ES
182 CULTURE ET ISOLEMENYT DES AÉROBIES s
culture sur plaques d'Esmarch du B. coli et du B. d'Eberth qu'elles peuvent contenir (CæanreMEssE et WipaL !).
La carotte est le milieu que préfère le champignon du Muguel (Roux et Liossrer, VezLar*). Le Streplocoque pousse très vite sur les milieux au touraillon (G. Roux, Cuarix').
Le Bacille de la tuberculose, au sortir des ganglions du cobaye, doit être isolé sur sérum gélifié et ne pousse sur gélose glycérinée qu'après un acclimatement à ce milieu.
Le même bacille, contenu dans les épanchements pleuraux, végète directement si on l'ensemence sur sang gélosé (voy: p.112).
Est-il besoin de rappeler la préférence qu'a l'Aspergillus niger pour le liquide de Ravux (p. 80), et sa sensibilité aux moindres modifications de ce liquide, même à celles aussi insensibles que l'exposition dans un vase d'argent? Mais nous entrerions dans le domaine des champignons.
À Cuanrewesse et Winas, Recherches sur le bacille lyphique, Arch. de physiologie, 1887, p. 242.
* Roux et Linossten, Arch. de médecine expérimentale, 1890, — VeuLar. Thèse de Lyon, 1892,
? Roux, Soc. de Biologie, 1889, — Cnaris, Thèse de Lyon, 1893.
Fépiies A ED Hire ex di D
s aréobies sont facullatifs. Voici un nomenclatures des principaux types
obes :
M. racusrarirs M, ANAÉNORIES Bacille de Nicolaïer.
| 184 GULTURE DES ANAÉROBIES
On voit, par ce tableau, que les microbes anaérobies actuellement connus tiennent déjà une grande place duns la pathologie infectieuse ; ils sont les agents des maladies les plus redoutables (tétanos, gangrène gazeuse, charbon symplomatique, pleurésies putrides, abcès gangreneux, etc.), (Voy. p. 799 In
| description de nombre d'anaérobies.) Ils sont d'ailleurs très | répandus dans la nature. La plupart se reproduisent par des | spores extrèmement résistantes. 1 suffira pour s'en procurer d'inoculer sous la peau d'un cobaye un peu de terre végétale, de vase chauîTée à + 100° pendant dix minutes (pour la débarrasser des microbes vulgaires). Le cobaye mourra, en vingtquatre ou trente-six heures, de seplicémie gangreneuse où de tétanos. L'ensemencement de la sérosilé périlonéale dan- | nera des cultures pures de Vibrion septique dans le premier cas; l'ensemencement du liquide de la plaie, dans le second, fournira aussi des cultures de Bacille de Nicolaïer, mais le plus souvent impures. On peut aussi se procurer du Bacillus butyricus en immergeant un haricot dans un tube à essai rempli aux 3/4 de gélose bouillante qu'on met à l'étuve à + 389,
En résumé : la gravité des accidents qu'ils engendrent, leur fréquence dans la nature, ln résistance de leurs spores placent les anaérobies au premier rang des microbes pathogènes. Leurs exigences biologiques imposent une technique spéciale sur laquelle nous allons longuement nous appesantir. Nous supposerons d'abord l'élève en possession d'une culture pure d'un anaérobie pour décrire les procédés habituels de culture de ces microbes ; nous éludierons ensuite les méthodes d'isolement des anaérobies.
UÜné question théorique se pose avant d'aller plus avant dûns ce.chapitre : l'anaérobie vrai se passe-t-il réellement d'oxygène ou l'emprunte-t-il aux substances du milieu nutritif qui en contiennent? Craint-il seulement l'oxygène libre ? On admet actuellement qu'un microbe peut vivre et se multiplier sans fixer aucune molécule d'oxygène. Il n'en est pas moins vrai que d'anaérobies utilisent l'oxygène des substances s qu'ils dédoublent par fermentation.
de mettre en relief la différence dans les besoins
re (Mg. 419, c).
…— CuLTUNE DES ANAÉROBIES
lon veuille propager une culture pure de
les couches profondes des milieux Certains anaérobies poussent dans les liquides nutritifs qui remplissent des
186 CULTURE DES ANAÉROBIES
récipients suftisamment étroits et profonds (éprouvettes, tubes à essai, flacons, etc.), sans qu'il soit besoin de faire le vide. Ce n'est pas un procédé à employer ; l'expérience prouve simplement que tous les anaérobies nesontpas également exigeants et que certains supportent la présence d'une qnantité notable d'oxygène.
Lisonius a préconisé (1886) la culture des anaérobies dans les couches profondes des milieux solides et particulièrement de la gélose peptonée.
2° Cultures dans des milieux aérés mais isolés de l'atmosphère. — Un procédé de culture assez employé consiste à recouvrir d'une couche de pétrole ou d'huile stérilisée de deux centimètres de hauteur le milieu nutritif liquide ou solide ensemencé, Il vaut mieux fai riliser l'huile dans le récipient en même temps que celui-ci, vide ou déjà chargé du bouillon, de la gélatine ou de la gélose ; ces milieux privés d'air pendant le chauffage ne peuvent le reprendre pendant le refroidissement, l'huile surnageant à la surface. On obtiendra ainsi facilement des cultures de Bacille de Nicolaïer, de Vibrion cholérique, ete. L'huile mème très pure est parfois émulsionnée au cours de la végétation de certains microbes, tels que le Vibrion cholérique ; elle n'est cependant pas dédoublée, il n'y a pas production de glycérine (J. Counmonr el Doyon).
Il est préférable d'employer l'huile de vaseline.
Kocu a proposé de recouvrir la surface de la gélatine cou- 16e sur plaques d'une mince plaque de verre où de mica qu'on dépose sur la gélatine encore molle. Ce procédé n'est plus employé.
3° Cultures dans des récipients scellés à la lampe après ébullition des milieux nutritifs. — L'ébullition chasse l'air contenu dans les milieux nutritifs; on peut alors fermer le récipient avant le refroidissement. Il n'y a aucun inconvénient à porter pendant quelques minutes à l'ébullition du bouillon ensemencé avec des anaérobies à spores très résistantes tels que le Bacille de Nicolaïer ou le Vibrion septique. On se sert pour
__ …till
Fig. 491.
Tube à essai pour la culture des anaérobies.
tube rempli. — B, tube la RUE DER ral CI RE De
er pendant de longs mois en bon il
188 CULTURE DES ANAÉËROBIES
lon des cullures anaérobies virulentes, par exemple le Pacille de Nicolaïer. On peut remplir ces tubes avec de la gélutine ou Te l'agar et les ensemencer ensuite par piqûre en cassant une pointe pour quelques instants. Des tubes à essai avec étranglement (fig. 121) remplis de bouillon, ensemencés et fermés à la lampe, même sans ébullition préalable, suffisent pour culver les anaérobies peu exigeants. On peul en somme combi- . ner les méthodes 8° avec celles décrites à 2°.
4° Cultures sur des milieux exposés à l'air mais additionnés de substances très oxydables. — Kirasaro et Weyr (1590) ont proposé d'ajouter à la gélose peptonée des subslances Lrès oxydables telles que : le formiate de soude, le sulfindigotate de soude, le pyrogallate de potasse, le chlorhydrate d'hydroxylamine, la résorcine, l'hydroquinone, ete. Dans le même but, Linomvs ajoutait à la gélose une certaine quantité de glycose. Le milieu le plus employé est ainsi fabriqué :
Gélose peplonée. , . . . . . , . , . 1000 grammes. iv PNA EE AT PTE 20 — Sullindigotate de soude. . . . . . x 1
Cette gélose, de couleur bleu-noir, est coulée dans un tube à essai jusqu'à quelques centimètres du bord. L'ensémencement se fait par piqûre aussi profonde que possible, avec une longue aiguille de platine. Les lubes ensemencés sont mis à l'étuve à + 38°. Au bout de quelques heures, des gaz abondants sû produisent, qui peuvent mème faire sauter le bouchon de ouate. La gélose se décolore ; le glucose et le sulfndigotate s'oxydent sous l'influence du développement microbien (le même phénomène se produirait à la longue sans culture) et s'emparent de l'oxygène dissous ; le tube bleu noir passe au jaune foncé, l'indigo bleu s'étant transformé en indigo blanc,
On peut également se servir, dans le même but, de gélose ordinaire additionnée de 0,5 p. 1000, de formiate de soude, où colorée en violet par quelques gouttes de teinture de tourne= sol.
Fig. 4193.
Appareil de Tuuno.
. Le petit tube (A) chargé d'agar ensebie, bouché à la ouate, est soutenu dans un support en fil de fer (C) où un rese solution alcaline d'acide pyrogallique pyrogallique dans 10 centimètres cubes otasse caustique à 10 p. 100) est versée est fermé à frottement par un bouchon de est mis dans une étuve à + 30°, De primées fréquemment au tube activent
190 CULTURE DES ANAËROBIES | l'absorption de l'oxygène. Bucaxer a pu cultiver ainsi le Vibrion
Turno (1902) emploie le dispositif représenté figure 423. Il s'agit d'un tube à culture (a) dont le col (ec) est entouré d'un ballon (b) destiné à contenir l'acide pyrogallique.
6° Cultures dans des milieux dont l'oxygène est
| absorbé par des microbes aérobies. — L'utilisation de e l'oxygène libre par les microbes aérobies peut
| faciliter la culture des anaérobies: les aérobies remplissent le rôle de substance oxydable. Dès 1886, Lisomuus avait obtenu des
A cullures anaérobies sur gélatine recouverte d'une culture des microbes dela putréfaction.
Roux (1887) a institué l'expérience de la façon suivante :
On met dans un tube à essai bouché à la ouate quelques centimètres cubes de gélose; on fait bouillir et refroidir rapidement dans l'eau froide. On ensemence l'anaérobie par
Fig. 4%. piqûre aussitôt la solidification effectuée. On Dispositif de sa Yerse sur la gélose une pelite quantité de Lowoxsex pour gélatine liquide qu'on laisse également solila culture des difier. On verse ensuite sur la gélatine quelques gouttes d'une culture d'aérobie, de Noble. Bacillus subtihs par exemple. On ferme le tube à la lampe et on dépose dans l'étuve à 380, L'aérobie consomme tout l'oxygène et l'anaérobie se oppe bien. 11 faut casser le tube pour prélever de la noi robie non contaminée par le B, subtilis.
onvénient n'existe pas avec le dispositif représenté re 124 ot dû à Sazomoxsex. Le petit tube (A) chargé de est destiné à l'anaérobie ; le grand (B), chargé de bouilnencé avec un aérobie. On ferme à la lampe en (a) et Nicouas! sont arrivés, les premiers, à cultiver un
nr et Nicocas, De l'influence de certains microbes aéro-
si
on mécanique de l'oxygène des ures d'anaérobies.
e atmosphère confinée dont l'air a par un gaz inerte. — Un appareil pas indispensable pour chasser l'air d'un Il peut être remplacé par le refoulement n gaz inerte. Wôrrz a proposé, en 1889, | harge de gélose un tube à essai et on le de caoutchouc muni de deux tubes de | , Le tube (A) eflleure la gélose et est tube de caoutchouc qui amène du gaz | passer le courant de gaz pendant cinq | temps qu'on fait bouillir la gélose à l'aide | empêcher qu'elle ne s'imprègne de gaz.
s on verse par le pelit entonnoir (B} es de pétrole stérilisé. On enlève le bou-
et la végétation des anaérobies, Arch. de
ce procédé pour obtenir en grand las fer NT l'air libre.
102 CULTURE DES ANAÉROBIES
chon de caoutchouc et on le remplace par un tampon de ouale, Pour ensemencer, ‘on incline le tube de façon à meltre à nu la moitié de la surface de la gélose, et on fait la pigüre au moyen d'un fil de platine monté sur la paroi d'un tube en verre (C) en rapport lui-même par un tuyau (D) avec une con-
Fig. 125. » Fig. 126.
Appareil de Wurlz pour la eul- Appareil de Rour pour la culture des anaérobies dans un ture des anaérobies dans un
gaz inerte (le gaz d'éclairage). gaz inerte.
duite de gaz qui reste ouverte pendant tout le temps de l'opération.
Pasreun avait déjà employé l'acide carbonique dans lé même but. Ce gaz, ainsi que le gaz d'éclairage, peuvent être nuisibles à la culture de plusieurs microbes (Faæxkez, Kianakis, 1890) et doivent donc être rejetés de la technique générale.
Roux a indiqué un procédé beaucoup plus simple de refoulement de l'air par un gaz inerte. La gélatine nutritive est contenue dans un tube à essai, éliré à sa parie supérieure en un tube assez mince pour qu'il soit facilement fermé au chalumeau, el fermé par un lampon de coton (fig. 126), On liquéfie
e avec récipient de sûreté R, C.
et le tube à vide (B), pour éviter les ce dernier. On peut y suppléer en la trompe un flacon à deux tubu-
peut se dispenser d'avoir des récipients ures dans le vide. 1 suffirait de placer s pour les cultures aérobics sous des On compléterait le vide pneumation d'on vase contenant un milieu pyrogallique par exemple.
de ce dispositif tient dans la difficulté dans l'étuve et de trouver une st
196 CULTURE DES ANAÉËROBIES stance d'ajutage qui maintienne la fermeture hermétique des
joints à + 47.
On peut aussi utiliser l'étuve à vide de Wiesneeg, 1 représentée page 845, figure 3741.
Aussi prélère-t-on faire directement le vide dans : les récipients eux-mêmes, Les récipients destinés À aux culturés qui pousseront dans le vide, doivent remplir une condition essentielle : ils auront des parois suffisamment épaisses et des ajutages assez parfaits pour pouvoir lenir le vide sans se briser. a. Récipients à cultures anaérobies liquides. — On se servait autrefois du £ube Pasteur simple ou double (Ag. 9). Nous employans continuellement la pipette a boule ‘ (fig. 129) munie de plusieurs rétrécissements séparant deux ou trois bouchons de ouate. Ce pelit appareil peut servir autant de fois qu'il possède de rétrécissements et de tampons ; il est très commode. La forme courbée de sa pointe effilée à cependant l'inconvénient de le rendre encombrant dans une éluvé el par conséquent fragile. 11 ést bon d'avoir dans la chambre éluve une pelile caisse dans laquelle sont placées (la pointe effilée en bas, pour que la culture ne touche pas le coton) toutes les pipettes à boule. Nous avons fait construire une planche à supports, spéciale pour cet usage.
Pour charger un tube Pasteur ou une pipette à boule (préalablement stérilisés au four Pasteur où à Fig. 429. l'autoclave), il Pipelte à boule pour la culture des anaérobies faut d'abord en bouillon ensemencer le
* IL faut nécessairement introduire les tampons de ouate successivement avant de faire les rétrécissements suivants, C'est donc la fabricant de pipettes qui doit plac
n place, on fait le vide. Bientôt Giny jutage), de nombreuses bulles d'air se tube et viennent éclater à la surface tif se purge donc d'air, par celle besoin d'avoir recours à l'ébullition à l'opération en chauffant érès légèrement LE de serrer la boule dans la main $ ent avec rapidité ; ce pelit artifice est.
ÉRdtaiseslehaes la bulle d'air qui à l'extrémité effilée de la pipette à
d sa place et choque le fond du tube e qui indique le vide. Lorsque celui-ci tubes Pasteur, d'écarter la
P da Ag uit l'empècherait de plonger dans simple eu ramollissant la soudure à la
198 GULTURE DES ANAÉROBTES
… estaussi parfait que peut le fournir l'apparéil employé, on scelle à la lampe le rétrécissement le plus rapproché de la machine pneumatique et la culture est prête à être mise à l'étuve. 1 faut avoir soin de fermer le robinet qui commande le rééipient, avant de sceller ce dernier. Le rétrécissément sera étiré avec une rapidité suffisante pour empêcher l'air atmosphérique de crever le verre et d'envahir le tube; il se produit presque toujours une petite dépression en ombilic qui Lémoigne de la réalité du vide.
11 doit Loujours rester un tampon de coton dans le tube Pasteur ou dans la pipette pour permettre de réensemencer plus tard avec pureté la culture obtenue. Supposons que l'élève veuille propager une culture anaërobie ayant végété en pipette à boule : 411 faut d'abord briser avec une pince l'extrémité scellée qui avoisine le tampon de coton ; l'air se précipite dans le tube; mais, filtré à travers le coton, retenu par l'étranglement, il ne peut contaminer le bouillon. Ce premier temps est indispensable ; si on ouvrait d'abord l'extrémité chargée de liquide, l'air pénétrerait directement dans celui-ci et le souillerait de tous les germes qu'il contient, en même temps qu'il le projetlérait contre le coton ; 2° Le second temps consiste à déboucher un petit ballon stérilisé qu'on place dans un cristallisoir ; 3° Le lroisième temps est le plus délicat : il faut stériliser le tube effilé jusqu'au coude, en le passant plusieurs fois dans la flamme d'un bec Bunsen, tout en ayant soin de ne pas trop chaufer le liquide de culture dont les microbes ne doivent être ni Lués, ni atténués. On casse alors la pointe avec une pince flambée, et on l'introduit immédiatement dans le petit ballon qui recoit toute la culture ; 4 L'ensemencement se fait. alors comme pour les cultures aérobies, et ainsi de suite. Le cristallisoir est destiné à recevoir les quelques gouttes de eulture qui peuvent tomber de la pipette avant son introduction dans le ballon et qui souilleraient le laboratoire ; la stérilisa= lion du tube jusqu'au coude est utile dans les cas où, la pipette étant tenue Ju pointe en l'air, une goutte de culture viendrait couler sur la surface extérieure jusqu'au coude qui est la partie la plus déclive, et retombérait ensuite dans le petit
ns. il
Fig. 14.
Dispositif pour les cultures en
bouillon dans des tubes à essai.
strarel
chargé de bouillon et ensemencé.
remplace alors le tampon de ouate.
un bouchon de caoutchouc (C) percé ce central, lequel donne passage ‘ins de verre (B)muni d'un tampon ouate situé entre deux rétrécissements.
bouchon de caoutchouc a été stérilisé é à 4 p. 100; Le tube de verre a été
Es.
200 CULTURE DES ANAËNOBIRS
stérilisé par la chaleur. La fermeture est rendue hermétique par un vernissage à la gutta-percha (dissoute dans le chloroforme) ou au moyen de cire à cacheter, On opère alors exattement comme avec un tube Pasteur ou une pipelte à boule, et on ferme le tube de verre à la lumpe.
Les dispositifs précédents ne permettent pas d'obtenir des cultures liquides on grandes quantités, comme cela est nécessaire dans certains cas (exemple:
la préparation des toxines du Bacille de Nicolaïer en vue de l'immunisation des grands animaux pour la récolte du sérum antiloxique). On sé servira alors de grands flacons de un ou deux litres (tig. 432), Un bouchon en caoutchouc (b) livre passage à un tube de verre (c) présentunt deux étranglements entre lesquels est, pour plus de sûreté d'asepsie lors de l'ouverture, un tampon d'onate, Un second tampon d'ouate (a) volumineux ferme le goulot au-dessous du
Fig. 432. bouchon et suffirait à fillrer l'air de
Es na Le rentrée, lors de l'ouverture. Les joints
£a | res du bouchon sont enduits de cire d'Es-
d'un anuérobie. pagne. Les temps de l'opération sont
exactement les mêmes que pour le tube à
essai fermé avec un bouchon dé caoutchouc. Le tube (c) sert à faire le vide et est fermé à la lampe.
J'ai fait construire, chez Alvergniat, trois récipients en verre destinés à obtenir de grandes cultures liquides, ow à contenir plusieurs récipients ordinaires, ou à conserver des toxines dans le vide. Je voulais pouvoir constater journellement l'existence du vide, au moyen du manomètre, et pouvoir compléter ce vide, sans démonter l'appareil; je voulais pouvoir prélever des toxines et refaire immédiatement le vide. I] fallait, pour cela, des récipients lout.en verre,
et manne du bouchon est remplie par un tam
re (b) retenu par une süillie (c) du bou=.
mercure les entonnoirs (C) et (E)
le {D) à un appareil pneumatique, et on met à l'étuve. Si le mano
filtré par le lampon de ouate (t), on
Me par (D); on recueille la quantité erme la pipelte; on refait le vide.
) est une espèce de cloche destinée &
Fig. 3 Le tube de Roux de la 19m moment de
206 CULTURE DES ANAËROBIES
On ensemence la pomme de terre, am ferme à la lampe la partie supérieure, on fait Le vide par la branche latérale qu'on ferme aussi (fig. 140).
9° Cultures dans le vide comblé par un gaz inerte. — Les méthodes de culture où le vide est obtenu par une
