III. Cultures sur milieux opaques
Ce mode de culture comprend la culture sur
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TECHNIQUE DES CULTURES
pomme de terre, etc. Nous ne parlerons ici que de la culture sur pomme de terre : on appliquera aux autres milieux opaques tout ce que nous dirons de la pomme de terre.
On doit, nous l'avons dit au chapitre IV, cultiver la pomme de terre suivant deux procédés.
i° Enpelits cristallisoirs clos, suivant la méthode de Koch modifiée;
2° En tubes d'essai', d'après la méthode de Roux.
■1° Culture en cristallisoirs clos. — La technique générale diffère très légèrement suivant que le cristallisoir est ou non muni d'une ouverture latérale.
ajCrislaUisoirs sans ouverture latérale. — Soulevez obliquement, et très peu, le couvercle du cristallisoir; portez la pipette ou le fil de platiue chargés de la semence sur la surface de la pomme de terre et déposez, en traçant des stries superficielles, la semence sur cette surface. Replacez le couvercle, et portez l'appareil à l'étuve.
6) Cristallisoirs à ouverture latérale. — Enlevez le tampon d'ouate qui garnit rouverture ; glissez par l'orifice la pipette ou le fil de platiue portant la semence, et déposez cette semence en stries sur la pomme de terre; replacez le tampon d'ouate après l'avoir passé rapidement dans la tlamme, et portez l'appareil à l'étuve.
Nous conseillons d'employer la pipette k extrémité finement effilée pour l'ensemencement des pommes de terre aussi souvent qu'il sera possible de le faire. Avec la pipette on portera directement sur la pomme de Icrre les cultures provenant de milieux liquides ou liquéfiés: on y portera aussi suivant la métiiode générale que nous avons exposée ci-dessus tous les produits de culture en provenance de milieux solides.
Le (il de platine et surtout la palette de platine
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seront employés à défaut de la pipette, et dans les circonstances où celle-ci est inutilisable; ils remplissent d'ailleurs parfaitement le but.
■2° MÉTHODE DE RoL S. — Daus les tubes contenant une tranche de pomme de terre, tubes dont la forme et la préparation ont été décrites ailleurs, l'ensemencement est d'une extrême facilité, et se fait eomme dans tin tube de gélatine ou de gélose.
Ouvrez le tube qui contient la pomme de terre avec les précautions d'usage, c'est-à-dire en lui donnant une inclinaison telle que les germes atmosphériques ne puissent y tomber. Portez la semence contenue dans une pipette finement el'fdée, ou à l'extrémité d'un fil de platine, sur la surface de la pomme de terre, et déposez-la en traçant quelques stries superficielles.
Rebouchez le tube, flambez le verre au niveau du tampon d'ouate, couvrez l'extrémité d'un capuchon de papier filtre ou de caoutchouc, et portez à l'étuve.
Tel est ce procédé qui fait de la culture sur pomme de terre, autrefois si compliquée, si peu sûre, un procédé qui égale en simplicité et en sûreté laculturc surmilieux transparents.
rv. Cultures sur plaques.
Nous allons décrire ici un procédé tout spécial, imaginé parKoch, et ([ui, malgré quelcjucs imperfections, rend les plus grands services.
La culture sur plaques se fait soit dans la gélatine pure, soit dans la gélatine additionnée d'une petite quantité de gélose, ce (|ui rend le milieu plus rapidement solidifiable, et moins racilcnient liquéfiahlc aux hautes températures de l'iHé.
Le principe général de la iiiétiiode est le suivant :
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On répand dans une faible quantité de gélatine (ou de gélatine-gélose) liquéfiée un nombre de germes aussi faible que possible. Puis on fait solidifier le milieu en l'étalant sur une surface plane. Les germes se difi'usent et se développent, chacun isolément, là où ils ont été emprisonnés par la solidification.
La culture sur plaques se prête admirablement à trois opérations :
1° Isolement des divers germes contenus dans un milieu quelconque : eau, sol, matières fécales, tissus, etc.
2° Purification d'une culture impure par la séparation des espèces microbiennes qu'elle contient.
3° Élude de la forme que prend la colonie pure de tel ou tel microbe; cette forme est parfois caractéristique pour un microbe (fièvre typhoïde, choléra, etc.).
Nous décrirons :
A. Le procédé classique de Koch ;
B. Une modification de ce procédé, qui dans certains cas peut remplacer avec avantage la méthode un peu compliquée de Koch (méthode d'Esmarch) ;
G. Enfin un excellent procédé dû à Roux, procédé dont l'indicaLion a été donnée par lui dans les Annales de l'Institut Pasteur (1887, p. 2o).
A. Cultures sur plaques par la méthode de koch.
Nous exposerons ceprocédé en supprimant tout ce qui n'est pas essentiel, et constitue une surcharge d'apjiareils inutile. Les instruments nécessaires sont :
1" Un triangle en bois à vis calantes (fig. 25) ;
2" Un niveau à bulle d'air;
3" Une large iilaquc de verre ;
CULTURE DES MICROBES AÉROBIES. iOl
4° Des petits bancs en verre (lig. 26) ; o" Des plaques de verre stérilisées et contenues jusqu'au moment où elles devront être mises en
Fig. ià. — Ti'iaugle eu bois ;i vis calantes.
usage dans une boite on tôle stérilisée ; n.ous avons décrit ailleurs cette partie de l'appareil et sa stérilisation (voyez cbap. Il);
l'"ig. 'Ji;. — l'ptit biiiic 011 voi-ro.
6" Une cloclip en verre composée de deux partics : a) un cristalUsoir l'ccouvert par, b) un couvercle de môme forme, pins grand et portant sur sa face supérieure un boulon de verre ((ig. 27).
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Pour mieux faire saisir l'économie générale de l'opération nous choisirons un exemple :
On a dans un tube de gélatine, dans un matras, une culture impure contenant un grand nombre degermes difTérenls, ou bien encore on vient d'ensemencer un tube de gélatine, un matras avec une goutte, une parcelle d'une substance qu'on sait chargée d'une quantité de germes divers (eau, terre, matières l'écales, etc.).
Fig. 27. — Cloche formant chambre humide.
11 s'agit de trier ces germes, de les isoler, d'en faire, en un mot, la culture sur plaques.
L'opérateur commence par se laver et broker soigneusement les mains, qu'il trempe ensuite dans la solution de sublimé à un millième.
Il lave ensuite, dans la même solution, la plaque de verre (3), dispose cette plaque sur le triangle à vis calantes (1) et établitl'appareil dans l'horizontalité parfaite à l'aide du niveau à bulle d'air (2) ; il suffit pour cela de visser et dévisser les vis calantes, jusqu'à ce que le résultat soit obtenu.
11 faut alors préparer la cloche (6), en faire, suivant l'expression connue, une chambre humide aseptique et aniiscpiiquc. .A cet elTet les deux parties
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qui la composent ayant été d'abord soigneusement nettoyées, on place dans le cristallisoir inférieur une feuille de papier filtre taillée en rond, et d'un diamètre un peu moindre que le diamètre intérieur de ce cristallisoir. On verse dans chacune des deux parties de la cloclie une solution de sublimé à 1 p. 1000; on la promène sur toute la surface intérieure du cristallisoir ; on vide complètement le cristallisoir supérieur, mais on ne fait écouler qu'en partie la solution désinfectante du cristallisoir inférieur; on y laisse la quantité nécessaire pour tenir le papier filtre humide. On ferme la cloche, et on la place sur la plaque de verre.
On dispose alors à portée, dans un récipient rempli de sublimé au millième, trois bancs de verre, et aussi dans ce même récipient trois bandes de papier filtre de la largeur et de la longueur des bancs de verre ; on numérote I. II. III. ces bandes de papier.
On place encore à portée la boite en tôle contenant les plaques de verre stérilisées, une lampe à alcool, un fil de platine fort, et des pipettes.
On prend alors trois tubes de gélatine l'ajblement remplis ; en hiver onse servira de gélat ine pure ; en été on prendra de la gélatine additionnée de gélose.
On porte ces tubes a l'éluve ou dans un bainraarie pour les liquéfier.
Le contenu du tube 0 qui renferme la culture dont les germes doivent cire isolds sera lui-même rendu liquide de la môme façon, s'il ne l'est déjà.
On saisit alors le tube 0; on le place entre le pouce et l'index de la main gauche côte à côte avec un des tubes de gélatine fondue à l'étuvc ou au bain-marie. On débouche l'un et l'autre tube; avec une pipette stérilisée (1), et dont refliiure vient
(I) La pipetto mous parait remplacer avaiila;,'iMis('riii'iLl li' 111 ilc plaliae fin, lermiiu' on anneau, ipic les Allemamls oTii[iliii('nl clans le même bul.
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d'être passée dans la flamme de la lampe à alcool on aspire un peu du liquide du tube 0, et on eu porte une goutte dans un des tubes de gélatine. Ce tube sera immédiatement bouché et marqué I. On l'agitera légèrement pour répartir la semence dans toute l'épaisseur de la gélatine.
Si la culture impure est contenue dans un matras, l'opération est aussi simple: avec la pipette on prélève un peu du liquide du malras et on en reporte une goutte dans le tube de gélatine I.
Dans ce tube I on prélève avec une nouvelle pipette un peu de liquide, dont on laisse par le même procédé tomber une goutte dans le second tube de gélatine liquéfiée; on marque ce tube II; on le bouche ainsi que le tube I et on répand la semence dans son contenu en agitant légèrement. Du tube II on porte par la même manœuvre avec une nouvelle pipette une goutte dans le troisième tube de gélatine : tube 111.
On doit veiller à ce que les tubes I. II. III. restent toujours en état de liquéfaction jusqu'au moment où on lej verse sur les plaques de verre : il est bon de les plonger dans un bain-marie tiède, s'ils ont delà tendance ii la solidification.
On place alors dans le cristallisoir inférieur de la cloche, sur le papier filtre humide, un banc de verre qu'on relire à cet instant de la solution de sublimé où il était plongé, qu'on laisse égouttor une seconde, et (]u'on recouvre du jiapier-filtre I. On referme aussitôt la cloche.
On couche la hoîte de tôle, contenant les plaques, horizontalement sur le bord d'une table ; on retire le couvercle; un saisit une plaque avec une pince flambée et on la pose dans la cloche sur le banc de verre I, perpendiculairement à la direction de celui-ci.
On fait maintenir par un aide le couvercle de la
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cloche au-dessus, et à aussi petite dislance que la manœuvre le permet, du cristallisoir inférieur. On débouche le tube 1; on en verse le contenu, ou une partie du contenu, suivant la dimension de la plaque de verre, sur ccdle-ci ; alors avec un (il de
Fig. 28. — Appareil dn Kocli pour cultures en plaques. (La cloche demi-ouverte laisse voir à l'intérieur la disposition des plaques sur les petits bancs de verre.)
platine fort, recourbé à angle droit vers sa terminaison, flambé sur la llainnio de la lampe à alcool, et refroidi, on étale la gélatine sur la plaque do verre.
L'aide iiuiintenant toujours le couvercle en bonne position, ou fermant et ouvrant la cloche suivant le i)esoin, on dispose au-dessus do cotte plaque do verre un banc de verre recouvert de son papier-filtre II; les pieds de ce banc de verre reposeront sur le banc sous-jacont. Sur co banc de verre on place perpendiculairement à sa dit eclion
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une deuxième plaque stérilisée, sur laquelle on verse et on étale de même le contenu du tube II.
Enfin on dispose au-dessus de cette plaque II un troisième banc de verre avec son papier-filtre III, et on verse et on étale sur cette plaque le contenu du tube m (fig. 28).
On fait alors fermer la cloche : l'opération est terminée; il ne reste qu'à attendre, pour procéder à l'examen et ix l'ensemencement des colonies, que celle-ci se soient développées.
On devra s'abstenir, avant le moment opportun, de toute ouverture intempestive de la cloche, qui permettrait aux germes aériens de se déposer à la surface des plaques.
En règle générale la plaque I, qui occupe le rang inférieur, est trop chargée de germes, et souvent liquéfiée en totalité ou en partie : les plaques II et III se prêtent mieux à l'examen et à la prise des colonies.
Nous allons maintenant décrire ces deux opérations.
Examen des plaques. — Portez sur la platine du microscope (cette platine doit être large, et tous les microscopes à l'usage bactériologique sont aujourd'hui pourvus d'une telle platine) la culture en plaque. Écartez l'éclairage Abbe, servez-vous du plus petit diaphragme et d'un faible grossissement. Vous apercevrez en faisant passer la plaque sous l'objectif des colonies de formes diverses.
Prélèvement de la colonie. — Si vous voulez cueillir une de ces colonies prenez un fil de platine bien stérilisé, ou de préférence une pipette finement effilée et légèrement recourbée à son extrémité. Nous conseillons plutôt la pipette ainsi préparée, à cause de sa fixité plus grande que celle du fil de platine dont l'extrémité oscille souvent d'une façon gênante. Procédez alors de la façon suivante :
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Si la colonie à cueillir est bien isolée, bien en vue sous l'objectit', allez direclement la cueilliravec le lil de platine ou la pipette en dirigeant la manœuvre de l'œil.
Si la colonie est entourée d'autres colonies à proximité, et par conséquent mal isolée, maintenez l'œil sur le microscope; dirigez par tâtonnement l'extrémité de votre fil de platine ou de votre pipette jusqu'à ce que vous l'aperceviez sous l'objectif au milieu de la colonie choisie. Piquez alors celle-ci, et chargez-en l'extrémité de l'instrument.
Dans l'un et l'autre cas on verra que l'opération a réussi lorsque la colonie aura disparu du champ du microscope et qu'il ne restera plus à sa place qu'une surface de gélatine dissociée.
La colonie enlevée sera immédiatement ou examinée sur lamelle, ou ensemencée dans un tube de gélatine, gélose, etc., etc.
Nous avons dit en commençant cet article que la culture sur plaques permettait d'éludicr la forme que prend la colonie d'une bactérie donnée. Lorsque possédant une culture pure de tel ou tel microbe on désire connaître la forme des colonies de ce microbe sur la gélatine, on procède de la façon que nous avons indiquée, mais il n'est pas nécessaire alors' de faire un aussi grand nombre de plaques : une ou deux suffisent, la première contenant une goutte de la culture originale, la deuxième contenant une goutte du tube d'ensemencement de la première plaque : on aura de cette façon sur l'une et l'autre plaijue des colonies suffisamment isolées.
