C. Cultures sur plaques par le pnoctiDÉ DE Rou.x

Roux a indiqué un i)rocédé de cultures sur plaques qui a l'avantage de permettre la conservation pure des microbes à évolution très lente, tels que celui de la tuberculose.

Aux plaques il substitue « des tubes de verre longs de 2.ï à 30 centimètres et larges de 2 à 3 centimètres (V. tig. 29). Une petite quantité » de gélatine, de gélatine et gélose ou de gélose glycérinée fsuivant les cas) « est introduite au fond des tubes, que l'on ferme avec un tampon de coton et que l'onslérilise à l'autoclave à il.ï°. Pour les utiliser il suftitde faire fondre la gelée nutritive, et de l'ensemencer alors qu'elle est encore liquide.

« On agite vivement, et on couche le tube sur un ])l;iii iiorizoutal : la gelée nutritive s'étale et se moule sur la paroi inférieure du tube. Elle est ainsi répartie sur une grande surface, et si l'ensomencemenla été convenablement ffiit, les colonies qui se développeront seront parfaitement isolées. La couclie ir~«:) solide doit être mince poiii' que l'on puisse facilement examiner 1rs colonies, au microscope, à travers le verre. Le Inbo est fcnui' avec un capuchon de CMOutciioui-, d il peut rester à l'éluvo, le cas échéant, aussi longtemps ([u'il

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TECHNIQUE DES CULTURES

est besoin sans qu'il se dessèche. Il est facile de l'examiner, et même de faire une prise dans une colonie isolée sans avoir à craindre Tintroduclion des germes étrangers de l'air.

« S'il se forme des colonies à la surperficie de la couche nutritive, et s'il est nécessaire de les examiner par leur surface libre, avec un diamant monté sur une tige rigide, on fait un trait sur la paroi intérieure du tube de chaque côté et parallèlement à la surface de la gelée nutritive; on sépare ainsi le tube en deux demi-cylindres dont l'un contient la culture étalée. Il est facile d'examiner cette gouttière tout comme une plaque sur la platine du microscope. »

B. CULTURE DES MICROBES ANAÈROBIES

Les procédés que nous allons décrire appartiennent exclusivement à l'école française. L'école allemande a ignoré à peu près entièrement, jusqu'ici, la manière de cultiver les anaérobies, ou n'a fait ces cultures que d'une façon peu rigoureuse et peu pratique. Les principaux essais tentés par les Allemands n'ont porté que sur la gélatine.

Koch avait indiqué un procédé de culture sur plaques de gélatine recouverte d'une feuille de mica flambé ; ce procédé, dont il s'était servi dans ses recherches sur le choléra asiatique, avait pour but d'isoler de l'air le milieu de culture.

Hesse et Liborius faisaient leurs ensemencements dans les couches inférieures d'un tube à essai rempli de gélatine (1).

Dans un pareil tube les couches éloignées de la surface aérée peuvent se trouver à l'abri de

(I) V. Duclaiix, Annales de l'institut Pasteur, I. 11, page 334.

CULTURlil DES MICHOBES ANAÉROBIES. 111

l'oxygèno, et les aiuiérobies peuvent s'y développer.

Mais cette méthode se prête mal « à l'examen, à l'étude, et àla réinoculation des colonies formées, qu'il faut aller péniblement chercher, après avoir cassé le tube, au milieu de la masse gélatineuse qui les contient » (Duclaux, loco citato).

Une autre méthode allemande consiste à « faire rouler sur la paroi intérieure du tube la gélatine ensemencée jusqu'à ce qu'elle y fasse prise, laissant ainsi un vide central qu'on remplit de gélatine stérile » (Duclaux). Cette méthode n'a pas donné à ses auteurs le résultat attendu.

Liborius et Frœnkel ont imaginé un procédé basé sur le remplacement de l'air par un gaz inerte.

Liborius faisait « barboter de l'hydrogène dans le milieu nutritif contenu dans un tube muni d'une effilure latérale, et cela jusqu'à élimination des dernières traces d'air. »

Cet auteur tentait aussi, mais avec assez peu de succès, de cultiver les anaérobies sur plaques dans une atmos{)hère de gaz hydrogène.

La méthode de Frfcnkel est assez simple. « Il se sert d'un simple tube à essai, fermé par un bouchon de caoutchouc par lequel passent deux tubes coudés, un tube d'arrivée, qui s'enfonce jusqu'au fond du tube, et un tube de sortie, qui commence au-dessous du bouchon. Ces deux tubes sont au préalable effilés dans leur partie extérieure et fermés avec des tampons d'ouate. Le tube à essai et Ir milieu nutritif ayant été stérilisés convenablement, on fait yiasscr un courant d'hydrogène obicnu avec du zinc pur et de l'acide sulfuriquc pur, et lavé, de façon à le débarrasser des produits sulfurés arsenicaux et de la petite quantité d'oxygène qu'il pourrait encore contenir.

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Quand l'air est tout à fait chassé, on ferme à \:i lampe en leurs effilures, d'abord le tube de sortie, puis le tube d'entrée, et on étend le liquide gélatinisé sur la paroi du tube » (Duclaux).

Le bouchon de caoutchouc et les tubes de verre doivent être soigneusement stérilisés. Pour éviter la difTusibilité de l'hydrogène qu'on est toujours exposé à voir remplacer par de l'air, Fra3nkel recommande de couvrir le bouchon et l'extrémité du tube de pai^affine.

Seul des auteurs allemands, Grlïber emploie la pompe à air. » Il eflile un tube à essai à environ 15 centimètres du fond, le bouche avec de l'ouate, le stérilise, et y fait arriver au moyen d'un entonnoir capillaire un peu de gélatine nutritive; après quoi il stérilise à nouveau. 11 ensemence en enlevant le tampon d'ouate, au moyen d'un fil de platine, fait le vide en portant la gélatine de 30° à Sb", de façon à la faire bouillir, ferme à la lampe, et roule en manchon suivant la méthode d"Esmarch » (Duclaux).

Telles sont les principales méthodes allemandes de culture des anaérobies; elles ne datent guère que d'un an ou deux, et il semble que leurs auteurs ne les aient imaginées que pour éviter d'employer les méthodes françaises, qui ont depuis longtemps fait leurs preuves. Elles ne s'appliquent d'ailleurs qu'à la culture sur gélatine et sont peu précises; elles ne se sont guère, et pour cette raison sans doute, géuéralisées en Allemagne même, oùla culture des anaérobies reste une exception.

Les méthodes françaises datent des travaux de M. Pasteur; elles ont i^eçu d'importants perfectionnements de M. Roux, à qui nous devons la connaissance de la culture des anaérobies sur les milieux solides. Ces méthodes précises et simples, plus simples que leur exposition nécessairement

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un peu compliquée ne le laisserait croire, et dont la pratique donnerait rapidement l'habitude, s'appliquent il quatre procédés de culture :