CHAPITRE II

. Nous donnerons dans ce chapitre quelques renseignements sur les métliodes analytiques les plus usitées pour le dosage des éléments du sang; nous décrirons ensuite les procédés qui servent à déterminer quelques uns des principes dont il importo le i>lus de connaître les variations : l'hémoglobine, Turée, le sucre, etc.

§ 1. — Analyse générale du sang

1° Plasma et globules. — Nous décrirons les procédés de Hoppe-Skyler, Bun(;e, Boichard et Gautikk.

a. Procédé de Hoppe-Seyler. — Hoppe-Seyler reçoit lé sang dans dix fois son volume d'une solution salée à 2,7 p. 100 ; les globules se déposent, il les lave avec la liqueur salée et dose ensuite l'albumine dans ces globules. Il dose également Talbumine totale du sang défibriné (sérum et globules). En dernier lieu, il recueille le sérum d'un troisième échantillon de sang qu'il fait coaguler, et détermine ensuite l'albumine de ce sérum.

Si, par exemple, on trouve :

\^^^fil d'albuminoïdes dans les globules de 100 gr. de sang,

18PS90 — 100 gr. de sang défibriné,

6gr,77 — 100 gr. de sérum,

on pourra écrire, en appelant Q la quantité de sérum de 100 grammes de sang, et 3,83 étant la différence 18,90 - 15,07 :

Le sang contient donc 56,6 p. 100 de plasma et, par conséquent, 100 — 56,6, soit 43,4 p. 100 de globules.

b. Procédé de Bunge, — Quand il s'agit d'un sang dont toute la soude est contenue dans le plasma (porc, cheval), on peut doser la soude dans le sang total et dans le sérum, pour en déduire la proportion de ce dernier.

Si le sang complet contient 0g«',2406 NVO p. 100, et le sérum — 0g»-,4272 — — ,

on pourra écrire, Q étant la quantité inconnue de plasma:

0,2406 0,4272 ^ 0,2406 ,^^ . .^^ — Q- = -iôô~ ^" Q = ô;4272- ^ *^^ = '^^^ P- *^^-

On aura, par suite : 100 — 56,3 = 43,7 p. 100 de globules. Cette méthode exacte n'est malheureusement pas générale.

c. Procédé de Bouchard. — Bouchard partage le sang à analyser (30 grammes environ) en deux parties égales qu'il verse dans deux capsules tarées, dont l'une a reçu au préalable 10 grammes d'une solution de sucre de canne à 1026 de densité. Après vingt-quatre heures, on prélève 4 grammes du sérum qui s'est formé après la coagulation et on y dose les albumines par ébullition on liqueur acide, filtration et pesée.

L'analyse du sérum pur donne a grammes pour 1 cent. cube. — sucré 6 — —

Le poids total d'albumine dans chaque capsule sera respectivement : ax et b {x + 10), x étant la proportion de sérum de 15 grammes de sang; et comme la teneur des deux capsules est la même, on a :

, / . .«s ., ^ 10 6 ax = b X + 10), d ou x = T'

On en déduit la proportion de plasma pour 100 grammes de sang et, par différence, celle des globules.

d. Procédé de Gautier, — On doit à Gautier une méthode très précise qui consiste à recevoir le sang (30 grammes environ) dans un vase contenant 30 centimètres cubes d'une solution à 12 grammes de sulfate de magnésie et 16 grammes de chlor-

hydrate d'ammoniaque par litre. L'appareil est pesé avant et après l'arrivée du sang ; on a donc le poids exact de ce dernier. On refroidit ; les globules se déposent ; on les filtre, en refroidissant, sur un papier dont on connaît le poids : i® quand il est sec; 2® quand il est imbibé de la liqueur ammonÎAComagnésienne indiquée ci-dessus. On lave deux fois les globules avec cette môme solution, on essore en étalant le filtre sur du papier buvard, et on pèse. En déduisant le poids du filtre sec et de la liqueur qui Timprègne, on a celui des globules, plus celui de la liqueur qu'ils retiennent. Pour déterminer ce dernier élément, ou chasse Tammoniaque par le carbonate de baryte, à chaud, et on la reçoit dans un volume connu d'acide sulfurique titré, qu'on retitre après l'opération. De l'ammoniaque trouvée, on déduit la quantité de solution retenue par les globules ; une soustraction donne la proportion de ces derniers et, par différence, celle du plasma.

2^ Matières albuminoldes totales. — On opère sur 30 grammes de matière, en moyenne ; le procédé s'applique aussi bien au sang complet qu'au sérum ou aux globules isolés. On coagule l'échantillon par quatre volumes d'alcool acidulé de 3 à 4 gouttes d'acide acétique ; on jette sur un filtre et épuise successivement à l'alcool, à l'alcool élhéré et à Feau bouillante ; on sèche à 100<* et on pèse.

L'alcool a enlevé un peu d'albumine, qu'on récupère en évaporant à siccité, au bain-marie, et reprenant par l'alcool éthéré qui a servi au lavage du premier précipité. Cette petite quantité d'albumine est recueillie et pesée. La somme des deux poids donne l'allnimine totale, qu'on peut, pour plus d'exactitude, incinérei*, afin d'en déduire le poids des cendres (Gautier).

3® Matières extractives et sels. — Les divei-ses liqueurs (alcool, alcool éthéré, eau bouillante), évaporées séparément et convenablement traitées, permettent d'isoler et de doser les matières extractives, la cholestérine, les graisses, l'urée, le sucre, les sels. Ceux-ci se doseraient mieux par l'incinération directe du sang, évaporé et desséché au préalable.

4" Fibrine. — Le dosage de la fibrine s'effectue en battant avec un petit balai d'osier un échantillon de sang dont le poids est connu. Les fragments de fibrine sont réunis dans un nouet, qu'on lave à l'eau froide. La fibrine, complètement décolorée, est ensuite lavée à l'eau pure, à l'alcool, àl'éther, enfin desséchée à H0<*, et pesée.

§ 2. — Dosage de quelques éléments spéciaux

1** Hémoglobine. — On la dose par les méthodes chimiques ou optiques.

A. MÉTHODES CHIMIQUES. — On incinèrc au rouge sombre naissant un poids exactement déterminé de sang ; on reprend par l'acide chlorhydrique dilué, on réduit par le zinc bien pur et on titre au permanganate.

On peut aussi ajouter du sulfoçyanate de potasse et titrer colorimétriquement, en suivant les prescriptions du procédé de Lapigque. Dans ce cas, 2 grammes de sang suffisent. Du poids de fer trouvé, on déduit le poids de l'hémoglobine, sachant que celle-ci renferme 0,42 p. 100 de fer (5wr le dosage du fer, dans les recherches physiologiques).

Cette méthode, excellente pour doser le fer, est peu sûre pour l'hémoglobine.

Qulnquaud s'est servi, pour doser l'hémoglobine, de la méthode de Schutzenberger, basée sur la recoloration par l'hémoglobine de l'indigo réduit et décoloré par l'hydrosulfite de soude (Compte Rendus de VAcad. des Se, t. LXXXVIII).

Ce procédé exige une installation assez compliquée* De plus, il est nécessaire d'opérer dans un courant d'hydrogène, à l'abri de toute trace d'air, ce qui est fort difficile à réaliser dans la pratique.

B. MÉTHODES OPTIQUES. — Ou s'aflrcssc le plus souvent aux méthodes optiques, soit qu'il s'agisse de déterminations approximatives, suffisantes en clinique, soit pour les dosages plus précis de la chimie biologi([ue.

a. Procédés cliniques. — Les appareils cliniques sont ceux de Hayex, Malassez et Hknocoue.

Hayem examine comparativement deux cellules de verre de même dimension : l*une contient une dilution à un titre connu du sang à examiner, l'autre contient de Teau distillée. On fait passer au-dessous de celle-ci une série de papier teints en rouge sang, d'intensité variable et tels que chacun correspond à une teneur déterminée en hémoglobine. Quand les deux cellules sont colorimétriquement égales, c'est que la richesse du sang est celle du titre indiqué par le papier coloré.

Dans Yhémovhromomètre de Malassez, on compare à un ét^ilon de picrocarmin ammoniacal dont la teinte correspond exactement à celle d'une solution d'hémoglobine de richesse connue, on compare, disons-nous, une dilution de sang ou d'hémoglobine, placée dans une cuve prismatique qu'une crémaillère fait mouvoir devant l'œil de l'observateur. Ce dispositif permet aux rayons lumineux de traverser des épaisseurs variables de la solution à examiner. Quand l'égalité des teintes est peri;ue pour le picrocarmin et le sang, on lit, sur une graduation de l'appareil, l'épaisseur de sang traversée ; une table transforme ces résultats en hémoglobine.

Hkxocque a construit deux appareils : Vhématoscope simple et Vhématospectroscope avec analyseur chromatique.

Le premier se compose de deux lames de verre bien dressées, lixées l'une au-dessus de l'autre, non pas parallèlement, mais de façon à former un angle dièdre très aigu. Dans l'interstice dos deux lames on introduit deux ou trois gouUes de sang empruntées au doigt, par exemple. On a ainsi une petite cuve dont l'épaisseur va croissant; on la dépose sur une plaque de fonte émaillée portant une gnrtluation empirique. A gauche, sous une faible épaisseur, les chiffres seront visibles; puis, sous des épaisseurs croissantes de sang, ils s'estomperont et finiront par disparaître. L'instrument est gradué de telle sorte que le dernier chiffre visible exprime, en centièmes, la teneur en hémoglobine. Ce procédé est expéditif, mais n'est pas très exact. Dans les cas d'hyperglobulie, l'opacité due à l'excès de globules, est attri-

huée à torl à riiêini>gl(ibine. Avec le siLiif; leucocylhéii]i<]ue, lappureil rnuiniriiit des résultats complu Lement erioués.

Au lieu de fuira une (liqùt'e au doi)jt, HiSmxmjCE dose l'Iiémoglobluedusung circulaut daus les Lissus, A. l'aide d'un analyseur i:lit'()maLi(|ue et d'un petit sjïeclrosciijie à vision direclc. Eii plu- <,aiit rexlrémité du diiigt, 1» léïie, le [luvillou de l'oieille ou mtiine lu muia devuut le collimuteui' du speeti'osrupe, un

Flg. 33.

peut voir les deux bandes d'absorption de l'ht-moglobiiie ; un liisque mobile, odupté à l'appureil, permet de plui^i' devant lu fente des verres colorés et méthodique me ut gradués qui atténuent ou éteigueut les bandes de l'o^ybémoglobine. Suivant que les bandes disparaissent avec un verre plus ou moins <;puis, on détermine la quantité d'oxyhémoglobine, eu lisant le cliiiïre gravé au-dessous du dernier verre qui laisse encore distinguer lu première buude d'absorption.

Ce procédé n'est pas très précis ; mais, il i)ermel de répéter les observations, sans pratiquer ni incision, ni piqûre. De plus, on peut, en ligaturant le doi^t, placé uu grand jour devant la fente du spectroscope, noter le temps nécessaire pour que les

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deux bandes de l'oxyhémoglobine disparaissent et donnent lieu à Fapparition de la bande de Stokes ; ce temps mesure la vitesse de réduction de Thémoglobine. Cette vitesse est normalement de 70 secondes ; elle augmente dans la fièvre.

b. Procédé scientifique. — La méthode spectrophotométrique, beaucoup plus exacte que les précédentes, est la méthode d'élection en chimie biologique.

On étiiblit, en physique, que la richesse en matière colorante d'une solution s'obtient en multipliant un facteur A qui porte le nom de rapport d'absorption et qui est constant pour une région spectrale donnée, par un facteur variable t qu'on désigne sous le nom de coefficient d'extinction et qu'on mesure dans la môme région spectrale. On a, c étant le poids cherché de matière colorante contenue dans la solution :

c =. kz

Pour déterminer s, on produit, à Taide d'un dispositif spécial, deux spectres provenant d'une même source lumineuse ou [de deux sources d'égale intensité : l'un, S, est perçu directement; l'autre, T, après passage à travers une solution colorée d'épaisseur connue. On compare, dans les deux spectres, l'intensité d'une même région, le vert, par exemple : le vert du spectre T se trouve réduit à une certaine fraction de sa valeur primitive, le quart, par exemple. Pour rétablir l'égalité des plages vertes dans les deux spectres, il faudra réduire l'intensité de S au quart, ce que l'appareil permet de réaliser et de mesurer en même temps : la réduction qu'il faudra faire subir à S, mesure la réduction éprouvée par T. Soit F, l'intensité ainsi déterminée * de la région verte dans le spectre T ; on démontre que s = — log. r.

Quant à A, on le détermine, en mesurants' avec une solution de concentration connue c'. De l'équation

c' c' =: As', ou lire A =r -, .

' Dans l'exemple que nous avons choisi, elle est égale à un queirt, le faisceau incident naturel étant égal à 1.

A étant donné uiie fois pour toutes, la valeur de c sera fournie par la détermination de £, effectuée comme ci-dessus.

On a imaginé de nombreux spectrophotomètres. Celui de ViERORDTestun spectroscope dont la fente est limitée : d'un côté, par une plaque fixe ; de l'autre côté, par deux plaques mobiles et indépendantes, mues par des vis micrométriques dont les tambours gradués mesurent la largeur de la fente. On a ainsi deux fentes superposées, de largeurs inégales et connues. Par Tune des fentes, passe le faisceau lumineux direct, par l'autre le faisceau qui a traversé la solution colorée ; dans la lunette de l'appar. il, les deux spectres sont rapprochés; on amène à égale intensité les deux plages vertes, en tournant le tambour de la fente d'où provient le faisceau naturel. Comme l'intensité lumineuse est proportionnelle à la largeur de la fente, la lecture des tambours gradués donne l'intensité V et, par conséquent, £. La valeur de A ayant été déterminée une fois pour toutes, c se calcule aisément. Pour le dosage de l'hémoglobine dans le sang, on se sert d'une petite cuve de verre, à faces parallèles, de 10 millimètres d'épaisseur, placée juste en face de l'une des fentes ; l'autre fente reste libre et reçoit le faisceau direct.

Dans d'autres spectrophotomètres que celui de Vierordt, on fait varier l'intensité du spectre naturel, à l'aide de deux niçois croisés dont la rotation permet de mesurer l'intensité lumineuse *.

2° Hémo-alcalimétrie. — On opère sur le sérum et non sur le sang. On dilue, à l'aide d'une pipette spéciale, 50 millimètres cubes de sérum dans un centimètre cube d'eau et on titre, en présence d'une goutte de phénolphtaléine, avec de l'acide sulfurique à l/lOOO® (Drouin).

Chez l'homme, à l'état de santé, l'alcalinité, mesurée en acide sulfurique, varie de 0g»',78 à 0gr,95 par litre de sérum.

* Voir, pour plus de développements : Lambling , Analyse des liq. et des tissus de Vorçjan. {Enajclopédie chimique de Frémy) et Branly {Ann. Chim. et Phys. (5« série), t. XXVII, p. 246).

3** Glucose. — Vingt grammes de sang environ sontreçus clans une capsule tarée qu'on repèse ensuite, ce qui donne le poids exact de Téchantillon. On ajoute un poids égal de sulfate de soude non effleuri, quelques gouttes d'acide acétique et on fait bouillir. Quand le coagulum devient noir, on étend d'eau, on exprime à chaud, on amène à un volume connu et on titre à la liqueur de Fehling (Cl. Bernard).

4** Urée. — On a publié un grand nombre de méthodes de dosage de l'urée dans le sang; aucune ne remplit le but. Nous donnerons ci-dessous un procédé dû à Schoxdorff.

On ajoute à un volume connu de sang deux à trois volumes d'une liqueur préparée en versant iOO centimètres cubes d'acide chlorhydrique à 1,12 de densité dans une quantité d'acide phosphotungstique dissous suffisante pour faire un litre. Après vingt-quatre heures, on filtre et ajoute au filtratum de la chaux éteinte jusqu'à réaction alcaline; on filtre encore. On prélève ensuite deux échantillons mesurés de la liqueur alcaline limpide. L'un sert à doser l'acide carbonique formé à partir de l'urée, à l'aide du procédé de Bunsen, lequel consiste à chauffer l'urée en vase clos, à loO<*, pendant quatre heures, avec une solution de chlorure de baryum, en présence de la soude caustique ; le carbonate de baryte est recueilli, lavé et transformé en sulfate ; on le pèse, on en déduit le poids de l'acide carbonique et, par le calcul, celui de l'urée. Le second échantillon est chauffé pendant quatre heures et demie à 150°, avec de l'acide phosphoriquc cristallisable ; l'urée se transforme en phosphate d'ammoniaque, qu'on décompose par la soude. L'ammoniaque mise en liberté est titrée^ alcalimétriquement ; elle fournit une nouvelle évaluation de l'urée.

Les deux déterminations, celle de l'acide carbonique et celle de l'ammoniaque, doivent conduire à un même chiffre d'urée ; sinon, il y avait de la créatine ou de la créatinine dans la solution, et, alors, le procédé n'est plus applicable.

50 Cholestérine. — Le sang est coagulé par 4 volumes d'alcool froid à 83** centésimaux * Après quelques heures, on

lave le coagulum à Falcool, puis à Téther ; on réunit les deux liquides éthéro-alcooliques et on les évapore au bain-marie jusqu'à siccité : on fait bouillir le résidu avec de la potasse alcoolique, cbasse l'alcool et reprend par l'eau. On épuise la liqueur aqueuse avec de l'étber, à plusieurs reprises, et sans filtrer. Chassé par distillation, l'éther abandonne delà cholestérine impure, qu'on reprend une fois encore par Téther anhydre. En évaporant dans une capsule tarée, il reste la cholestérine ; on la pèse.

6° Acide ^-oxybutyrique lévogyre. — Le sang, conservé au contact de l'éther jusqu'à disparition du sucre, est ensuite évaporé presque complètement. On épuise à l'eau bouillante, et précipite les liqueurs par leur volume de sousacétate de plomb, additionné d'un demi-volume d'ammoniaque. S'il y a de l'acide p-oxybutyrique, la liqueur liltrée dévie à gauche, au polarimètre. Dans ce cas, on évapore un second échantillon de sang et on épuise à l'eau bouillante le résidu sirupeux; on filtre et évapore à sec. Le résidu, additionné de son volume d'acide sulfurique concentré, est distillé ; le produit de la distillation, fortement refroidi, est repris par l'éther ; les cristaux qui se forment par évaporalion de ce dissolvant, fondent, après dessiccation, à 70°, point de fusion de l'acide crotonique quia pris naissance dans cette réaction, par déshydratation de l'acide p-oxybutyrique.

7° Acide urique. — On le décèle par le procédé de Garrod, indiqué ci-dessus (p. 278). Pour le doser, on pourrait coaguler le sang, à chaud, en présence de l'acide acétique, épuiser le caillot, et, dans les liqueurs réunies, doser l'acide urique par une des méthodes Salkowski-Ludwig ou Hermann-Haycraft, exposées au chapitre de V Urine (p. 460 et 461).

8° Gaz. — On les extrait par la pompe à mercure, pour les analyser par les procédés gazométriques habituels : en absorbant CO'^ par la potasse et l'oxygène par l'acide pyrogallique en liqueur alcaline. L'azote reste comme résidu.