ESSAIS DE CULTURE

Jusqu'à ces dernières années, les essais de culture de l'Hématozoaire du paludisme avairnt échoué. En 1912, Bass et Johns, puis Ziehmann, Thomson et Mac Lellan, H. da Rocha-Lima et Werner, Ed. et Et. Sergent, Béguet el Plantier obtinrent des résultats intéressants.

On prélève aseptiquement, dans une veine du pli du coude, 20 centimètres cubes de sang ; on défibrine dans un gros tube contenant des effilures de verre en roulantentre les mains. A l’aide d’une grosse pipette, on transvase le sang défibriné dans des tubes stériles contenant 0,2 de solution de glucose à 50 p. 100 par 10 centimètres cubes de sang. Transporter ces tubes au laboratoire dans des bouteilles isolantes à 38°. Placer à l'étuve à 379.

Ed. et Et. Sergent, Béguet et Plantier ont pu ainsi, en suivant de temps à autre l'évolution des parasites, mener à terme complet une génération de PI. præcox, depuis la petite forme annulaire initiale jusqu’à la formation des mérozoites ; ils ont même pu, en certains cas, as ister à l'infection des hématies par des jeunes parasites.

Bass, puis Ziehmann auraient pu, en inactivantle sérum et en supprimant les leucocytes, constater l'évolution de deux ét même de trois générations.

Les leucocytes, en effet, surtout les grands mononucléaires, possèdent dans ces cultures la propriété de phagocyter les hématozoaires, ce qui assure en partie leur disparition. Ceux quine subissent pascetenglobement subissent une lyse analogue à celle que produit la quinine.

Plus récemment, Chambelland a modifié le procédé de Bass de la façon suivante : 10 centimètres cubes de sang prélevés sont centrifugés lente- : ment; le sérum surnageant est décanté.On ne garde que leculot de globules rouges. Le sérum décanté est remplacé par un égal volume de sérum citraté; verser ensuite dans le tube un quart de centimètre cube d'une solution stérilisée de dextrose à 50 p. 100. Porter à l'étuve à 370.

Prélever un peu de sang à À millimètre de profondeur dans la couche des globules rouges. Étaler et colorer.

A l’aide de ce procédé, l'auteur n’a pu acclimater que P7, falciparum.

L'Hématozoaire du paludisme est inoculable à l’homme. Il reproduit ainsi chez lui le tableau de la malaria sous ses divers aspects

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cliniques. Toutes les tentatives faites chez les animaux, même les singes, ont échoué.

L'inoculation expérimentale peut être effectuée par la piquüre de moustiques ayant sucé du sang de paludéens porteurs d'Hématozoaires. L'expérience, aujourd hui classique, effectuée par P. Manson sur son fils, le démontre pleinement: P. Manson fit venir d'Italie des moustiques ayant piqué des paludéens. I! leur fil piquer son propre fils, qui n'avait jamais quitté l'Angleterre ; quelques jours après, le paludisme évoluait chez lui, suivant le type tierce, avec des Hématozoaires dans le sang.

Le moustique ne peut ètre infestant que si le parasite a suivi en lui les transformations successives nécessaires à l’envahissement des glandes salivaires par les sporozoïtes.

RECHERCHE DE L'HÉMATOZOAIRE.

Dans le sang. — Moment où doit s2 faire le prélèvement du sang. — L'Hématozoaire ne se trouve pas indifféremment à tout moment dans le sang du paludéen : {out dépend de la forme clinique de paludisme qu’il présente et aussi du traitement quinique subi antérieurement.

Le traitement quinique, en effet, fait disparaître l’Hématozoaire de la circulation générale ; les gamètes cependant échappent à la règle; ils sont beaucoup moins sensibles à l’aclion de ce médicament.

Prélèvement. -- Assurer l'asepsie absolue de la région où le prélèvement doit être effectué, de préférence au savon, puis à l'alcool. Ces détails ont pour but non seulement d'éviter l'infection du sujet, mais aussi d'éviter les impuretés venant de la peau, pouvant introduire dans le sang à examiner des éléments qui géneraient l’observation. Sécher ensuite, car les liquides et la sueur altérent les globules rouges et leur font subir drs modifications qui pourraient être de nature à fausser l'interprétation.

Piquer avec une épingle flambée soit la pulpe d’un doigt de la main, soit la région para-unguéale (l'opération est moins douloureuse), soit le lobule de l'oreille (pijüre moius douloureuse encore, et donnant du sang à volonté, en plus grande abondance qu’au doigt). Presser : une gouttelette de sang se met à sourdre. On la recueillé sur une lame que l’on prépare différemment, suivant que l'on veut pratiquer l’examen du sang frais, ou à l'état coloré après dessiccation.

Examen à l'état frais. — Choisir une lame de verre et une lamelle bien planes. Les nettoyer préalablement à l'alcool ou à J’HCI, pour les dibarrasser de toute matière grasse qui empêcherait l’uniformité de la répartition du sang entre elles deux.

Recueillir sur la lame la goutte de sang qui perle au point de la piqûre

992 HÉMATOZOAIRE DU PALUDISME.

faite précédemment, la recouvrir de la lamelle. Inutile de luter à la paraffine ; la périphérie de la préparation se dessèche légèrement et -opère d'elle-même le lutage.

Observer avec un éclairage de moyenne intensité, sans éclairage Abbé (une trop grande lumière ne permettrait pas d’établir la réfringence convenable à l'examen) avec un objectif 8 ou 9 à sec de Vérick. Examiner la préparation dans les régions où les globules rouges sont vus à plat et n’adhèrent pas entre eux : dans les zones où ils sont accolés en pile et vus par la tranche, l'examen est impossible.

Ces préparations montrent divers éléments histologiques; ce

sont:

a. Les hématies. — Elles peuvent avoir conservé leur aspect normal, mais souvent elles sont le siège d'altérations portant sur leur forme ; le globule rouge présente alors un contour irrégulier; de plus, à son intérieur, des vacuoles sont parfois perceptibles.

b. Les leucocytes. — Des polynucléaires et mononucléaires s’y rencontrent. À signaler particulièrement la teneur de certains polynucléaires en grains pigmentés mélaniques. Il en est de même des grands mononucléaires. Ce sont les leucocytes mélanifères, débarrassant le sang circulant des déchets parasitaires ; les lymphocytes ne présentent pas ces caractères.

c. Les hématozouires. — Suivant la forme clinique, suivant la période à laquelle le sang est examiné, on décèle Les différents aspects connus: dans l’intérieur du globule rouge, on percoit de petites taches de protoplasma pâle (fig. 348), à contour souvent imprécis, mal défini, contenant des grains de pigment noir. Ce sont les corps sphériques ou amiboïdes, reconnaissables aux mouvements qu'ils présentent, les corps en rosace, les gamètes, et, si l'examen dure vingt à trente minutes, les corps flagellés apparaissent aux dépens de certains de ces derniers. |

Dans le sang des paludéens, on peut rencontrer exclusivement, soit l'une, soit l’autre de ces formes parasitaires. Mais fréquemment deux et même trois d’entre elles s’y trouvent associées (Voy. plus haut). |

Cet examen à l'état frais, aboutissant à la constatation d’un de ces parasites, à quelque variété qu'il appartienne, suffit pour imposer le diagnostic de paludisme. Mais le praticien, surtout peu exercé à cette observation, ne saurait être trop rigoureux dans l’interprétation de ses constatations ; car les altérations globulaires peuvent donner le change avec la présence de l’'Hématozoaire; il les faut bien connaître pour éviter une erreur grossière. |

Certains globules rouges présentent à leur intérieur des vacuoles. qu'il ne faut pas confondre avec l’Amibe de la malaria : leurs bords

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sont nettement tranchés ; si elles semblent présenter parfois des mouvements, ce n’est qu’une apparence ; elles ne contiennent pas de grains de pigment ; si un doute persiste encore, il disparaîtra définitivement par l'examen du sang coloré ; l’Hématozoaire sera teinté ; la vacuole ne prendra pas le colorant.

Enfin la coloration est indispensable pour l'étude des caractères distinctifs des divers types d'Hématozoaires. |

Examen après coloration. — Étalement. — Étaler sur une lame

Fig. 347. — Hématozoaire du paludisme vu dans 1: sang à l'état frais, À gauche : corps sphériques intraglobulaires, — À droite : corps en croissant,

de verre, en couche aussi mince et aussi uniforme que possible, la goutte de sang obtenue par la piqüre. Sécher rapidement pour conserver aux hématies leur aspect normal, sous peine de nouvelles erreurs. Dans ce but :

1° Chauffer légèrement à la flamme une lame de verre bien plane et bien nettoyée préalablement, de façon que sa température soit supportable à la main;

20 Y déposer immédiatement une gouttelette de sang et l’étaler de suite.

La lame étant sais'e de la main gauche, saisir une carte de visite, par exemple, ou «ne lamelle à bords bien rectilignes de la main droite,

Doprer et SaAcquÉPéE. — Bactériologie, 2° édit, 63

994 HÉMATOZOAIRE DU PALUDISME.

L'appliquer sur la lame obliquement à l'endroit de la gouttelette, de façon que celle-ci s'étale transver:alement dans l’angle dièdre formé par la lame et la carte. Puis tirer très doucement cette dernière vers la droite sans cesser de l’appuyer légèrement sur la préparation. En même temps, souffler fortement sur le sang qui s'étale ainsi progressivement pour obtenir, de concert avec la chaleur, une dessiccation rapide. PAS ainsi huit à dix lames.

En certaines circonstances, surtout quand il s’agit de paludéens: non encore traités, l'Hématozoaire est en général en assez grande abondance dans chaque préparation, et chaque champ de microscope peut en faire voir un, deux et même plusieurs exemplaires ; on peut même observer des hématies qui contiennent plusieurs Hématozoaires. Mais ces cas sont relativement peu fréquents, et bien souvent on est obligé d'examiner dix, vingt, trente champs avant d’en rencontrer un; bien plus, ce n’est quelquefois qu'aux deuxième, troisième, cinquième préparations, et même davantage, que le parasile peut être perçu.

Aussi, quand les parasites sont rares, est-il avantageux de recourir au procédé de la goutte épaisse (Leishman) qui a pour but de concentrer sur une surface plus réduite le plus grand nombre possible d'Hématozoaires. Dans ce but:

Déposer sur une lame 3 à 5 gouttes de sang que l’on n’étale pas ; en s’étalant d’elles-mêines, elles PER un diamètre de 5 millimètres environ.

Laisser sécher, puis hémolyser à l’eau distillée qui décolore les hématies et respecte l'intégrité des leucocytes et des parasites. Sécher à nouveau. Colorer par les méthodes classiques.

Les parasites sont assurément moins finement colorés ; la différenciation est moins parfaite, mais suffisante néanmoins pour permettre d'établir un diagnostic de présence de l’'Hématozoaire.

Fixation. — On fixe soit par l’alcool absolu pendant une demiheure, soit par l’alcool-éther pendant un quart d'heure; éviter surtout la fixation par la chaleur.

Avec certains colorants, dans la constitution desquels entre de l'alcool méthylique absolu (procédés de Hollande, Gombault, Tribondeau, panchrome Laveran) la fixation préalable est inutile. Elle s'effectue par le colorant lui-même.

Coloration. — Pour la coloration, employer l’un des procédés énoncés plus haut. Les préparations colorées doivent toujours être examinées à ‘immersion.

Conditions essentielles de réussite. — La réussite de ces colorations dépend d’une série de détails essentiels à observer sous peine d'exposer à des mécomptes :

RECHERCHE DE L'HÉMATOZOAIRE. 295

19 Les lames utilisées pour l’étalement doivent être d’une propreté rigoureuse ; il faut Les laver longtemps à l’eau ordinaire, les nettoyer, les sécher. Il convient, d'autre part, d'éviter l’usage de lames ayant déjà servi, sinon les précipités qui se forment s'accumulent au niveau des rayures du verre.

20 L'eau distillée qui sert aux lavages des préparations en cours de coloration doit être rigoureusement neutre ou légèrement alcaline. Celle que délivre le commerce est souvent impure et acide, et fausse ainsi Les tons que doivent donner les divers colorants. Elle doit donc toujours, avant l’usage, être éprouvée à ce point de vue.

Pour éviter cet inconvénient, plusieurs techniques ont été conseillées :

Dans la pratique, la technique employée par Laveran est suffisante ; faire bouillir l’eau distillée pendant trente minutes dans un matras de verre bien nettoyé. Le procédé de Tribondeau (redistillation au contact. du carbonate d'argent) est beaucoup trop complexe pour la pratique courante des laboratoires.

Erreurs d’interprétation à éviter. — Différentes erreurs peuvent êlre commises après coloration ; il convient, pour les débutants, de les bien connaître, sous peine de prendre pour des Hématozoaires des artifices de préparation.

Ainsi, quand les hématies ont été mal fixées, elles renferment parfois des vacuoles à contours circulaires irréguliers, que l’on peut d'autant mieux confondre avec des Hématozoaires que leur limite est souvent marquée par une coloration bleue.

En d'autres cas, les globules rouges présentent une {ache chromatique rouge qui, entourée d’une aréole claire, peut, jusqu’à un certain point, simuler un parasite; il s’agit en ce cas d’une plaquette incluse dans un globule ou en entamant la périphérie.

On ne saurait interpréter comme des parasites des hématies déformées par une mauvaise fixation ou une dessiccalion défectueuse au cours de l’étalement. Et cependant l'erreur a élé commise. Il en est de même des précipités, des poussières ou des levures contenues parfois dans les matières colorantes.

En tout cas, l'interprétation doit être guidée par cette remarque de Grall et Marchoux : « Se souvenir toujours qu'un Hématozoaire se compose de chromatine se colorant en rouge par la méthode de Romanowsky (ou ses dérivés) et de protoplusma qui apparait en bleu, est un moyen d'éviter beaucoup d'erreurs ».