PRÉPARATION
Milieux artificiels
Pour la clarté de l'exposition, il est commode de distinguer les milieux animaux, les milieux végétaux et les milieux à composition chimique définie.
Milieux animaux. — Le plus important, de AR est le bouillon peptoné salé, généralement appelé « bouillon » purement et simplement ; il est journellement employé dans tous les laboratoires.
Bouillon peptoné salé (bouillon ordinaire). — On le prépare habituellement de la manière suivante :
a. Prendre 500 grammes de viande, débarrassée des os, tendons, aponévroses et de la graisse. Hacher finement, à l’aide du hachoir ou d’un hache-viande.
b. Mélanger avec 1 000 grammes d’eau. Laisser macérer à froid (glacière en été) pendant douze heures. — Si l’on est pressé, faire macérer à chaud (50° à 550), une demi-heure.
c. Porter ensuite sur Le feu. Amener lentement à l’ébullition et faire bouillir à feu doux pendant dix minutes, en agitant constamment. Cette opération a pour but de coaguler les albuminoïdes.
d. Verser le mélange sur un linge propre, blanc ; exprimer fortement et recueillir le liquide dans une marmite émaillée.
e. Ajouter, pour 1000 grammes :
1 darts eue se sde 20 grammes.
Pniottre de SOdIUM.: 12. 2.000 5 —
Faire dissoudre à feu doux en agitant constamment.
On recommande souvent d'ajouter également 1 gramme de phosphate de soude.
f. Passer sur filtre Chardin mouillé (pour arrêter les graisses), sur un entonnoir en verre.
g. Alcaliniser légèrement. Pour cela, verser petit à petit une solu”
tion de soude pure au dixième, en vérifiant sans cesse la réaction au papier de tournesol. Quand les deux papiers rouge et bleu ne virent plus, ajouter encore un peu de soude, de manière à obtenir une réaction légèrement alcaline. — L’alcalinisation est le temps le plus délicat. Ne pas la confier aux aides, à moins qu'ils ne soient très exercés.
On peut employer, au lieu de soude, le carbonate de soude.
h. Porter à l’autoclave, en boîte à lait (sinon en ballon ou matras); chauffer à 1170 pendant quinze minutes.
Ce premier chauffage précipite les phosphates terreux, qui troublent le milieu. Couvrir le récipient pour le chauffage.
i. Au sortir de l’autoclave, filtrer à nouveau sur papier Chardin. Recueillir dans des ballons ou vases à précipiter.
Ramener à 1000 centimètres cubes par addition d’eau distillée.
j. Répartir en tubes ou ballons, boucher, stériliser.
k. La stérilisation sera faite à 1450 pendant vingt minutes. Prendre garde de ne pas dépasser la température atteinte pendant le temps b, sans quoi le bouillon se troublerait à nouveau.
Le milieu obtenu doit être clair, jaune brunâtre.
Bouillons de cheval, de veau, de poule, etc. — Ils se préparent exactement de la même manière que le précédent, en substituant à la viande de bœuf respectivement les viandes de cheval, de veau ou de poule.
Le bouillon de cheval est souvent utilisé parce que la viande de cheval coûte généralement moins cher que toute autre. Ce bouillon est plus riche que les autres en sucre; si on veut l'utiliser pour préparation des milieux sucrés, il faut le désucrer au préalable (Voy. plus loin, Bouillon Martin).
Bouillons de viscères. — Ils sont fabriqués comme le bouillon ordinaire, en substituant à la viande des viscères hachés: foie, rate, muqueuse intestinale, ete. ; ces bouillons demeurent presque toujours opalescents.
Bouillon aux extraits de viande. — Très employé à l'étranger il a l’avantage d’être rapidement prêt, mais sa valeur nutritive est généralement moindre que celle du bouillon ordinaire; sa teneur en sel est parfois assez élevée (il est toujours facile de s’en assurer). L’extrait Liebig est le plus utilisé.
Peser à grammes d'extrait, faire dissoudre à chaud dans 1 litre d’eau. Vérifier la réaction, alcaliniser si besoin. Chauffer cinq minutes à 4470. Passer à chaud sur filtre épais mouillé. Répartir et stériliser à 1150,
Il est bon d'ajouter, au premier temps, peptone et sel marin.
Toutes les substances animales se prêtent à la fabrication des bouillons, sur les mêmes bases que ci-dessus : poissons, moules, etc. Usage restreint.
Bouïillons sucrés. — Ajouter au bouillon ordinaire 2 p. 100 de sucre : glucose, lactose, dulcite, mannite, etc.
L’addition pourra être faite pendant la fabrication des bouillons, au temps ?, ou bien on ajoutera le sucre au bouillon tout préparé.
Pour des recherches précises, il faut d’abord faire disparaître les sucres normalement contenus dans la viande. On peut se contenter de laisser la viande à macérer à 370 (au lieu de faire macérer à froid), ou bien ensemencer le filtrat d'une culture de colibacilles typiques et mettre quelques heures à l’étuve.
Bouillon glycériné. — Préparer comme les précédents, en substituant aux sucres 6 p. 100 de glycérine neutre.
Bouillons sucrés carbonatés. — Répartir en tubes le bouillon s'icré;, ajouter à chaque tube une pincée de carbonate de chaux. Boucher et stériliser.
On emploie surtout les bouillons carbonatés, lactosé et glucosé.
Eau peptonée. — Pour 1000 grammes d’eau, ajouter :
DE Pt ORNE NT RO 10 grammes.
Sel marin 5 —
d'en eo tete entr anelts le em ae ile je, eve + e: © ,6, ©. +
On emploie généralement les peptones Chapoteaut ou Defresne.
Faire dissoudre à feu doux, en agitant. Porter à l’ébullition.
Répartir et stériliser à l'autoclave. |
L’alcalinisation est en général inutile, le milieu étant un peu alcalin, mais il est toujours prudent de vérifier.
Voyez, pour d’autres solutions peptonées, Vibrion cholérique, Colibacille et Bacille typhique.
Bouillon Martin. — Primitivement destiné à l'obtention de la toxine du bacille diphtérique, il est aujourd'hui couramment employé pour un grand nombre d’autres germes, spécialement en vue d'étudier les toxines.
On prépare d’abord une solution de peptone et une macération de viande.
Préparation de la solution de peptone. — 1° Prendre cinq estomacs de porcs, laver, hacher finement muqueuse et musculeuse ;
29 Faire le mélange suivant:
Estomac de porc haché....... .... 200 grammes. LL, FLAN PERS EE A EEE 10 centimètres cubes.
ni Ale 1 000 — —
Il n'y à aucun inconvénient à ajouter de la viande, ou des fragments de viscères; la valeur nutritive est plus grande.
39 Placer douze à vingt-quatre heures à 500. La pepsine (provenant de la muqueuse stomacale) digère plus activement à cette température.
49 Chauffer à 1000 (pour détruire la pepsine). Passer sur tamis ou sur coton hydrophile.
50 Alcaliniser à 809 environ ; filtrer sur papier-filtre.
Préparation de la macération de viande. — 1° Hacher 500 grammes de viande, mélanger à 1 litre d’eau.
29 Chauffer à 370 et maintenir vingt heures à l’étuve à 37°.
À 379, la viande fermente légèrement, et les sucres sont détruits :: le bouillon est désucré.
30 Exprimer, recueillir le liquide.
40 Ajouter 5 grammes de sel marin.
Mélange. — 1° Mélanger à parties égales la solution de peptone et la macération de viande, préparée comme il vient d’être dit. Chauffer à 700.
29 Filtrer sur papier Chardin. Neutraliser exactement, à la soude.
30 Le liquide étant neutre au tournesol, a'outer, par litre, 7 centimètres cubes de solution normale de soude (à 40 p. 1000).
49 Porter à l’autoclave à 117° pendant quinze minutes. Filtrer au sortir de l’autoclave.
59 Répartir, stériliser à 1150.
Il est parfois préférable de stériliser par filtration sur bougie après le temps 3.
Macération de viande. — Rarement employée aujourd'hui.
Faire macérer à froid, pendant douze heures, 500 grammes de viande dans 1 litre d'eau. Exprimer, filtrer sur papier-filtre épais.
Ajouter 0,5 p. 100 de sel marin. Chauffer doucement à 600. Stériliser par filtration.
Milieux végétaux. — Ils sont peu utilisés, leurs qualités nutritives étant généralement assez faibles. Principales préparations :
Infusion dé foin et de paille. — Hacher 15 à 20 grammes de foin ou de paille, laisser macérer deux heures dans 1 litre d’eau. Faire bouillir quelques minutes. Filtrer. Répartir. Stériliser.
Infusion de pommes de terre oude carottes. — Râper pommes de terre ou carottes. Faire macérer 10 à 20 grammes de pulpe dans 500 grammes d’eau, pendant deux heures. Exprimer sur un linge. Faire bouillir. Filtrer sur papier. Répartir. Stériliser à l’autoclave.
Eau de malt. — À 100 grammes d’eau, ajouter 10 grammes d'orge germée, préalablement broyée. Chauffer une heure à 550-589; la diastase transforme l'amidon en maltose (ne pas dépasser 58°, pour ne pas détruire la diastase). Faire bouillir quelques minutes. Filtrer. Répartir. Stériliser à l’autoclave.
Infusions de touraillons. — À 100 grammes d’eau, ajouter
5 grammes de touraillons (plantule d'orge germée). Le reste de la préparation, comme pour l’eau de malt.
Eau de levure. — Délayer lalevure dans dix fois son poids d’eau. Faire bouillir en agitant. Filtrer, répartir et stériliser.
Bouillon de haricots. — Incorporer à 1 litre d’eau 50 à 60 grammes de haricots blancs. Faire macérer quelques heures. Porter à l’ébullition, maintenir pendant trente minutes. Passer sur tamis. Ajouter 2 p. 100 de saccharose, 1 p. 100 de sel marin et un peu (traces\ de bicarbonate de soude. Filtrer. Répartir. Stériliser.
Milieux chimiquement définis. — Les milieux d'usage courant, issus de la viande, des végétaux, des produits organiques ont une constitution complexe : leur formule chimique est ignorée. Dans le but d'étudier de plus près la biologie des microbes, il peut être utile de posséder des milieux de culture de composition chimique définie ; les modifications survenues dans ces milieux, à la suite du développement des germes, seraient alors plus facilement appréciables. Malheureusement, la plupart des milieux de cet ordre conviennent surtout aux champignons, fort peu aux microbes ; aussi leur usage en bactériologie est-il actuellement fort restreint. Quelques-uns d’entre eux seulement se prêtent au développement de plusieurs espèces microbiennes ; c’est à ces derniers que nous nous limiterons, en y ajoutant quelques milieux d'un intérêt historique.
Leur préparation, une fois la formule connue, ne demande qu’une chose : respecter la formule.
Liquide de Pasteur.
RE es eee dis em de elle 2 C 400 grammes.
CRÉES SP NE de et es das 10 — hate d'aMMOonIaqUue,.e 20. M. : 08r,10 Gendres de levure.,,.......:.... Mreues Oer,075
Liquide de Cohn.
PAROI LÉO ES RE PL ET, 100 grammes.
Phosphate de potasse..... 10 ET Re este 081,50 Phosphate tricalcique.......... ue 08r,05 puliate de magnésie....,..,1... rer 0er, 05
Après dissolution, ajouter :
Tartrate d’ammoniaque........... a 1 gramme.
Liquide d'Ouchinsky.
] DE 1 DORE TER À AA EEE MIO LAN 1000 grammes. PRIT OR a Or ire 30 à 40 —
Chlorure de sodium........... : STATE
Chlorure "dé 'CcalCiUIn TR Re Oer,1
Sulfate Lie mag nesie PAPERS Osr,02 à 08r,4 Phosphate bipotassique. "mire 2 gr:(à1261,5 Lactate d'ammoniaques ve" "Ferre 6 à 7 grammes. ASDPAPA SIN ER RENE 3 à # —
Liquide de Frænkel et Voges.
Lactate d'AMmMONIAQUE" 76 ETES 6 grammes.
Ghiorure dé sodium RER TRES ne 5 — ASDATAPIRE MN Ce te CR Al ER 4 — Phosphate neutre de soude...7........ 2 — Fau-distilléé issues DOTE OR 1000 —
Milieux naturels.
Lait. — Il est très employé. Il se prépare habituellement de la manière suivante :
19 Prendre 500 grammes de lait ; vérifier la réaction qui doit être neutre ou légèrement alcaline.
Le lait du commerce est souvent plus ou moins acide, par suite de la pullulation de bactéries dédoublant le lactose, très répandues dans la nature. Un lait acide est inutilisable, parce que les altérations produites par ces bactéries peuvent gêner le développement ultérieur des autres microbes.
20 Répartir en tubes de 8 à 15 centimètres cubes. 30 Boucher, stériliser à l’autoclave.
Maintenir les tubes stérilisés pendant quarante-huit heures à l’étuve; la stérilisation habituelle (quinze minutes à 1150) est parfois insuffisante, et un chauffage plus énergique altérerait sensiblement le milieu. La nonstérilité serait démontrée par la coagulation des tubes non stériles.
Pour certains microbes délicats, on peut avoir intérêt à ne pas chauffer à 1159, ni même à 1000. On stérilisera alors par chauffage discontinu à 58°, comme pour le sérum, mais ce procédé de stérilisation n’est pas bien sûr pour le lait. En dehors du chauffage à 4159, la stérilisation ne serait bien assurée que par le chauffage discontinu à 1000.
On recommande souvent aussi de prélever le lait aseptiquement, de manière à pouvoir l'employer cru et stérile, sans qu'il soit besoin d’une stérilisation ultérieure. Il est prudent de n’accorder à cette méthode qu’un crédit limité; la traite véritablement aseptique n’est guère réalisable, même en faisant usage d'appareils à mulsion stérilisables.
Lait tournesolé. — Au lait cru, ajouter la quantité de teinture
de tournesol sensible nécessaire pour donner une teinte nettement violacée. Opérer ensuite comme ci-dessus.
Petit-lait. — Employé surtout après addition de tournesol : petit-lail tournesolé (milieu de Petruschky).
19 Prendre 1100 grammes de lait.
29 En prélever 100 grammes; porter à l’ébullition et l'y maintenir; ajouter petit à petit une solution d’acide chlorhydrique au dixième contenue dans une éprouvette de Mohr.Agiter constamment. Arrêter quand la coagulation apparaît. Constater quelle quantité exacte, a, de la solution chlorhydrique a été employée.
3° Dansunautrerécipient, porter à l’ébullition les 4000 grammes restants. Ajouter la quantité de solution chlorhydrique représentant neuf fois a. En agitant constamment, ajouter ensuite goutte à goutte de la solution, jusqu’à ce que le liquide se coagule.
Cette manière de faire a pour but d'apprécier approximativement, par une épreuve préalable, combien il faut employer d'acide. Il est ensuite plus facile d'ajouter la quantité complémentaire juste suffisante. L’addition d'un excès d'acide serait nuisible, même après neutralisation.
49 Laisser reposer quelques heures à la glacière, puis décanter le liquide exsudé ; filtrer. Il faut plusieurs filtrations successives pour obtenir un milieu à peu près clair.
59 Neutraliser. Ajouter la quantité de teinture de tournesol juste nécessaire pour teinter.
69 Répartir en tubes, stériliser par chauffage discontinu à 1000.
On peut également se procurer dans le commerce le petit-lait tournesolé tout préparé.
Urine. — Très employée aux débuts de la bactériologie (notamment par Pasteur), l'urine est à peu près abandonnée aujourd’hui.
Le chauffage modifiant sensiblement sa composition, il est préférable de la stériliser par filtration.
On pourra essayer, sans grand espoir de réussite, d'obtenir une urine stérile par cathétérisme aseptique. En ce cas, vérifier la stérilité en maintenant Les tubes deux jours à l’étuve avant usage.
Milieux artificiels
Ces milieux représentent les milieux liquides, solidifiés par addition de gélatine ou de gélose.
Milieux solides animaux. — Gélatine. — En incorporant aux milieux liquides une certaine proportion de gélatine, on obtient des milieux qui demeurent solides au-dessous d’une température déterminée (en moyenne 250) et se liquéfient au-dessus.
Les milieux à base de gélatine ne supportent pas la température de l'étuve à 37°.
Gélatine ordinaire. — On désigne ainsi, ou encore simplement gélatine, le bouillon solidifié par addition de gélatine.
Procédé de choix. — 4 à c. Comme pour le bouillon {Voy. p.117). d. Jeter sur un linge propre, exprimer, recueillir dans un vase émaillé. |
e. Chauffer doucement (ne pas déSRbe 800 environ). Ajouter pour 4 litre :
PÉDIDAE ET PRE TRE Me 20 grammes. Del AN Ari: MR ER 5 — Gélatine.f;5t er. 120 —
On utilisera exclusivement la gélatine extra-fine du commerce.
Faire dissoudre, en agitant constamment, et sans dépasser la température indiquée.
f. Neutraliser. — C'est un temps délicat. Ajouter peu à peu la solution de soude, en vérifiant constamment la réaction au tournesol. S’arrêter quand la réaction est neutre.
q. Porter à l’autoclave ; chauffer dix minutes à 1120. Les albumines de læ viande se coagulent et collent le milieu.
h. Au sortir de l’autoclave, filtrer sur papier-filtre ordinaire.
La filtration se fait généralement bien à la température ambiante. Si la gélatine fait prise, filtrer comme il sera dit pour la gélose.
Exceptionnellement, il peut arriver que le liquide filtré ne soit pas clair. Coller alors au blanc d'œuf, comme nous le verrons pour la gélose ; porter à nouveau à l’autoclave et filtrer.
% Bip tir. Stériliser à 1100 pendant dix minutes. Ne pas dépasser. 1100.
j. Au sortir de l’autoclave, maintenir droits les tubes de gélatine droite ; maintenir inclinés lestubes de gélatine inclinée (Voy. Gélose), jusqu'à solidification complète. Conserver au frais.
Variantes. — 1° En été, on peut employer 14 p. 100 ; en hiver, 8 p. 100 de gélatine. Le point de fusion s'élève d'autant plus qu'il y a plus de gélatine. Mais au delà de 15 à 18 p. 100, les colonies microbiennes sont moins typiques.
20 Si l’on a une provision de bouillon, on peut se contenter d'ajouter au bouillon 12 p. 100 de gélatine. Neutraliser (la gélatine estacide). Coller au blanc d'œuf. Le reste comme ci-dessus.
30 Pour la stérilisation, il peut être préférable d'employer le
chauffage discontinu à 1009, qui abaisse le point de fusion moins que le chauffage à 1100.
4° On peut, au lieu de bouillon, utiliser les extraits de viande (Voy. Bouillon aux extraits de viande), plus 12 p.100 de gélatine ; neutraliser.
Autres milieux à base de gélatine. — En principe,tous les milieux liquides peuvent être solidifiés par addition de gélatine.
En pratique, le seul milieu gélaliné d'usage courant est la gélatine ordinaire, que nous venons de décrire.
D’autres milieux ont été préconisés : milieu d'Elsner (gélatine et purée de pommes de terre), milieu de Grimbert (modification du précédent), milieu de Rémy, milieu de Nœggerath, etc, On en trouvera la description dans tous les traités de bactériologie un peu anciens. Ces milieux étant à peu près inutilisés aujourd'hui, il nous parait peu nécessaire de les décrire.
Gélose. — La gélose est une matière gélatineuse extraite de l’agar-agar, produit qui vient d’une algue des mers des Indes, Gelidium spiniforme. En pratique, les mots « gélose » et « agar-agar » sont synonymes.
La gélose du commerce se présente sous forme de filaments secs, durs, grisätres. Elle peut absorber, en se gonflant, une grande quantité d’eau, environ 200 à 250 fois son poids. La gelée ainsi produite se liquéfie à chaud, à 65° ou 70° ; refroidie, elle demeure en surfusion jusque 409 ou 420, et se solidifie à des températures inférieures. Aussi les milieux à base de gélose supportent sans se liquéfier toute température inférieure à 650. Ils permettent en particulier, contrairement à la gélatine, les cultures à 379, ce qui constitue leur avantage essentiel.
Inconvénients : la gelée est difficile à filtrer. Elle demeure toujours un peu louche, mais le collage assure une transparence très suffisante.
Peu ou pas nutritive, la gélose constitue avant tout un support pour les milieux nutritifs.
Gélose ordinäire. — C'est le bouillon ordinaire, solidifié par addition de gélose.
Procédé de choix. — a à g. Comme pour le bouillon ordi-
naire (p. 117).
h. Peser 20 grammes de gélose sèche. Faire macérer pendant quelques heures dans l’eau. Exprimer.
Ajouter cette gélose (lavée et gonflée) au filtrat, alcalinisé. Porter sur le feu ; faire bouillir à feu très doux, en agitant constamment jusqu’à dissolution complète.
Vérifier la réaction. Elle doit ètre légèrement alcaline (certaines géloses sont acides et pourraient acidifier sensiblement le milieu).
i. Laisser refroidir vers 600. Casser un œuf, recueillir le blanc dans 50 à 100 centimètres cubes d’eau ; ajouter au liquide refroidi à 600. Mélanger.
j. Porter à l'autoclave à 118° pendant quinze minutes. Ne pas trop remplir les récipients ; la gélose, très visqueuse, tend à déborder quand on ouvre le robinet de vapeur.
L'albumine de l'œuf se coagule en gros flocons, entrainant les . particules solides : c’est le collage.
k. Au sortir de l’autoclave, filtrer à chaud sur filtre Chardin mouillé. La gélose se solidifiant facilement, la filtration est difficile à la température ambiante ; ou peut opérer ainsi :
Disposer le filtre sur un entonnoir en verre ; placer l’entonnoir sur un récipient (matras à col court, vase à précipiter, etc.) supportant bien la chaleur ; mettre le tout dans l’autoclave, encore chaud ; verser la gélose sur le filtre, couvrir (plaques de verre, compresse) ; poser le couvercle de l’autoclave, sans écrous, robinet ouvert ; chauffer doucement. Ouvrir de temps à autre pour surveiller la marche de la filtration.
l. Verser la gélose filtrée, très chaude, dans l’entonnoir à répartition (p. 1#1). Répartir très rapidement.
Pour la répartition en tubes :
La gélose peut être employée en tubes droits ou en tubes inclinés (fig. 43). Verser par tube sur une hauteur de # travers de doigt pour les tubes droits, 3 tra- Fig. 43. — A. Tube de gélose droit (à gauche) et incliné (à vers de JOÉPRQUE
droite). — B. Inclinaison des tubes de gélose. les tubes inclinés.
Si la répartition était trop laborieuse (température très basse), utiliser l’entonnoir à filtration chaude (Voy. ci-dessous).
m. Stériliser à l’autoclave à 1150 pendant vingt minutes.
n. Au sortir de l’autoclave :
Maintenir droits Les tubes de gélose droite ;
Pour les tubes de gélose inclinée : les incliner, ouverture en haut, de telle sorte que le bec de la gélose s'arrête à quelques centimètres du bouchon d'ouate (fig. 43).
Se servir comme supports de baguettes de verre, de règles, ete. Maintenir inclinés pendant vingt-quatre heures. Relever ensuite.
Variantes. — 10 Si l'on possède du bouillon tout préparé, simplifier les opérations : les temps a à g ci-dessus sont supprimés. À partir du temps #, comme ci-dessus.
20 La proportion de gélose n'a rien d’immuable. On pourra ajouter depuis 0,4 (milieu à peine solide) jusqu'à 4 p. 100 (milieu très solide), suivant les indications. Si le milieu doit être additionné ultérieurement d’un autre liquide (sérum, sang), employer 3 à 4 p. 100 de gélose.
3° Dans le but de faciliter l’adhérence aux parois, on peut ajouter 2p. 100 de gélatine (au temps 4), ou, plus simplement, laisser sécher les bords par séjour à l’étuve. Ce procédé Le est surtout indiqué pour les cultures > dans le vide.
49 Pour faciliter la filtration et la répartition, on peut employer l’entonnoir à filtration chaude (fig. #4).
C’est un entonnoir en cuivre, portant une tubulure latérale, elle-même munie d’une branche montante ; placer l'entonnoir en verre dans l’appareil ; assujettir le col de l’entonnoir au col de l'appareil à l’aide d’un bouchon fermant hermétiquement ; remplir d’eau l’espace vide entre l’entonnoir et l’appareil. Chauffer la tubulure latérale sans atteindre l’ébullition. Quand l’entonnoir en verre est chaud, verser la gélose ; continuer à chauffer jusqu'à la fin de l'opération.
Il existe un grand nombre d’autres modèles d’entonnoirs à filtration chaude {avec double paroi; avec serpentin à circulation de vapeur d’eau, etc.).
5o Pour éviter la filtration, l’opération ayant été conduite comme ci-des Fig. 44. — Entonnoir à filtration sus jusqu'au temps à inclus, opérer GhauAEe comme suit :
Placer la gélose dans un entonnoir en verre, coupé au ras du col, la petite ouverture obturée par un bouchon de liège; porter à l’autoclave à 1150 pendant vingt minutes; ouvrir le robinet de l’autoclave, enlever le couvercle, enlever la rondelle, replacer le couvercle (sans rondelle) ; laisser refroidir dans l’appareil (pendant la nuit par exemple). — La majeure partie des précipités tombent dans l’effilure du cône. — Renverser l’entonnoir ; vider de son contenu, en frappant d’un coup sec ; enlever l'entonnoir. Abraser toute la partie complètement opaque (pointe du cône) ; abraser, patiemment, les dépôts opaques aberrants. — Découper la partie claire, faire fondre, répartir et stériliser.
Avec le milieu ainsi préparé, il y a au fond des tubes un léger dépôt; le reste du milieu est clair. C’est suffisant pour les cultures courantes.
Si on voulait un milieu très transparent : découper à la surface (base du cône) des fragments bien clairs ; les répartir en tubes ; stériliser.
Cette préparation simplifiée peut être utilisée avantageusement,
Autres HER à base de gélose. — Gélose glycérinée. — Ajouter 4 à 6 p. 100 de glycérine au bouillon ordinaire. Opérer ensuite comme ci-dessus (variante 1°).
Géloses sucrées. — Préparer comme la précédente, en substituant à la glycérine 2 p. 100 de sucre (glucose, lactose, etc.). Pour l'étude des fermentations sucrées, il est prudent d'employer un bouillon privé de sucre (Voy. p. 119). Tubes droits ou inclinés, suivant les indications. |
Gélose glucosée glycérinée. — Elle se prépare comme les précédentes : glucose, 2 p. 100; glycérine, 5 p. 100.
Gélatine-agar. — Le procédé mixte, solidification du bouillon par l'emploi simultané d’agar et de gélatine, donne un milieu qui supporte une température de 370. La gélatine-agar a été indiquée comme succédané de la gélatine ordinaire en été ou dans les pays chauds ; elle est très peu employée, les colonies RES leurs caractères les plus saillants.
Préparer comme la gélatine ordinaire, temps a à d, avec : 80 grammes de gélatine pour 1 000. Neutraliser. Ajouter 5 grammes de gélose. Vérifier la réaction, coller au blauc d'œuf, porter à l’autoclave, filtrer, répartir et stériliser (Voy. Gélose).
Milieux solides naturels.
Pomme de terre. — I. Procédé de choix. — «Prendre des pommes de terre assez grosses, bien mûres, de variété blanche.
Nettoyer la surface dans l’eau, éplucher.
b. Avec l’emporte-pièce spécial (fig. 45), découper des morceaux demi-cylindriques. Laver largement à l’eau, essuyer au papier-filtre.
ce. Mettre en tubes de Roux (fig. 46).
La pomme de terre se pose sur l'étranglement ; l’eau d’exsudation tombe au fond.
Fig. 45. — Emporte- Fig. 46. — d. Stériliser (vingt minutes à 1200). pièce pour prépara Tube à e, Au sortir de l’autoclave, dispotion des pommes de pomme de MER RE tel ser les tubes de manière que la face
plane soit en bas; si la face convexe adhère au tube, la détacher en frappant un coup sec sur le tube. Laisser vingt-quatre heures dans cette position, relever ensuite
MILTEUX ALBUMINEUX PURS. 129
Cette manœuvre a pour but d'empêcher la face convexe d’adhérer au tube et de permettre au morceau de se tenir droit; sans quoi il s’incurverait.
Certaines pommes de terre sont très acides : faire baigner les morceaux pendant plusieurs heures dans une solution de soude à 5 p. 1 000.
L'emploi de l'emporte-pièce et du tube de Roux n’est pas absolument indispensable, mais tous deux sont trop commodes pour n'être pas prévus dans les laboratoires.
Il. Autre procédé. — Pour cultures en large surface, on peut couper de larges rondelles et disposer en boîtes de Petri.
Pommes de terre glycérinées. — Temps a et b, comme pour la préparation I ci-dessus.
ce. Abandonner les pommes de terre dans l’eau glycérinée, 6 à 15 p.100 de glycérine, pendant quarante-huit heures.
d. Verser au fond du tube de Roux de l’eau glycérinée, jusqu'à ce qu'elle alffleure l’étranglement.
e. Placer la pomme de terre dans Le tube de Roux. Boucher.
[. Slériliser.
Purée de pommes de terre. — Nettoyer des pommes de terre, faire cuire, passer au presse-purée, répartir en vases plats (cristallisoirs, boîtes de Petri), stériliser.
Garottes. — Se préparent comme les pommes de terre (préparation Î).
Artichaut. — Enlever les feuilles d'un artichaut, mettre à nu le fond, garni de foin. Découper le fond en petits fragments, 1 à 2 centimètres de diamètre. Répartir en tubes de Roux. Stériliser.
On emploie le sérum sanguin, les sérosités, le sang, les œufs.
Sérum sanguin. — Le sérum sanguin peut être utilisé à l'état liquide ou après avoir été coagulé par la chaleur ; on désigne généralement le sérum liquide sous le mot sérum, sans suffixe ; et le sérum à l’état solide sous le nom de sérum coagulé ou gélatinisé.
Nous éludierons dans ce chapitre : 1° la préparation du sérum liquide ; 20 [a préparation du sérum coagulé, par gélatinisation du sérum liquide.
Préparation du sérum liquide. — Le sérum est obtenu par coagulation du sang. Il faut d’abord prélever Île sang, puis laisser coaguler, enfin séparer le sérum.
La plupart du temps, l'espèce animale productrice du sérum est
Doprer et SACQUÉPÉE, — Baclériologie, 22 édit, 9
indifférente. On s'adresse aux grands animaux : cheval le plus souvent, sinon bœuf, veau, âne, etc.
Dans quelques circonstances, il est indiqué au contraire d’employer le sérum des animaux de laboratoire (cobaye ou lapin).
Prélèvement chez les grands animaux. — Il y a toujours avantage à recueillir le sérum aseptiquement, chez un animal sain, ou au moins non infecté ; le sérum, recueilli stérile, peut alors être utilisé sans stérilisation ultérieure. À ce but convient le procédé de choix. |
Mais, dans les petits laboratoires, on n'a pas à sa disposition de grands animaux; il faut s'adresser à l’abattoir, où il n’est pas
Fig. 47. — Trocart de Roux-Nocard.
toujours possible d'assurer une installation qui permette l'asepsie. On aura recours alors au procédé de nécessité.
PROCÉDÉ DE CHOIX. — PROCÉDÉ DE Nocarp Er Roux. — On préparera d’abord les instruments et accessoires nécessaires :
Un trocart, analogue à ceux des appareils Potain ou Dieulafoy. Le trocart de Roux-Nocard (fig. 47), à manche, est habituellement employé.
Un tube de caoutchouc rouge, long d'environ 0,50, terminé à un bout par un tube de verre à extrémité libre taillée en bec de flûte, à l’autre bout par un ajutage qui s'adapte à la canule. |
Des flacons pour recueillir le sang. Ordinairement on se contente de grands flacons cylindriques, 01,500 à 2 litres, à large ouverture (fig. 48); l'ouverture est fermée ainsi: obturer avec plusieurs doubles de papier, serrer une ficelle au-dessus du col pour assujettir cette première fermeture; au-dessus, placer une deuxième fermeture analogue, qu’on assujettira de même avec une deuxième ficelle, placée plus bas que la première.
Bistouri, ciseaux courbes ; gants de caoutchouc.
Fig. 48. — Flacon préparé pour recueillir le sang.
Ballon-pipette Chamberland, tubes à essais, ou vases de culture.
Stériliser à l’autoclave, séparément : le trocart ; le tube de caoutchouc; les gants. Au four Pasteur, le ballon Chamberland, les tubes et vases, Le bistouri, les flacons.
OPÉRATION. — a. Choisir un animal sain, à jeun. On s'adresse le plus souvent au cheval.
Chez le cheval, on prélève sans inconvénient 7 à 12 litres de sang. On peut également utiliser d’autres grands animaux.
La contention des chevaux peut être réalisée au simple tord-nez, seules les bûtes difficiles exigent le travail. Pour les génisses, maintenir sur la table à inoculations vaccinales.
On met à jeun pour éviter l’infection sanguine qui se produit pendant la digestion (Nocard, Dezoubry et Porcher).
b. Repérer la veine jugulaire, raser, désinfecter avec soin.
c. Faire comprimer, par un aide (main droite), la jugulaire à la
base du cou (entre la saillie du sterno-mastoïdien et la trachée). . d. Les mains garnies de gants stériles, saisir Le trocart. Le glisser, parallèlement au vaisseau, pointe dirigée vers la tête de l'animal, entre la veine etla peau, sur une longueur de quelques centimètres. Relever le manche du trocart ; d’un coup sec, pénétrer dans la veine ; enfoncer. La pointe est libre dans la cavité, ce dont l’opérateur peutse rendre compte.
e. Faire comprimer la veine au-dessus de la pointe du trocart, par le même aide (main gauche ; compression provisoire). Retirer le manche du trocart. Adapter l’ajutage de caoutchouc à la canule. Maintenir la canule de la main gauche.
f. Un deuxième aide enlève l'enveloppe extérieure d’un flacon, flambe rapidement le tube de verre, le fait pénétrer, d'un coup sec, à travers l'enveloppe inférieure, dans le flacon, en dirigeant la pointe du biseau vers la paroi.
g. Faire cesser la compression provisoire (main gauche du premier aide). Le sang s’écoule dans le flacon. Continuer jusqu’à ce que le flacon soit plein aux trois quarts ou aux deux tiers.
h. Comprimer le caoutchouc de la main droite. Le deuxième aide enlève le tube de verre du premier flacon. Il place le tube dans un deuxième flacon, en opérant comme au temps g ci-dessus.
i. Un autre aide replace immédiatement l'enveloppe extérieure du flacon rempli.
j. Maintenir les flacons au repos pendant vingt-quatre à quarantehuit heures au frais, mais pas à laglacière (le sérum seraitalorslaqué).
l. Prélever le sérum à l’aide du ballon-pipette Chamberland.
Variantes. — 19 Trocart. — Le trocart de Sivori peut remplacer celui de Roux-Nocard. Il est peut-être plus commode, mais aussi plus compliqué comme structure. C'est une modification du trocart de Potain. Pour les animaux moyens (génisse), on peut utiliser le gros trocart du Potain.
20 Récipients pour recueillir le sang. — On peut les varier à l'infini. Citons les plus pratiques (outre le modèle décrit ci-dessus).
Pour recueillir, par flacon, 100 à 200 centimètres cubes de sang, on utilisera avec avantage les fioles d’Erlenmeyer. Sitôt remplies au point voulu, les incliner à 509 environ, le caillot se fixe sur la partie déclive. Pour prélever le sérum, replacer le flacon horizontalement. Le sérum forme nappe à côté du caillot.
30 Appareil de Lalupie pour grands animaux. — Cet appareil permet d'obtenir plus de sérum (jusque 80 p. 100 de la masse totale, au lieu de 40 à 45 p. 100).
Il se compose (fig. 49) d’un flacon à 3 tubulures, renfermant des tubes de verre à parois perforées (ces baguettes fixent le caillot). Les 3 tubulures laissent passer 3 tubes de verre : l’un, b, bouché extérieurement à la ouate, assure la communication avec l'atmosphère. Un deuxième, a, muni extérieurement d’un tube de caoutchouc, sera mis en communication avec le trocart. Le troisième, €, pénétrant à peine, et courbé à son extrémité intérieure, porte à l'extérieur un tube de caoutchouc, T, terminé par une pipette fermée, E; le tube de caoutchouc sera muni d’une pince de Mohr. Un support permet de faire basculer.
Fonctionnement. — L'appareil ayant été stérilisé à l’autoclave, le disposer goulot en haut; mettre le tube médian en communication avec la canule .de Roux et Nocard, en conduisant la saignée comme ci-dessus. Remplir le flacon Fig. 49. — Appareil Latapie pour récolte à moitié (pas plus); condamner (pince de
du sérum (grands animaux). Mohr) le tube a.
Laisser reposer vingt-quatre à trentesix heures. Ensuite, renverser l’appareil, bouchon en bas, en faisant basculer. Le sérum tombe au contact du bouchon. Casser la pointe du tube E, recueillir le sérum en vases stériles.
L'appareil est précieux, mais un peu fragile.
Conduite de l’opéralion. — Dans l'opération décrite comme type, la manœuvre des flacons expose aux contaminations ; l'opérateur aura intérêt à la pratiquer lui-même. Il confiera alors au deuxième aide la canule (puis la compression du tube d'écoulement) et prendra la place assignée dans la description au deuxième aide.
Il va sans dire que toutes les opérations devront étre exécutées avec la plus rigoureuse asepsie, le sérum obtenu devant être stérile.
PROCÉDÉ DE NÉCESSITÉ. — 11 faut recueillir le sang à l’abat{oir; on ne pourra guère obtenir un sérum stérile; mais quelques précau- : lions réduiront au minimum les chancesde contamination.
Transporter à l’abattoir des boîtes de Koch (fig. 50), stérilisées au préalable à l'autoclave. Elles sont constituées par deux cristallisoirs s'emboîtant l’un dans l’autre ; contenance, 2 litres.
a. Suivre la saignée opérée chez le bœuf. Laisser échapper les premiers Jets de sang, très souillés. Puis ouvrir une boîle, remplir de sang à moitié, recouvrir. Faire de même avec les Fig. 50. — Boîte de Koch. autres boîtes.
b. Laisser reposer les boîtes trente-six ou quarante-huit heures dans un endroit frais. Les incliner un peu. Il est préférable de laisser les cristallisoirs à l'abattoir même; le transport au laboratoire immédiatement après la saignée gêne la rétrac- Lion du caillot; le sérum pourrait être laqué.
c. Replacer les boîtes en position horizontale. Prélever le sérum dans les ballons-pipettes
Chamberland (fig. 51).
d. Stériliser par chauffage discontinu ou par -—. liltration.
Prélèvement du sérum chez les petits animaux. — Voyez chap. XII.
Prélèvement du sérum chez l’homme. — Voy. chap. XIII. Emploi du sérum à l’état liquide. — Lesérum peut être employé -liquide. On aura toujours soin de s’assurer qu'il est stérile, en le maintenant quarante-huit heures à l’étuve avant d'en faire usage ; tous les tubes altérés seront rejetés. |
Préparation du sérum coagulé. — Chauffé à une température variable suivant les espèces, 680 à 729 en moyenne, le sérum sanguin, prélevé comme il vient d’être dit, se coagule en formant une masse solide, qui se maintient telle après refroidissement. Pour obtenir le sérum coagulé, il est préférable de chauffer à la tem pérature minima susceptible d'assurer la solidification ; en chauffant plus haut, le sérum deviendrait opaque et perdrait ainsi une qualité essentielle, la transparence.
Fig. 51. — Ballon-pipette Chamberland.
Procédé de choix. — Utiliser l’éfuve à coagulation de sérum.
Les modèles actuels (fig. 52) comportent une caisse en cuivre rectangulaire, à double paroi ; fermeture supérieure à l’aide d’un couvercle en verre à double paroi, interposant une couche d'air qui fait corps isolant ; trois ou quatre pieds formant support, l'antérieur
Fig. 52, — Etuve à coagulation de sérum.
ou les deux antérieurs pouvant être allongés ou raccourcis à volonté, pour donner au fond de la caisse l’inclinaison voulue ; brûleur à gaz avec régulateur de Roux. Garnir de sable le fond de la caisse ; remplir d’eau la double paroi.
Un thermomètre peut être plongé dans le matelas d’eau (par un orifice latéral); un second être couché sur le fond de la caisse. Pour la première opération (réglage de l’appareil}, les deux thermomètres sont utiles; dans la suite, une fois l’appareil réglé, on se contentera du second.
FONCTIONNEMENT. — a. Dans les tubes stérilisés, verser du sérum liquide sur une hauteur de 6 centimètres environ.
b. Disposer l'appareil de manière que le fond soit légèrement incliné ; coucher les tubes sur le sable de la caisse. Veiller à ce que le sérum n'’atteigne pas le bouchon. Fermer le couvercle. Allumer le gaz. :
On peut placer sur le sable quelques boîtes de Petri ouvertes, contenant de l’eau. Coagulé en milieu humide, le sérum est plus transparent (Vagedes).
c. Surveiller le thermomètre. Au moment où la température atteint 68° (pour le sérum de bœuf), régler l'appareil (Voy. p. 145). Continuer à surveiller Le thermomètre pendant quelque temps, pour s'assurer que le réglage est bien fait, et le rectifier au besoin.
d. Au bout d’une heure et demie environ, soulever le couvercle, prendre l’un des tubes, voir s’il a fait pr'se: le tube étant placé verticalement, la colonne de sérum solidifié doit rester parfaitement compacte, comme un tube de gélose inclinée. Si la prise n’est pas faite, remettre le tube en place. Renouveler le même essai de temps à autre.
e. Quand le sérum est bien solidifié, éteindre le gaz. Laisser refroidir un peu. Enlever les tubes, les placer en position verticale, couvrir le bouchon d’un capuchon de caoutchouc stérilisé, pour éviter la dessiccation ultérieure.
Pour enlever les tubes, opérer avec précaution; certains tubes pourraient n'être pas solidifiés complètement. S'il en est ainsi, les remettre en place, après avoir enlevé les tubes déjà solidifiés ; chauffer à nouveau jusqu’à coagulation complète.
Le sérum de bœuf, coagulé, doit être demi-transparent, très légèrement ambré.
L'inclinaison de l’appareil et le réglage de la température sont opérés une fois pour toutes (sauf modification éventuelle).
Autres procédés. — A défaut d'appareil spécial, on peut encore : a. Chauffer le sérum dans une étuve réglée à 680. Les tubes seront alors disposés sur un support spécial (fig. 53) qui perinet de les incliner à volonté. Surveiller avec soin.
b. Placer les tubes dans le support précédent; mettre un peu d'eau au fond du support, couvrir les tubes d’une lame de verre. On dispose alors le support au-dessus d'une marmite contenant de l’eau, qu’on porte à l'ébullition. Surveiller avec soin. Il faut une à deux heures
ON nn
pour la solidification. Le sérum Fig. 53. — Plateau pour coaguler les tubes est opaque. de sérum.
Sérosités albumineuses. — Pour divers usages, il y a intérèt à
substituer au sérum animal le sérum humain. Ce dernier étant difficile à obtenir en grandes quantités, on emploie d'habitude des sérosités pathologiques: liquides d’ascite (cirrhoses de préférence), de pleurésie séro-fibrineuse, d'hydrocèle, etc.
PRÉLÈVEMENT. — Opérer suivant les règles habituellés de la technique médicale ; avoir soin de désinfecter sérieusement la peau (teinture diode), de stériliser les instruments et récipients.
a. Pour l’ascile. — Mettre le trocart (de Potain par exemple, ou tout autre analogue) en communication avec un tube de caoutchouc, long de 0m,50 à 1 mètre, terminé par un tube de verre un peu rétréci à son extrémité libre. Stériliser l’ensemble à l’autoclave, entouré de papier.
Préparer d'autre part des flacons, disposés comme pour la récolte du sérum (fig. 48), ou comme pour la récolte des filtrats (fig. 42;.
On peut également recueillir le liquide en ballons à long col, préparés comme ci-dessus ; après remplissage, sceller le col dans la flamme.
Le liquide d’ascite ne coagule généralement pas, ou très peu. Même clair en apparence, il laisse souvent déposer à la longue un sédiment blanchätre, qui n’est pas l'indice d’une souillure. Sa coloration est variable ; les plus clairs sont les plus favorables.
L'opération est très simple: désinfecter la peau ; ponctionner, en faisant comprimer le caoutchouc par un aide ; laisser écouler les premiers jets de liquide ; comprimer à nouveau ; flamber le tube de verre, découvrir un récipien(, introduire le tube ; remplir aux trois quarts.
Comprimer le caoutchouc, enlever le tube, couvrir le récipient; flamber le tube, passer à un deuxième récipient, et ainsi de suite.
b. Pour les liquides pleurétiques. — Ponctionner au Potain. A la tubulure latérale du trocart, adapter un tube de caoutchouc épais.
Préparerun flacon comme celui de la figure 34, d'une contenance de 1 litre à 2 litres ; relier le trocart à E.
Stériliser à l’autoclave (out l'appareil (entouré de papier). Stériliser en même temps, au four Pasteur, des boüchons d'ouate s’adapant au flacon.
Mode opératoire : désinfecter la peau. Développer l'appareil.
Enfoncer le trocart. Faire le vide par le tube A. Remplir aux deux tiers. Substituer au bouchon de caoutchouc le bouchon d'ouate préparé d'avance.
Laisser reposer quarante-huit heures (rélraction du caillot). Prélever stérilement le liquide, à l’aide du ballon-pipette ou de la pipette à boule.
Plus simplement : préparer des flacons de 1 litre. dont le col s'adapte au bouchon du Potain, stériliser au four Pasteur, boucher à la ouate ; stériliser l'appareil Potain, trocart, raccord de caoutchouc, bouchon. Au moment de lopération, substituer au bouchon d'ouate le bouchon du
Potain; ponctionner comme d'habitude. Le flacon rempli, boucher à nouveau le flacon avec le bouchon d’ouate, largement flambé. Procédé moins sûr, généralement suffisant.
Règle. — Avant d'utiliser une sérosité comme milieu de culture, il est indispensable de s'assurer qu'elle est stérile. Pour cela : prélever quelques centimètres cubes, mélanger à 40 centimètres cubes de bouillon stérile, mettre à l’étuve. Le tube devra demeurer stérile.
S1 l’on avait des doutes sur la stérilité du liquide, on le stériliserait commele sérum sanguin (chauffage discontinu ou filtration).
Le sérum et les sérosités servent surtout à préparer des milieux divers (gélose-sérum, etc.) ; nous les retrouverons plus loin.
Sang. — Prélèvement. — Ün opère comme pour Ja récolte du sérum ; la seule variante porte surle traitement à faire subir au sang pour empêcher la coagulation.
À. Récolte à l’état liquide. — 1° PROCÉDÉ DE cHoix. — Préparer un matras en verre, de 100 à 200 centimètres cubes, à parois résistanltes, renfermant des perles de verre ; boucher, stériliser à sec.
Recueillir le sang à la seringue, rapidement, aseptiquement, suivant les procédés indiqués ailleurs; déboucher le matras, transvaser, reboucher, défibrinerenagitant pendant cinq minutes. Transvaser ensuite le sang défibriné avec une pipette à grosse effilure.
On peut substituer aux perles de verre des débris de verre : placer des débris de verre (fragments de tubes, de pipettes, de fioles, etc.) dans un mortier ; couvrir d’une compresse épaisse ; tasser fortement au pilon. Quand les morceaux ont en moyenne la grosseur voulue, enlever la compresse, porter le mortier sous un robinet d’eau et laver à grande eau, pour enlever la poussière de verre. Recueillir les fragments restants, placer en matras ; opérer ensuite comme ci-dessus.
Pour défibriner de petites quantités de sang, on se contentera d’un tube à pomme de terre; placer au fond des boules ou fragmeuts de verre.
20 AUTRES PROCÉDÉS. — On peut empêcher le sang de se coaguler : soit en injectant à l'animal vivant de l'extrait de sangsues, ou pour le chien, de la peptone ; soit en additionnant le sang, dès la sortie de l'organisme, de citrate de soude (3 p. 1000) ou d’oxalate neutre de potasse (1 p. 1100).
Dans la plupart des cas, la défibrination est préférable.
B. Incorporation du sang à d’autres milieux.— Voy. ci-dessous.
Œuf.— L'œuf peut toujours être infecté, soit avant la ponte, soit après. Le plus souvent, il est stérile. Si le milieu ne doit pas être stérilisé ultérieurement, 1l est nécessaire de contrôler sa stérilité avant de l’ensemencer.
1° Blanc d'œuf. — Chauffer fortement la grosse extrémité; perforer le point flambé avec une pointe métallique stérilisée.
Introduire par le trou, peu profondément, l'extrémité d’une pipette à boule stérile, à large effilure (liquide visqueux, couledifficilement). Répartir en tubes stériles.
20 Blanc d’œuf coagulé. — Opérer comme pour le sérum (p. 135, Autres procédés, b).
3° Jaune d’œuf. — Laisser l’œuf une minute dans l’eau bouil-
lante, flamber une extrémité, perforer. Introduire en plein jaune l'extrémité d’une pipette à boule stérilisée. Aspirer. Répartir.
49 Œuf entier. — Agiter fortement un œuf, pour mélanger jaune et blanc. Flamber une extrémité. Perforer. Ensemencer à travers le trou, avec une pipette ou un fil de platine. Boucher à la cire.
59 Tranches d'œuf. -- Faire cuire dure. Enlever la coquille. Couper en tranches avec un couteau propre. Répartir en boîtes de Petri. Stériliser à l'autoclave.
Bouillon-sérum.— Au bouillon stérile, ajouter le sérum stérile, en proportion variable suivant le but cherché : généralement la moitié, le tiers ou le quart.
Souvent on emploie le bouillon-ascite. Mème technique.
Gélose-sérum. — 1° Faire fondre de la gélose au bain-marie, vers 70°; après liquéfaction complète, laisser refroidir vers 600. Ajouter alors la proportion voulue de sérum, généralement un. tiers. Laisser refroidir en position inclinée ou répartir de suite en boites stérilisées, suivant les indications.
29 Préparer de même la gélose-ascite.
39 On peut se contenter de déposer au fond d’un tube de gélose inclinée, solide, 0,5 à 1 centimètre cube de sérum ou d’ascite ; incliner, de manière que le liquide baigne toute ‘a surface ; laisser incliné pendant douze à vingt-quatre heures. Ce procédé ne vaut pas le précédent,
Milieux au blanc d'œuf alcalin. — En vue de permettre la stérilisation par l’autoclave, Sacquépée et Delater préconisent l'addition aux milieux ordinaires de blanc d'œuf, alcalinisé au préalable. Une fois alcalinisé, le blanc d'œuf supporte l’autoclave sans se troubler. Il peut de même être incorporé au bouillon ou à la gélose, sans précipiter, à condition que ces derniers milieux soient eux-mêmes suffisamment alcalins.
Préparation du blanc d’œuf alcalin. — Verser deuxblancs d'œuf dans un verre à pied gradué. En agitant constamment, ajouter petit à petit trois fois leur volume d’eau distillée. Une fois le mélange obtenu, ajouter un demi-centimètre cube de soude au dixième, pour 100 centimètres cubes de mélange. Agiter. Porter à l’autoclave à 1150.
Préparation iela gélose. — Préparerla gélose comme ci-dessus (p: 125) de a à f. Incorporer alors 3 p. 100 de gélose, faire dissoudre. À ce moment, neutraliser exactement. Après neutralisation, ajouter, par litre, 9 centimètres cubes de soude au dixième.
Coller ensuite comme d'habitude, porter à l’autoclave, filtrer.
Mélange. — Mélanger 1 partie de blanc d'œuf alcalin à 5 parties de la gélose précédente. Répartir, stériliser 15 minutes à 1129,
Même mode de préparation pour le bouillon au blanc d'œuf alcalin.
Bouillon-sang. — Opérer comme pour le bouillon-sérum, en substituant au sérum le sang défibriné.
Sang gélosé. — 1° Faire fondre la gélose, laisser refroidir à 420.
Dans chaque tube, recevoir 4 centimêtre cube de sang, au sortir de l'artère (Voy. chap. XII). Mélanger, incliner, laisser refroidir.
29 Autre technique, plus pratique : à la gélose fondue et refroidie, ajouter la proportion voulue de sang défibriné.
On peut substituer au sang l’hémoglobine, stérilisée par filtration.
Gélose sanglante. — Étaler quelques gouttes de sang à la surface d’un tube de gélose. Incliner (Voy. Gélose-sérum, 3°).
Sérum glycériné. — À 100 centimètres cubes de sérum stérile, ajouter 6 à 8 grammes de glycérine neutre stérilisée ; répartir en tubes ; gélatiniser, comme le sérum ordinaire, mais la température de solidification sera portée à 750.
Bouillon-sérum glucosé (milieu de Léœæffler), — Préparer du bouillon ordinaire, glucosé à 1 p.190 ; au bouillon glucosé stérile, ajouter trois fois son poids de sérum stérile; gélatiniser à 70-750.
