B) ANALYSES PAR CULTURES EN MILIEUX LIQUIDES

La méthode d'analyse par cultures liquides date des mémorables expériences de Pasreun et Jounenr, en 1878. MrovBE Cuauveau et AnLoixG ont perfectionné les détails.

Les différents procédés se partagent en deux groupes. Dans un premier groupe, l'eau est puisée directement dans la pipette qui servira à la répartir dans les ballons de bouillon; il faut alors que la pipette soit très eflilée pour donner des gouttes très fines, a à de centimètre eube, c'est le procédé de Cuauvxeau et AnLowG, employé à Lyon depuis bientôt vingt ans. IL est le procédé de choix, à condition toutefois quel'eau ne soit pas trop impure, car on ne peut obtenir des gouttes inférieures à un certain volume. Le second groupe comprend tous les procédés où on fait une dilution préalable de l'eau à analyser dans de l'eau stérilisée pour qu'une goutte moyenne ne contienne que très peu d'eau microbienne. Ce sont les procédés de Miquer, de Fou et Duxanr. En principe, il faut arriver à ce que chaque ballon ne soit ensemencé qu'avec un seul microbe; si donc l'eau est peu riche, il suffit de la fractionner en gouttes très fines; si l'eau est très impure, il faut la diluer. Lorsqu'on peut éviter la dilution, le procédé de CHauveau et AnLoixc est incontestablement le meilleur.

Pour choisir un des procédés précédents et pour savoir (au cas où on s'adresserait au second groupe) quelle dilution il fautemployer, il est indispensable de procéder à une analyse préalable sommaire, indiquant la richesse microbienne approximative de l'eau. Cette analyse préalable sera aussi utile pour les méthodes sur milieux solides.

Miovës pratique cette analyse préalable de la façon suivante.

Me

Un ensemence des ballons de bouillon, les uns avec une goutte de l'euu suspecte, d'autres avec une goutte de l'eau diluée au 100, d’autres avec une goutte de l'eau au 1000°, d'autres enfin avec une goutte de l'eau diluée au 1 000 000° ou même plus. On met les ballons à l'étuve et on les examine au bout de vingtquatre heures. On choisira la dilution correspondant à celle dont les ballons sont restés clairs en majorilé. Si, par exemple, tous les ballons ensemencés avec une goutte de la dilution à 4/100° sont troubles, et que 8 sur 10 des ballons ensemencés avec une goutte de la dilution à 4/1000° soient restés clairs, on choisira la dilution à 1/1000°. Si un dixième seulement des ballons ensemencés avec l'eau pure est trouble, on se passe de dilution el on choisira le procédé de CHAuvEAU €t ARLOING. Il va sans dire que le procédé de Crauveau et AnLorne s'applique surtout aux inalyses où on peut aller faire soi-même le puisage, en raison de la délicatesse des pipelles; on peut néanmoins l'émployer en puisant dans l'échantillon envoyé au laboratoire.

G. Roux fait des dilutions variant de 1/10° à 14/1000, et ensemence { centimètre cube des dilutions dans deux ou trois tubes de gélatine liquéfiée et étalée sur une portion de la paroi du tube maintenu horizontal. Au bout de trois on quatre jours, on compte les colonies. Le gros inconvénient est de nécessiter une attente de quatre jours lorsque le même échantillon (maintenu naturellement à la glacière) doit servir à l'analyse définitive.

Il faudra toujours, autant que possible, faire un nouveau puisage pour l'analyse ultérieure.

4" Procédé de Chauveau et Arloing. — Son grand avantage est d'éviter toute cause de contamination ; l'eau est direetement puisée dans une pipette stérilisée, et n'en sort que pour tomber dans les ballons de bouillon, fractionnée en gouttes très fines. La pipette, fabriquée ainsi que nous allons l'expliquer, est stérilisée et privée de la plus grande partie de son air au moyen du chauffage ou de l'aspiraion par une trompe et scellée à la lampe. Elle est transportée au lieu de lu prise ; l'extrémitén

etlilée est plongée dans l'eau et brisée à ce moment avec une pince ou des ciseaux slérilisés. L'eau se précipite jusqu'à une certainé hauteur sans jamais atteindre le coton; si le vide n'avait pas élé fait on pourrait aspirer avec un tube en caoulchouc. Lorsque la pipette est suffisamment chargée, on la retire | et on scelle à la lampe son extrémité effilée. Il faut avoir soin, |

. Fig. 213.

Pipelle de Chanveau el Arloing en place pour l'ensemencement en ballons de bouillon de l’eau à analyser. |

avant de retirer la pipette de l'eau, lorsqu'elle est assez remplie, |

de briser la grosse extrémité de la pipette pour permettre la

rentrée de l'air à travers le coton et empécher ainsi qu'il ne

pénètre par l'eflilure avant que celle-ci soit scellée hors de

l'eau. | IL s'agit, alors, de répartir cette eau dans des ballons ou tubes

de bouillon ; on le fera de préférence sur place, aussitôt après

lé puisage, sinon on transportera la pipette dans un manchon

de glace. Pour faire l'ensemencement sur place, des tubes de

bouillon sont plus faciles à transporter que des ballons. La

répartition exige un support métallique (A) destiné à mainte-

nir la pipette (B) légèrement inclinée dans une position qui restera la même pendant toute l'expérience (fig. 218). Une pincé, une lampe à alcool, un tube de caoutchouc du diamètre | de la pipette complèteront l'outillage. La pipette a été jaugée, l comme il sera dit plus loin, et des traits à la lime indiquent | les 1/4 de centimètre cube. On se lient prêt, ayant à portée de | la main gauche un panier métallique contenant les tubes de | bouillon, à portée de la main droite un panier vide pour recevoir les tubes ensemencés; on prend le caoutchouc (C) entre | les lèvres et on brise la pointe effilée qui est ensuite soigneusement flambée. On souffle par le tube de caoutchouc et on laisse tomber des gouttes (sans les compter) jusqu'à ce que l'eau affleure un des traits de lime.'A ce moment, prenant un à un de la main gauche les tubes de bouillon dont on flambe l'orifice après que la main droite a enlevé et conservé en l'air le tampon de coton, on fait tomber dans chacun d'eux une seule goutte de l’eau de la pipelte. On reflambe, on rebouche et on place dans le panier de droite. Il fauten général souffler pour faire tomber la goutte, en raison de l'extrême capillarité de la pointe de la pipette; c'est-à-dire qu'on aura tout le temps de passer d'un tube à l'autre avant la chute de la goutte suivante. Si toutefois une ou plusieurs gouttes se perdaient, on les noterait mentalement, ou sur un papier mis à portée de la main droite. Lorsqu'on a ainsi ensemencé 150 à 200 tubes de bouillon, on continue à faire tomber des gouttes, en les comptant, jusqu'à un trait de lime. Additionnant alors le nombre de tubes employés et celui des gouttes perdues ou tombées à la fn, on a le chiffre des gouttes correspondant au nombre de divisions des graduations de la pipetle. Supposons un cas moyen, On a ensemencé 150 tubes, et il a fallu faire tomber encore 25 gouttes pour arriver à une ligne de la pipette; on a utilisé 5 divisions de la pipette, soit 41/4 (chaque division valant 4/4 de centimètre cube). 175 gouttes pour {ce, 25 don: ment exactement 140 goultes au centimètre cube. Chaque tube a donc été ensemencé avec 1/140° de centimètre cube. Une note ce chiffre, la nature de l'eau, la date de l'ensecement. On rentre au laboratoire, on place les tubes à

+ 38°, et on attend huit jours avant de faire la numération des tubes fertiles. Les raisons pour lesquelles il fant attendre huit jours seront développées à propos du procédé de Miove. Supposons que 50 tubes sur 150 soient Lroubles, on a le nombre de microbes par centimètre cube (x) au moyen d'une simple proportion:

L'eau en question contient 46 à 47 microbes par centimètre cube, soit 46 666 microbes par litre.

Nous répélons que ce procédé est parfait lorsque l'eau n'est pas trop riche en microbes, On verra plus loin (procédé de Miquer) quelle proportion de tubes doit rester claire pour que l'analyse soit exacte, c'est-à-dire pour que chaque tube n'ait réellement reçu qu'un seul microbe. La pipette doit donner des gouttes équivalant à 1/120° de centimètre cube au maximum ; on peut arriver à oblenir des fractions encore plus: petites que 4/150° de centimètre cube.

La fabrication de la pipette est le point le plus délicat du procédé. On choisit un tube de verre d'un demi-centimètre de diamètre, de calibre aussi égal que possible dans toute son étendue. On le gradue avec du mercure en quarts ou moitiés de centimètre cube, et chaque division est marquée d'un trait de lime, qu'on noircit à l'encre. On étire alors ce tube en pipettes comme il l'a dit page 20, en ayant soin que l'eflilure soit bien dans l'axe central du corps de la pipette, et non plus ou moins latéralement. On fait un léger rétrécissement à @ ou 7 divisions de l’origine de la partie efilée, on introduit un tampon de ouate peu serré; on fait un second rétrécissement plus marqué que le premier, el on fait stériliser au four Pasteur. Au moment de partir pour faire une analyse on modifle la partie éflilée, qui devient, à dater de ce moment, extrémement fragile: Délaissant le chalumeau, on se sert d'une lampe à alcool. On chauffe au rouge la purtie conique, origine de l’eflilure, et

396 ANALYSE BACTÉRIOLOGIQUE DE L'

on l'étire lentement après l'avoir sortie de la flamme, seconde eflilure a uné eapillarité bien supérieure à la première, elle est très flexible, et paraît même souvent ne pas avoir de canal central, On saura à l'usage la valeur de la goutte Avec | un peu d'habitude on juge à la grosseur de lu pointe les pipettes qui ne donneraient pas des gouttes inférieures & 1/100° de centimètre cube, La seconde ellilure doit, comme Ja | première, être autant que possible dans l'axe du canal de Ja | l pipette et non latérale. Les gouttes qui tomberont d'une telle pipette auront un poids sensiblement égal. On scelle la poînte à 8 ou 40 centimètres de son origine, on chauffe la pipette ou on la mel en rapport avec une machine pneumatique, et on scelle le rétrécissement qui laisse le tampon dans la pipette. Celle-ci est prête à être ulilisée.

L'inconvénient du procédé de Cnavveau et AnLoIxG réside dans la fragilité de la pipette et dans la ditliculté de son transport dans la glace après son remplissage. Aussi vaut-il mieux faire toujours les ensemencements sur place. AnLoënG à fait construire pour cela un nécessaire composé de trois boîtésen bois munies de manettes. L'une est une simple caisse munie d'un couvercle à charnière et surmonté d'une poignée. La hauleur égale 25 centimètres, les dimensions latérales 40 centimètres. Elle est divisée en quatre compartiments par deux cloisons en croix, trois de ces compartiments contiennent troîs paniers métalliques renfermant chacun cinquante tubes chargés de 3 où 4 centimètres cubes de bouillon; le quatrième contient la pince, la lampe à alcool, le caoutchoue, les éti-

| quettes, elc. Des blocs de ouate empêchent tout ballottement,

| La seconde boîte (hauteur 17 centimètres ; dimensions laté-

rales, 35 centimètres) est également divisée en quatre compar-

timents pour loger quatre ballons à fond plat (voy. fig. 23) char- |

gés de gélatine. La troisième boîte est uniquement destinée au |

transport des pipettes dont on emporlera toujours une pro | |

vision pour parer à tout accident. C'est une espèce d'élui plat, Miong de 55 centimètres, large de 45 centimètres, hautde 6cenformé de deux valves en bois dans lequel pénètreà une planchette percée de pelits trous sur laquelle

les pipettes sont fixées parallèlement au moyen de caoutchoues. Deux taquels de la valve qui se referme sur la première rendent la planchètte absolument immobile ; on peut encore garnir avec du coton. Une manette permet de porter celte boîle.

2° Procédé de Miquel. — Dès 1879, Miguez a préconisé la « méthode du fractionnement dans le bouillon » basée sur la dilution de l'eau à analyser dans un volume connu d'eau stérilisée, pour arriver à n'ensemencer qu'un seul microbe en faisant tomber une grosse goutte du mélange dans chaque ballon de bouillon.

C'est surtout pour cette méthode que les modes de puisage, de transport, etc., décrits plus haut sont utiles.

Miouez voudrait que les analyses d’eau soient faites par tous les bactériologistes dans un bouillon invariable et il propose le suivant :

Peptone Chapoteaut . . . Mr 20 grammes.

MDaninE ..: < + : . . : 5 — Cendrés de bois. . . . . . , . - 0 gr. 10.

Laulordinaire .. 4 . , . . . . . . . 1000 grammes.

La dilution de l'ean se fait dans des matras Pasteur à fond plat d'une capacité variant de 30 centimètres cubes à 2 litres, qui sont à moitié remplis d'un volume connu d'eau distillée. On ajoute le volume nécessaire de l'eau à analyser et on agile vivement, On prélève le mélange avec des pipetles jaugées et stérilisées (fig. 214) donnant à peu près 25 gouttes au gramme.

La distribution se fait dans 36 ballons de bouillon, à la dose detgoutte dans 48 ballons et 2 gouttes dans les 148 autres. On ensemence dé même 36 ballons avec les mêmes doses d'une dilution deux fois plus forte. Les 72 ballons sont mis à l'étuve à 9% pendant quinze jours. On compte alors les ballons troubles ét on fait lu numéralion. Pour que l'analyse soit bonne, c'est à-dire pour que, selon toutes les probabilités, la goutte ensemenée wait contenu qu'un seul microbe, il ne faut pas,

d'après Mioue, plus de 30 ballons troubles pour 40 72; s'il yen a davantage, la dilution Une analyse d'eau peut, d'après Miquez, être mise-en train en 20 minutes par ce procédé. Lan | Supposons que 108 goutles d'eau aient été s 72 ballons (36 ayant reçu 4 goutte, | et 36 2 gouttes ; la goutte a de centimètre cube). La dilution | était à 4 /1000. Supposons | lons se soient troublés en quinze jours : 108 goulles d’eau à L renfermaient 46 microbes ; rues représentent 4°,3 environ; de la dilution renferment donc 46 microbes ; l'eau à analyser en contenait 1000 fois plus, soit 46 000, Un centimètre cube en contenait 4,3 moins, c'est-à-dire 3 651,162 environ. L'eau à analyser possédait IN n 361,462 microbes par litre.

“ Appelons G le nombre de gouttes

Lien ts D a ds ensemencées, N le nombre des bal- = :

ÊRus This je tubes à los troubles, T le litre de la solus

essai, lion, en supposant 25 gouttes au

centimètre cube, Appelons Q le quotient — 5 on a la formule générale :

+ x T= = x microbes par centimètre cube.

le res des microbes par litre.

- 3" Procédé de H. Fol. — Il est plus compliqué que celui de vez, sans uvoir sur lui d'avantages marqués.

dilution, au lieu d'être faite dans de l'eau stérilisée, dans le bouillon nutritif qui est à son tour

ceux qui désireraient connaître les appareils ravail des Archives des sciences physiques et

naturelles de Genève (1884). Nous déconseillons cet outillage compliqué.