C) ANALYSE PAR CULTURES SUR MIRIEUX SOLIDES

Le grand avantage de la méthode des cultures sur milieux solides est de bien isoler chaque élément microbien qui donne une colonie séparée; la numération est ainsi plus exacte. Cette exactitude n'est cependant qu'apparente, car nombre de microbes qui auraient pullulé en bouillon ne végètent pas sur gélatine : aussi l'analyse d'une eau sur milieux solides donnet-elle des chiffres toujours inférieurs à ceux de l'analyse de cette même eau en milieux liquides, malgré la possibilité d'introduire deux microbes dans le même ballon de bouillon. La méthode des milieux solides permet une analyse qualitative sommaire par l'examen de la forme des colonies. Nous savons déjà que Kocu en fut l'inventeur.

1° Cultures sur plaques de gélatine ensemencée liquide. — C'est le procédé primitif de Kocn plus ou moins modifié. I n'a rien de spécial. Nous renvoyons pour le manuel opéraloire au chapitre v où nous avons déjà décrit la façon de faire une culture sur plaque de gélatine (page 171). Il suflira de mettre dans chaque tube de gélatine une quantité connue de Veau à analyser plus ou moins diluée suivant les cas. Le nombre de colonies développées donnera le nombre des microbes contenus dans la quantité d'eau ensemencée.

La plaque de Koch peut naturellement être remplacée par le tube d'Esmarch, la boîte de Petri! et tous les autres appareils perfectionnés décrits au chapitre v. Lorsque nous employons la gélatine, nous nous servons de ballons en entonnoir renversé, à large fond plat, à petit orifice (fig. 24) dans lesquels la gélaline est stérilisée. On verse une quantité d'eau connue daus la

Lfuersen (1890) fait ses analyses sur gélatine en répartissant cellesci dans des godets de verre trés analogues aux boîles de Petri et qui sont antérieurs à la découverte de Perm, puisque Nicari et Rierscn les ont décrits en 1885.

En.

400 ANALYSE BACTÉHIOLOGIQUE DE L

gélatine liquide, on agite et on laisse prendre le s'étale en couche mince sur le fond. On peut points à l'encre, sur la face inférieure du fond les apparaissent. On peut aussi décalquer le fond sur pe: de papier où on dessine jour par jour les colonies à mesure qu'elles apparaissent. On fera aisément la n çant sous la plaque une feuille quadrillée, où en ‘traçant à l'encre des lignes perpendiculaires qui formeront un utile même très irrégulier. On comptera carré par carré. Ces quadrillés feront aussi des points de repère précieux. ® | Un inconvénient sérieux des cultures sur gélatine des microbes des eaux réside dans le grand nombre de colonies | liquéfiantes qui en quelques jours envahissent toute la plaque | |

ét mélangent toutes les colonies, Pour y remédier on peut employer de la gélatine-gélose (page 144) ou la formule de Gmano; ces milieux liquéfient moins facilement. Voici la for: mule de Gran : :

1000 grammes, NE d gr, 02

Eau Gélatine blanche Phosphate de soude . . .

| On clarifie avec un blanc d'œuf, on fait bouillir, on filtreret | on stérilise à + 116%,

G. Roux arrête le développement des colonies liquéfantes à | mesure qu'elles se forment en les vernissant avec du stérésol (de Bentoz) qui arrête le développement de la colonie sans diffuser sur toute la plaque de gélatine.

La boîte de Petri ou le tube d'Esmarch sont plus commodes que le ballon conique pour aller puiser les coloniesetles réen-

mettant une très petite goutte d'eau dans chaque ‘récide gélatine on peut éviter les dilutions. 11 suflit, èn tout ‘avec trois tubes de gélatine comme il a été dit

JuE plaques ds gélatine ou de géloss; anse après solidification. — C'est le

procédé d'Arloing. I a surtout pour but d'éviter la contamination de la plaque par des germes étrangers à ceux de l'eau à analyser. On laisse tomber en des points symétriques une série de gouttes d'eau sur la surface d'une plaque de gélatine ou de gélose solidifiée ; toute colonie développée en dehors des points ensemencés ne sera pas comptée dans la numéraltion,

Ps

Analyseur bactériologique d'Arlaing.

Ce procédé repose tout entier sur l'emploi d'un analyseur bactériologique spécial*. Cet appareil (fig. 215) consiste en une boîte rectangulaire en cuivre nickelé longue de 25 centimètres sur 8,5 dé largeur et 3,5 de profondeur. Le couvercle est formé de deux lames de verre (5 et 6) mobiles autour de charnières fixées aux deux bords externes les plus étroits. Uñ intervalle de quelques millimètres sépare les deux lames etest occupé par un couvre-joints en métal (3) glissant: sans froltement et présentant à son milieu un orilice étroit (T} entré

L'AnLoxc, Appareil pour l'analyse hactériologique des eaux, Revuë d'hygiène, 4888, p. 475. 14 PRÉCIS DE BACTÉMIOLOGIE 2° édit. 26

Me

deux languettes métalliques souples (a,a). Une cuivre, de la dimension des plaques de verre aûù fond de la boite, munie d'une crémaillère qui est aétionnée par le bouton (7). Quatre montants prismaliques (c,c) servent à maintenir la plaque de verre. L'index (8) sert à mesurer l'avancement de la plaque; deux erans du bouton (7) font avancer la crémaillère de 4 centimètre. A une des extrémilés de la boîte est une forte plaque de cuivre munie d'une cou- } lisse; elle porte la tige (2), destinée à tenir la pipetle, el une crémaillère actionnée par le bouton (9). Cette seconde cré- | maillère se meut perpendiculairement à la première et sert à déplacer laléralement la pipelte. La plaque de verre à 12 centimètres de long sur 5 centimètres de large; elle est divisée en soixante carrés par un quadrillage. On stérilise la boîte et on introduit la plaque chargée de gélatine solide par une petile porte opposée au bouton (9). La pipette (4) qui contient l'eau à analyser est fixée à la tige (2) et son extrémité effilée pénètre à frottement entre les tiges (a) dans le trou (T). Dès qu'une goutte est tombée au milieu d'un carré on tourne de deux crans le bouton (7) et on fait ainsi tomber une goulle au centre de chaque carré, La première ligne ensemencée, on déplace latéralement la pipelte, qui entraîne le couvre-joint (3), au moyen du bouton (9), On a ainsi une plaque quadrillée de gélatine ayant reçu une goulte d'eau au centre de chaque carré.

G. Roux a simplifié le procédé d'Ancoxc en se servant d'un it appareil dans lequel la pipette est immobile, landis que

Ja plaque de gélatine se déplace circulairement.

rocédés approximatifs de Miquel. — Miguxs décrit nom deux séries d'opérations approximatives qui peudes services.

est le suivant : l'aire végéler les colonies sur un imprégné de gelée de lichen qui, traité ensuile ne se colorera qu'au niveau des colonies. On détails de la préparation de ce papier dans le Montsouris pour 4886, p. 519 et suivantes.

Nous ne parlerons que du procédé le plus simple décrit en 1890: Le papier nutritif, taillé en rectangle et muni d'un fil suspenseur en platine, enveloppé de papier Joseph, est mis à l'autoclave pendant une heure à + 110°. Au moment de l'ana- 1yse, on le suspend par le fil de platine dans une éprouvette bouchée à l'éëmeri. On le tare très exactement et on le plonge dans l'eau à analyser. En cinq minutes la gelée est gonflée, imbibée d'eau. On le remet dans l'éprouvette et on fait une seconde pesée qui donnera le poids de l'eau absorbée. Le tout ést alors mis à l'étuve. Au bout de quinze jours, on relire le papier, on le dessèche bien + 45°, et on le plonge pendant quelques minutes dans une solution aqueuse d'alun cristallisé, puis dans de l'eau pure. La gelée est alors plus mordante. On a préparé un second bain colorant de la façon suivante : 2 grammes d'indigotine cristallisée ont digéré pendant vingtquatre heures dans 50 grammes d'acide sulfurique fumant ; on ajoute up litre d'eau; on neutralise. On trempé le papier dans ce second bain ; il se colore tout entier, les colonies en plus foncé. On lave à l'eau et on met dans une solution de permanganale de potasse à <& pendant une demi-heure, La gelée de bléu est devenue violette, puis rose. On lave. On trempe dans une solution faible d'acide oxalique à 3 ou % p. 100, On Jave. Les colonies tranchent en bleu sur le papier redevenu blanc, Miquez a reproduit ces feuilles dans l'Annuaire de Montsouris pour 1886. L'indigo est une couleur très fixe : aussi, loin de se décolorer, ces feuilles se foncent-elles à la lumière.

On compte les colonies bleues et on les rapporte à la quantité d'eau employée.

4 Numération des colonies par la photographie. — G. Roux a proposé d'enregistrer les colonies de la plaque de gélatine en appliquant celle-ci sur un papier sensible. La gélatine est répartie à la dose de 2 centimètres cubes dans de larges tubes à essai comme pour la méthode d'Esmarch, Après l'ensemencement, on couche les tubes horizontalement sur une planchette munie à ses deux extrémités d'encoches demicirculaires. La gélatine est donc en plaque plane et non enrou-

Le

HU lée. Lorsque les colonies ont apparu, on glisse sous l'ensemble | des tubes un papier sensible au ferrocyanure de potassium

eton met le tout à la lumière (pas trop vive pour éviter Ja ful sion de la gélatine). Lorsque le papier est gris bleu, on le | retire brusquement, on le lave à grande eau et on laisse sécher,

Les plus petites colonies se détachent en blanc sur fond bleu. | On répète cette opération Lous les deux ou trois jours et on | conserve lous ces documents datés.

| L'analyse qualitative, avons-nous dit, est le but vers lequel doit tendre le bactériologiste chargé d'examiner une eau au point de vue microbien, Il est plus important de savoir le nombre et le nom des espèces microbiennes contenues dans | une eau que de calculer le nombre des individus non déterminés qui la souillent. Malheureusement, la classification des microbes, la détermination de l'espèce, se heurtent, comme nous l'avons développé dans l'Introduction (p, 6), à des difficultés presque insurmoutables, Si on réfléchit, en outre, que nombre de microbes (B. tuberculeur, Gonocoque, etc.) ne poussent pas sur les milieux ordinairement employés pour les analyses d'eau, que beaucoup de microbes pathogènes nous sont totalement inconnus, on se rend compte de la prudence avec | laquelle doivent être rédigées les conclusions d'une analyse qualitative, Enfin l'analyse qualitative, n'ayant pas de technique fixe, mais exigeant de celui qui l'entreprend une foule de connaissances non seulement en bactériologie pure, mais en phy- #iologie, en chimie, en pathologie, etc., aura la valeur de celui qui l'a dirigée, bien différente en cela de l'analyse quantita- Mive qui, suivant l'expression de Miouer, peut être faite par un bon garçon de laboratoire.

de l'analyse qualitative serait l'énuméralion de toutes espèces contenues dans un échantillon d'eau; cette analyse générale suivrait donc forcément l'analyse quantiaurait isolé les germes, On se contente en général

de l'analyse qualitative spéciale, c'est-à-dire de rechercher si une euu contient tel microbe pathogène donné.