. — Pour apprécier l’action des substances phosphorescentes sur la fermentation lactique, le sulfure de calcium phosphorescent fut choisi, qui, même à la lumière diffuse du jour, s’insole suffisamment pour devenir très phosphorescent à l’obscurité.

a. Pour les premières expériences, on recouvrait la paroi des flacons, où du lait était mis à fermenter, d’un vernis contenant du sulfure de calcium phosphorescent. On comparait les laits entourés de sulfure de calcium à des laits placés dans des tubes de mème calibre, mais non phosphorescents. Mais, comme les conditions de rayonnement et par conséquent de température n'’élaient pas tout à fait les mêmes, cette méthode fut abandonnée.

b. Plus tard, le sulfure de calcium fut disséminé sur de l’ouate qu'on introduisait dans des ballons de 100 cc. que l'on bouchait pour éviter tout dégagement de vapeurs. Les flacons étaient placés dans des verres de 250 cc. contenant 50 ce. de lait. Comparativement, d’autres ballons contenant de l'ouate sans sulfure de calcium étaient placés en nombre égal dans un même nombre de vases contenant aussi 50 cc. du même lait.

ce. Afin, de pouvoir donner, tout en réduisant la quantité de lait employé, une plus grande surface de contact entre le sulfure de calcium et le liquide, les ballons ont été remplacés par des tubes de verre, cylindriques, de 20 millim. de diamètre, sur 25 cm. de longueur, dont l'extrémité supérieure, très effilée, était fermée à la lampe. D'autres tubes identiques, mais ne contenant que de l’ouate sans sulfure, furent pris comparativement comme témoins. Les uns et les autres tubes scellés, phosphorescents et non phosphorescents, étaient plongés dans d’autres tubes cylindriques, contenant le lait. Le diamètre de ces derniers tubes était légèrement plus grand, de sorte qu'il permettait à peine l'introduction des tubes scellés dans leur intérieur. Le lait s'élevait donc en couche très mince entre le tube intérieur scellé et le tube extérieur et recevait ainsi l’action d’un très grand nombre de rayons phosphorescents et autres. D'autre part, la comparaison entre les différents laits était légitime, puisque la seule différence entre ces laits, ensemencés de la même manière et soumis à la même température, consistait en ce que les uns étaient en contact avec des tubes de verre et l'ouate simple, les autres avec des tubes de verre et de l’ouate où du sulfure de calcium phosphorescent était disséminé.

d. Ajoutons que, sur le conseil de M. Hawrior, de la paraffine fut employée dans laquelle du sulfure de calcium fut mélangé. Des tubes étaientrecouverts, les uns de paraffine simple, les autres de paraffine rendue phosphorescente

par le sulfure de calcium. Toutes ces méthodes ont conduit à des résultats identiques, qui seront mentionnés au cours de ce travail.

B. — Le mode d'emploi du lait mis à fermenter a nécessité aussi bien des modifications. Il est tant de facteurs qui agissent sur la fermentation lactique que, pour arriver à des résultats précis, il a fallu contrèler successivement les influences multiples qui peuvent fausser les faits ou conduire à des conclusions erronées. C’est en procédant par élimination que des contradictions apparentes ont pu être expliquées et réfutées. Aussi faut-il insister sur cette partie fondamentale de notre technique.

Au cours de nos recherches, nous avons été amenés à nous servir tantôt de lait ordinaire, tantôt de lait ou petitlait stérilisé et ensemencé avec du ferment lactique pur.

a. Le lait ordinaire non stérilisé contient toujours des germes et des ferments. Mais pour le but qu'on se propose, la pureté du ferment lactique n’est pas indispensable, car dans une masse de lait de même provenance, bien mélangée, toutes les parties sont homogènes et, pour un même volume, contiennent les mêmes qualités de germes, quel qu’en soit le nombre.

b. Cependant, si l’on veut pouvoir comparer entre elles les expériences effectuées à des jours différents avec des laits évidemment différents, il est plus rationnel de se servir de lait stérilisé et d’ensemencer avec un ferment pur ce lait stérilisé.

La stérilisation du lait ne doit pas être faite à une trop haute température; car, si l’on dépasse 108, quoique ce lait reste parfaitement blanc, dans le virage par la phtaléine avec la potasse, il prend une teinte légèrement ambrée qui gêne quelque peu la précision du dosage. D'ailleurs, si la stérilisation à 408 n’est pas absolue pour conserver des laits intacts pendant plusieurs mois, elle est absolument suffisante pour quelques heures, surtout parce qu’on introduit ensuite

dans la liqueur une telle quantité de germes vivants, qui se mettent aussitôt à proliférer, que la persistance de quelques rares germes, atténués et lents à évoluer, est sans aucune influence.

Pour la même raison, les laits stérilisés n'étaient pas recouverts d'ouate; car, si l’on permet ainsi l’abord de quelques germes de l'air, l'inconvénient est moindre que celui d'avoir des lampons d’ouate qui deviennent humides, altèrent la rigueur du dosage, même si l’on recourt à des petites manœuvres d'expression qui entraînent toujours la perte de quelques gouttes de lait. En somme, les germes qui tombent dans les laits ainsi stérilisés et placés tout de suite dans l’étuve sont en proportions infimes et négligeables par rapport aux germes qu'on introduit en ensemençant la liqueur.

c. Enfin dans les derniers temps, nous nous sommes servis exclusivement de petit-lait obtenu par l’addition de quelques gouttes de présure à du lait porté à une température de 45°. Le petit-lait ainsi obtenu était filtré, puis porté à 110° à l’autoclave. Il était un milieu incomparablement moins nutritif que le lait, mais il avait l’avantage de permettre des dosages plus faciles, et, si les différences étaient moins considérables, elles étaient plus précises.

d. L'ensemencement à été fait avec un ferment lactique très actif, obligeamment adressé par M. Mercunmiorr. Ce ferment était ensemencé, la veille, dans un mélange à parties égales de lait et d’eau distillée. On portait le tout à l’étuve etle ferment poussait ainsi à une température que nous avons variée au cours de notre travail. La température la meilleure pour nos expériences a été reconnue se trouver aux environs de 42°.

Au bout de 12 heures, le liquide décanté et grossièrement filtré était mélangé dans des proportions variables au lait stérilisé.

La quantité de semence par rapport au lait employé à été l’objet de longues hésitations et de tâtonnements minu-

üeux. En réalité elle dépend de sa nature et des conditions de culture du lait lui-même.

Si, avant de s’en servir, on dilue la semence dans son poids égal d'eau distillée, comme nous l’avons fait, il est évident que la quantité employée devra être double.

De même, suivant sa puissance de prolifération et suivant qu'on l'aura affaibli ou excité par des manœuvres particulières, on devra en employer plus où moins. Enfin, puisque le milieu, lait ou petit-lait, dans lequel elle est cultivée est plus ou moins nutritif, il en faudra une quantité plus ou moins grande, au moment de l’ensemencement.

En réalité, en employant ! volume de semence pure et filtrée sur papier Chardin, pour 2 volumes de lait stérilisé, on se place dans les conditions les plus favorables pour apprécier des différences dans la fermentation des laits soumis à l'examen.

Mais plus encore que sa quantité, la nature de la semence joue un rôle considérable pour l'appréciation des modifications exercées par le sulfure de calcium phosphorescent. On peut dire que d’elle dépend le succès de l'expérience. En effet, comme l’action qu'exerce le sulfure de calcium sur la fermentation lactique est relativement faible, si le ferment est doué d’une résistance trop active, l'influence qu'il subit de la part du sulfure de calcium échappe à tout examen ou est complètement différente de celle qu'il éprouve quand, au contraire, il est malade. Nous nous étendrons, plus loin, sur l'importance de cette donnée vis-à-vis de la valeur des résultats obtenus; pour le moment, nous devons seulement indiquer par quelles manœuvres on agit sur la vitalité du ferment.

Il faut, en effet, atténuer sa virulence et le rendre malade pour lui permettre de se laisser influencer par l’action du sulfure de calcium. Pour cela, il faut le chauffer pendant une certaine durée et à une certaine température que des tâtonnements multiples ont permis de préciser. La semence

liltrée grossièrement est portée dans un bain-marie de volume égal (2 litres) et de température constante (100°). Elle est maintenue jusqu'à ce que sa température, mesurée avec un thermomètre très sensible, marque 50°. À partir de ce moment, on note le temps, eton laisse la température s’élever de 57 à 59° pendant une durée qui ne doit pas excéder 90". Immédiatement après, on refroidit la semence ainsi chauflée. Pendant toute cette série de manœuvres, on doit agiter constamment le ballon, pour que toutes les parties du liquide qu'il renferme soient également atteintes par le chauffage ou le refroidissement. C’est de l'homogénéité de toutes ces parties que dépend la valeur des différences observées dans les dosages.

e. La nature et la quantité de la semence étant ainsi définitivement établies, on procède à la répartition du lait ensemencé dans les tubes cylindriques extérieurs dont nous avons déjà parlé plus haut. Chaque tube recoit ainsi 30 cc. du liquide mesuré dans une burette graduée en dixièmes de centimètre cube, puis tous sont divisés en 2 lots d’un nombre égal. Dans le premier lot, on introduit les tubes avec sulfure de calcium, précédemment insolés et phosphorescents, dans le second les témoins contenant de l’ouate pure; cette division en 2 lots se fait quand le remplissage des tubes est terminé, et elle se fait au hasard, pour éviter toute cause d'erreur systématique.

/. Ces préparatifs terminés, on porte le tout à l’étuve en notant la température de cette étuve et l'heure à laquelle elle reçoit les laits ensemencés.

De toutes les conditions qui agissent sur la fermentation lactique, une des plus importantes encore est celle de la température de l'étuve, dans laquelle elle se développe. Il y a une nécessité absolue à faire fermenter tous les laits sur lesquels on opère à une température aussi constante que possible. La difficulté ne serait pas grande, si, pour faire, plus tard, les dosages, il n’était pas besoin d'ouvrir à maintes

reprises la porte de l’étuve, ce qui introduit dans l’étuve, si bien réglée qu'elle soit par avance, une grande quantité d'air froid. Alors en effet les différents tubes mis à fermenter, selon qu'ils sont placés à tel ou tel endroit de l’étuve, sont plus ou moins refroidis, ce qui entraîne des différences non négligeables dans la température de ces différents liquides. Pour y remédier, sinon complètement, du moins en partie, on place les laits qui fermentent dans des consérves remplies d’eau, et chacune de ces conserves est elle-même plongée dans de l’eau contenue dans un très vaste cristallisoir. C’est la température de l’eau de ce cristallisoir qui indique la vraie température à laquelle le lait a fermenté, car avec les autres moyens d'appréciation thermique, on n’a que des renseignements très imparfaits. La température de l'air de l’étuve et surtout la température d’un liquide contenu dans un flacon fermé, à laquelle on recourt ordinairement, ne donnent ici que des chiffres faux, par suite soit du refroidissement de l'air, soit, selon les cas, du refroidissement des liquides par évaporation. On évitera l’évaporation trop rapide de l’eau du cristallisoir et des conserves en la faisant surnager d’une petite couche d'huile.

Encore faudra-t-il, quand il s’agit d’un dosage comparatif, ne prendre, pour les comparer entre eux, que les laits placés dans la même conserve et par conséquent soumis à la même température très exactement; les deux masses d’eau, celle du cristallisoir et celle de la conserve, ayant pour effet d’amortir les oscillations thermiques du milieu, conséquence nécessaire des fréquentes ouvertures de l’étuve. Évidemment aussi, les tubes doivent être presque complètement immergés dans l’eau.

Malgré toutes ces précautions, on n'arrive Jamais à avoir un niveau thermique absolument constant. Mais au moins les laits dont on fait le dosage sont-ils toujours, à très faibles variations près, comparables entre eux, au point de vue thermique.

C. — Le dosage lui-même peut commencer à être partiellement effectué au bout de deux heures d’étuve dans les conditions ordinaires précédemment indiquées. On le poursuit d'heure en heure, mais il appartient à l'opérateur d’allonger ou de diminuer cet intervalle suivant les résultats obtenus.

a. La liqueur servant au titrage ne doit être nitrop concentrée, ni trop diluée. Avec une solution de KOH à 1 gramme p.100, on peut être à peu près sûr d’un dixième de centimètre cube, ce qui représente un milligramme de KOH. La potasse doit être autant que possible mise à l’abri de l'air, car le passage au rose devient moins facile à saisir quand il y a des carbonates alcalins. Donc, au lieu de la verser directement dans la burette graduée, on devra l’y faire passer par une poire en caoutchouc qui comprime l’air du récipient où est contenue la solution de potasse.

b. Avant de pratiquer le dosage, les laits fermentés recevront chacun la même quantité, et plutôt en grand excès, de phénophtaléine, soit pour 50 ec. de lait, environ 4 cc. d’une solution alcoolique à 5 p. 100.

c. Par suite des phénomènes de dissociation propres à tous les sels organiques (des lactates et des butyrates notamment), le passage au rose n’est pas instantané, et il y a, depuis le moment où apparaît une légère teinte, jusqu'au moment où la teinte apparaît nettement rose, une phase de transition, qui, suivant la quantité des acides libres, est de 0,1 ou 0,2, ou même 0,4 et 0,5 de la solution potassique pour 50 ce. de lait.

Il à paru avantageux de prendre la moyenne de deux chiffres : le premier, c'est le moment où la teinte rose apparaît, assez nettement pour qu'on ne doute pas de la coloration quand on regarde de près; et le second, c’est quand la teinte est tellement franche qu’on peut la voir de loin et qu'il n’y a plus d'hésitation, même pour un témoin placé à distance. Cet écart est suivant les cas (avec 50 cc. de liqueur à doser) de 1 à 5 dixièmes de centimètre cube.

d. Le lait doit être dosé avant sa coagulation. Une fois coagulé, il est en grumeaux qui sont difficilement désagrégés par l'agitation. Toutefois, quand la coagulation est encore récente, et que la caséine ne s’est pas séparée en gros flocons. de sérum lacté, le dosage peut être encore très exact. Mais, avec les laits coagulés depuis quelques heures, le chiffre qu'on trouve dépend en bonne partie de l'agitation à laquelle on soumet le liquide. Parfois même, au bout de cinq à dix minutes d’agitation, l'équilibre n’est pas encore obtenu. On peut donc, en agitant plus ou moins, trouver le chiffre qu’on veut, ce qui est impossible avec du lait non coagulé, ou coagulé depuis quelques instants.

e. Il ne faut pas savoir sur quelle liqueur on opère, car on est alors, dans le titrage, tenté de se conformer à telle ou telle opinion préconçue, ou de lutter contre elle, ce qui est également mauvais pour une analyse rigoureuse. Pour éviter cet inconvénient, il faut opérer avec le secours d’un aide qui a repéré les laits que l'opérateur titre sans que celui-ci puisse alors savoir s’il a devant lui ceux qui ont été soumis ou non à l'influence du sulfure de calcium.

/. Quand on fait plusieurs dosages comparatifs, il faut les faire rapidement, car, à un certain niveau de fermentation, les progrès en acidité sont assez rapides pour qu'on trouve des changements notables à quelques minutes d'intervalle.

Il. — ACTION DU SULFURE DE CALCIUM SUR LA FERMENTATION LACTIQUE

Les détails préliminaires de technique étant exposés, on doit se demander, avant de rapporter les résultats obtenus, si ces résultats peuvent être acceptés; en d’autres termes, la méthode exposée précédemment est-elle recevable ? Et tout d’abord, on peut admettre comme postulatum que l'activité du lait, mesurée par la potasse, donnera la mesure

de l'activité du ferment lactique. Il n’est pas utile, pour le moment, d'entrer dans une discussion sur la nature même de cette action. Est-ce sur la transformation du lactose en acide lactique? Est-ce sur la croissance du ferment lactique? Peu importe quant à présent. Il s’agit seulement de prouver que le sulfure de calcium phosphorescent exerce une action sur l'acidité du lait fermenté et par conséquent sur la fermentation lactique. On doit aussi, avant tout exposé de chiffres, juger une fois pour toutes de la valeur qu'on peut leur accorder, autrement dit : les différences observées, même lorsqu’elles sont minimes, sont-elles le fruit de circonstances toutes fortuites? La méthode est-elle précise?

L'expérience le prouve surabondamment.

Ainsi, dans un cas, cinq flacons de lait contenant chacun 50 cc. ont donné, après trois heures de fermentation à 40°, les chiffres suivants de neutralisation par la potasse. (Tous nos chiffres se rapportent toujours à une solution de potasse dlip: 400)