PROCÉDÉS DE CULTURE DES ANAÉËROBIES

Tube de Roux. — On peut utiliser pour piqüres le modèle de tube de Roux destiné aux stries (Voy. ci-dessous).

Fixation d'oxygène par un microbe aérobie (Roux). — a à d. Comme pour le deuxième procédé ci-dessus (procédé du tube à essai profond).

e. Ensemencer à la surface de la gélose un microbe aérobie strict (B. subtilis ou B. mesentericus).

Pour prélever la culture anaérobie : couper le tube de verre, à distance du bouchon de gélose.

D. — Dispositifs pour ensemencement des milieux solides en strie.

On peut utiliser le dispositif de Buchner {Voy. p. 178) ou l'un des suivants.

Tube de Roux (fig. 97). — Il présente la forme d'un tube à essai, surmonté d'un tube en T horizontal. Disposer un tampon de coton filtrant sur la branche horizontale. Remplir au tiers de gélatine, fermer l'extrémité supérieure, stériliser.

Au moment de l'emploi, s'assurer d'abord que le tampon de coton est sec. Sinon, sécher en chauffant.

a. Liquéfier la gélatine.

On peut employer la gélose : il faut alors maintenir dans un bain-marie très chaud jusqu'au temps b inclus.

b. Relier le tube A à la trompe à eau munie de l’appareil à hydrogène ; faire le vide avec rinçage à l'hydrogène.

c. L'appareil étant plein d'hydrogène, incliner le tube à culture, laisser refroidir pour fs dt rObene Roux faire prise. Attendre la sol'dification. en T, pour anaérobies.

d. Ensemencer : ouvrir l'extrémité supérieure, B; ensemencer rapidement à l’aide d’un long fil de platine; sceller. '

L'air ne rentre pas au moment de l’ouveriure, parce que l’appareil est plein d'hydrogène, qui s'échappe au dehors à ce moment.

e. Faire le vide, laver à l'hydrogène ; sceller l’étranglement à la flamme, dans l'hydrogène.

Il vaut mieux faire les cultures en strie dans une atmosphère d’hydrogène, de manière à éviter autant que possible que le milieu ne se décolle de la paroi, sous l'influence du vide.

Dispositif extemporané. — On peut utiliser un simple tube à essai, à paroi résistante, fermé par un bouchon de caoutchouc traversé par deux tubes, le tout disposé comme l'indique la figure 98.

Répartir dans le tube de la gélose, quantité nécessaire pour obtenir ensuite une grande surface de gélose inclinée.

Opérer ensuite comme pour le tube de Roux ci-dessus ; le tube 0 sert à l'ensemencement ; le tube coudé est utilisé pour le vide et pour le rinçage à l'hydrogène.

REMARQUE. — On peut employer également un bouchon muni d’un seul tube.

Le vide et le rinçage à l’hydrogène sont faits comme ci-dessus, gélose liquéfiée. Incliner la gélose, le tube étant plein d'hydrogène. Une fois la gélose bien prise, enlever le bouchon, ensemencer, replacer le bouchon. Faire le vide, puis laisser pénétrer l'hydrogène ; Fig. 98.— Tube Fig. (9. —" Tube SCEHEr:

Bu sitis Qué obiogue pomme de POP TP ONE

robie). terre. pomme de terre. — Employer le

tube de Roux pour culture anaérobie sur pomme de terre (fig. 99); disposer le milieu et stériliser comme d'habitude.

Pour l'emploi : ensemencer. Sceller le tube, dans la flamme, à son extrémité supérieure. Relier l’effilure latérale à la trompe à

eau, faire le vide (avec ou sans rinçage) ; sceller l’effilure.

Comme pour les aérobies (p. 165), il existe des méthodes générales et des méthodes spéciales.

Les méthodes spéciales sont les mêmes que nous avons déjà décrites pour les aérobies ; il est donc inutile d'y revenir. Les plus employées sont l'isolement par la chaleur (tétanos) et l’inoculation aux animaux (Vibrion seplique).

Les méthodes générales utilisent les cultures sur plaques ou les cultures en tubes,

ISOLEMENT DES ANAÉROBIES. 185

A. — Isolement sur plaques.

Méthode ordinaire des plaques. — On peut employer la méthode ordinaire, telle qu’elle a été décrite précédemment (p. 166); après refroidissement, les plaques sont portées sous une cloche, fermant hermétiquement ; placer également sous la cloche la solution réductrice indiquée page 177.

Procédé de Marino. — On dispose des boîtes de Petri de telle manière que le couvercle emboite le fond; stériliser dans cette position.

Pour l’usage : ensemencer en tubes de gélose-sérum comme d'ordinaire : verser le milieu, encore liquide, dans le couvercle de la boîte, préparée comme il vient d’être dit ; laisser solidifier, couvrir le milieu avec le fond de la boîte. Le milieu de culture se trouve ainsi protégé entre deux parois de verre. Couvrir le tout d’une plaque de verre.

Le procédé est ingénieux ; malheureusement, quand on enlève le fond pour faire des prélèvements, le milieu se trouve souvent disloqué.

B. — Isolement en tubes.

Tube de Vignal. — Procédé recommandé. — Préparer un tube de verre, d'environ 1 mètre de long sur 4 millimètres de large ; effiler une extrémité, pratiquer un étranglement près de l’autre extrémité; boucher au coton l'extrémité large. Stériliser. On facilite les manipulations en coudant le tube ai en plusieurs segments (fig. 100).

Pour l'emploi :

a. Ajouter à un tube de gélatine quelques gouttes de solution de Fig. 100. — Tube de Vignal pour isolement sulfo-indigotate de soude ; le mi- RP TEE lieu devientlégèrement bleu. Faire bouillir la gélatine pendant quinze à vingt minutes. Refroïdir très rapidement (pour éviter l’absorption d'oxygène) sans amener la solidification du milieu. Arrêter le refroidissement quand la température est descendue vers 300-350.

b. Ensemencer le tube de gélatine. Mélanger.

c. Casser l’effilure du tube de Vignal; plonger la pointe dans la gélatine ensemencée; aspirer par l'autre extrémité ; remplir jusqu'à l’'étranglement. — On aura soin de plonger l’effilure en pleine gélatine, pour ne pas aspirer de bulles d’air.

d. Sceller d’abord l’effilure, puis l’étranglement.

Les anaérobies se développent en décolorant le milieu (bleui par addition d’indigo), parfois en dégageant des bulles gazeuses.

Pour faire un prélèvement : laver le tube, au niveau de la colonie

à prélever, à l’aide d’un antiseptique liquide quelconque ; rincer à

l’eau stérile, sécher. Sectionner avec un couteau à verre flambé.

Tube en U de Roux. — Cet appareil se compose d’un tube hori- :

Fig. 101. — Tube en U, de Roux.

zontal, terminé aux deux extrémités par deux tubes plus étroits, coudés à angle droit et munis d'un tampon de coton (fig. 101).

Ensemencer un tube de gélatine. Verser la gélatine dans le tube en U, à l’aide d'un entonnoir à effilure fine, stérilisé.

Relier l’une des branches à l'appareil producteur d'hydrogène ; faire passer le gaz pendant quelques minutes. Sceller successivement les deux effilures.

Porter le tube sous un courant d'eau

froide, en le roulant entre les doigts pour enrouler la géla-

tine. Attendre la solidification.

Pour prélever : sectionner le lube.

Tube droit de Roux (fg.102). — C’est un tube à essai, surmonté d’un tube plus petit muni d’un bouchon d'’ouate. Remplir de gélatine et stériliser comme d'ordinaire.

Pour l'emploi : liquéfier la gélatine; ensemencer ; faire le vide et rincer à l'hydrogène; sceller.

Tubé de Fraenkel. — Tube à essai, fermé par un bouchon à deux tubulures coudées à angle droit, disposées comme l'indique la figure 98. Remplir de gélatine, stériliser.

Mode d'emploi — Liquéfier la gélatine, ensemencer ; relier le tube à l'appareil à hydrogène ; faire barboter le gaz pendant quelques minutes, sceller ; refroidir sous l’eau, en tournant pour enrouler la gélatine.

Tube de Veillon. — Procédé de choix. — Préparer les

tubes suivant les indications données plus haut (p. 182), Fig. 102. — |

en ajoutant 1 p. 1000 de nilrate de potasse.

Le développement en gtlose sucrée s'accompagne commu:

Tube droit de Roux (anaérobies).

nément de dégagement degaz, surtout d'hydrogène, insoluble :, ces gaz disloquent le milieu. En présence du nitrate de potasse, H donne de l'eau en réduisant le nitrate. L’acide carbonique, formé en même temps

que H, est très soluble.

a. Faire bouillir au bain-marie une dizaine de tubes de gélose Veillon, pendant quinze minutes environ. Laisser refroidir à 4090-45 : maintenir à cette température.

b. Charger la semence sur l’effilure d'une pipetle, scellée ; on se sert de celte pipette comme d'un fil de platine. Ensemencer un premier tube en agitant la pipette dans la gélose fondue.

ISOLEMENT DES ANAÉROBIES. 187

c. Sans recharger l’effilure, ensemencer de même un deuxième tube, et ainsi de suite jusqu’au dernier.

d. Refroidir rapidement les tubes ensemencés ; porter à l’étuve.

Les colonies se développent avec une rapidité variable, Il faut surveiller les tubes {ous les jours et prélever sitôt qu’elles sont bien formées toutes les colonies qui, dans la zone anaérobie (à partir de 2 centimètres de la surface), présentent un aspect différent. Ne pas attendre pour les prélèvements ; car certaines espèces, (rès fragiles, meurent rapidement.

Pour opérer les prélèvements, plusieurs procédés.

1° On peut opérer comme pour le tube de Vignal (p. 185).

29 Ou bien, à l’aide d'une pipette à fine effilure, aller cueillir la colonie, sans toucher aux colonies voisines. On s’aide de mouvements de va-et-vient ; la gélose monte par capillarité.

Si la colonie est petite et profonde, il est bon de munir la pipette d'un tube de caoutchouc de 30 à 40 centimètres de long, aspirer avec la bouche (Guillemot).

30 L'un de nous emploie la technique suivante, par expulsion du bloc de gélose :

Introduire, en soufflant, l’effilure d’une longue pipette jusqu'au fond du tube, en longeant la paroi: continuer à souffler en mobilisant un peu la pipette de haut en bas ; l'air insufflé au fond détache le bloc de gélose, qu'on amène ainsi jusque près de l'orifice du tube. Enlever alors la pipette; chauffer le fond du tube : l'air chauffé se dilate et expulse le cylindre de gélose, qu’on recueille dans une boîte de Petri stérile. Cautériser la surface au point voulu et faire les prélèvements.

REMARQUE. — Les colonies développées dans la zone d'anaérobiose ne sont pas nécessairement des anaérobies vrais ; ce peuvent être — ce sont le plus souvent — des anaëérobies facultatifs. Le réensemencement par piqûre sur gélose glucosée fait le diagnostic : les anaérobies facultatifs se développeront sur toute la hauteur de la piqüre ; les anaérobies vrais, exclusivement dans la zone d’anaérobiose.

Cette technique reste toujours un peu délicate, il faut s’y habituer. Le mode de prélèvement exige des colonies très séparées ; c’est pour celte raison qu'il faut faire des ensemencements nombreux, à dilutions peu espacées les unes des autres,