C. Procédé par la température. — C’est le procédé de Rodet

1 Parietti, Méthode de recherche du bacille typhique dans les eaux potables, Rivista d’igiene, t. I, n° 11.

2 Rodet, Importance de la température dans la détermination du Bacille typhique, Soc. de Biologie, 29 juin, 1889.

ANALYSE BACTÉRIOLOGIQUE DE L’EAU

11 repose sur la possibilité de la végétation du B. d’Eberth et du Colibacille à + 45°, température à laquelle ne poussent pas la grande majorité des microbes des selles et des eaux. On ensemence largement, avec l’eau à analyser, quatre ou cinq ballons de bouillon qu’on place dans une étuve à -j- 44°, 5 ou + 45°. Au bout de quarante-huit heures, les ballons sont retirés et examinés.. S’ils sont tous restés limpides (on ne tient pas compte des moisissures qui végètent bien à cette température mais ne peuvent en imposer pour des cultures microbiennes), l'analyse est terminée, l’eau ne contenait ni Colibacille ni B. d’Eberth . Si les ballons sont troubles et que l’examen dénote des bacilles, on s’adresse à la série des procédés décrits pour la diagnose des deux microbes. Un ensemencement simultané sur gélatine phéniquée indique approximativement la richesse de l'eau en Colibacilles, s’ils existent. On améliorerait ce procédé en ensemençant une eau concentrée (centrifugation, filtration, etc.)

Eijkman (1904) propose d’ensemencer 1 centimètre cube d’eau dans JO centimètres cubes de bouillon glycosé et de mettre à l’étuve à -j- 46°. S’il y a du Colibacille en vingt-quatre heures, la fermentation du glucose se produit et se constate par le virage au rouge. Ce procédé est ingénieux bien qu’un peu simpliste.

Pour Petruschky etPuscH (1903) la teneur d’une eau en thermophiles va de pair avec sa richesse au B. coli .

D. Procédés par cultures sur gélatines ou géloses spéciales. — Nous avons indiqué (p. 101) la composition de la gélatine d’Elsner. Kemlinger et Schneider auraient isolé le B. dEbertli, huit fois sur trente-six échantillons, examinés par ce procédé.

Nous avons aussi donné la composition de la gélatine de Piorkowsky (p. 101).

On utilise ces gélatines, comme pour faire une analyse d’eau ordinaire. Ce sont de mauvais procédés.

E. Procédés utilisant les milieux colorés. — a. Nous connaissons la gélatine colorée de Nœggeralh (p. 102), sur laquelle le B. dEberth pousse violet-évêque. Sur gélose fuchsinée de Casser

(p. 102) les colonies du Colibacille ont une teinte rouge, voisine de celle des colonies du B. d’Eberth. Il y a encore la gélose lactosée et colorée à la rubine de Ramond (p. 103) qui se colore en rouge à la moindre trace d’acidité, c’est-à-dire donnant des colonies rouges de Colibacille.

Ces milieux ne sont plus employés. Ils n’ont aucun avantage sur le bouillon lactosé et tournesolé et ne servent, après tout, qu’à différencier des cultures déjà isolées. Il n’en est pas de même des procédés suivants .

b. Harrison (1909) recommande le milieu suivant :

Peptone de Witte 1 à 2 p. 400.

Taurocholate de isoudç o —

Esculine 1 —

Citrate de fer. 0,03 —

Eau 100 cent, cubes.

On peut ajouter 1,5 p. 100 d’agar pour avoir un milieu solide.

Le Colibacille fait fermenter l’esculine (sucre -f- esculétine) ; l’esculétine se combine au sel de fer pour donner un sel brun noirâtre. Le Colibacille noircit donc ce milieu (de même le B. lactis aerogenes). On met 10 centimètres cubes de ce milieu par 100 centimètres cubes d’eau. Culture à -f- 37°5 à 40°.

c. Procédé au Neutral-Roth. ( Procédé de choix). — Préconisé par Rothberger en 1898. Voici le procédé, modifié par Savage :

On fait bouillir 125 grammes de viande de bœuf dans 500 centimètres cubes d’eau, et on ramène à 500 centimètres cubes. On

filtre et on ajoute :

Peptone Dufresne 10 grammes.

Sel marin 10 —

Glucose 2s',50.

On fait bouillir. On laisse refroidir. On ajoute :

Sol. aq. de Neutral-Roth à 5 p. 100 ... 5 cent, cubes.

On stérilise à 115° pendant 30 minutes et on répartit en tubes.

428 ANALYSE BACTÉRIOLOGIQUE DE l’eAU

Le Colibacille fait virer le milieu en 24 heures (48 heures au plus) mx jaune canari avec fluorescence verte (bulles gazeuses) ; le B. d’Eberlh ne modifie pas le rouge.

Voici les conclusions de Savage (1901) : Le Colibacille seul donne toujours une réaction positive en vingt-quatre ou quarante-huit heures. Le B. d'Eberth seul donne toujours une réaction négative (sauf après soixante-douze heures). Les mélanges de ces deux microbes ne donnent pas toujours une réaction positive en quarante-huit heures. En somme : pour les cultures isolées, les résultats ne sont pas meilleurs que ceux du bouillon lactosé et tournesolé : pour les mélanges les résultats sont inférieurs.

Sicre, Vincent estiment que certains microbes ( B . 'pyocyanique, B. de Gartner, B. enteritidis, B. paratyphique B) et quelques bactéries banales des eaux donnent la même réaction que le Colibacille, et que, d’autre part, certains colibacilles sont presque sans action. Pour eux, le procédé est infidèle. Le B. Subtilis fait virer. Braun (1906) au contraire recommande vivement ce procédé (constant, rapide, sensible, spécifique).

Pour rechercher le Colibacille dans l’eau, on ensemence des tubes de bouillon avec 1/2, 1, 5, 10, 20 centimètres cubes de l’eau à analyser (6 à 20 centimètres cubes de bouillon). Nous employons couramment ce procédé, qui permet de constater la présence du Colibacille et d’en faire la numération approximative, suivant que tous les tubes virent, ou que seuls virent ceux qui ont été ensemencés avec 5, 10, 20 centimètres cubes d’eau.

11 faut bien rechercher la fluorescence et ne pas se contenter de la teinte verdâtre (fig. 180). Il se produit toujours des bulles gazeuses si on a affaire au Colibacille.

d. Procédé au NeuLral-roth combiné avec celui d’Eijkman (Procédé de choix). — Pour remédier à ces défaillances, Bulïr, Lacomme ont combiné la méthode au rouge neutre avec celle de Eijkman (solution peptonée glucosée), c’est-à-dire la recherche de la coloration verte et fluorescente et celle de la production des gaz (et de l’acidité). S’il y a : fluorescence

verte, (et acidité), on est en présence du Colibacille (Bulïr).

Voici la technique de Lacomme. Faire à chaud la solution de rouge neutre, filtrer, stériliser et conserver pour s’en servir à froid. Bouillon :

Eau 1 000

Peptone de Witte 100

Glucose . . . . , 100

NaCl 50

On répartit le bouillon en tubes de 15 centimètres cubes auxquels on ajoute, au moment de les employer, 12 gouttes (pipette à 1/20 centimètre cube) de la solution de rouge neutre.

Chacun de ces tubes (tube d’Eijkman), est destiné à recevoir 100 centimètres cubes d'eau. Ils sont mis à l’étuve à -{- 45° 46°. Il est facile de faire des dilutions de l’eau à analyser pour faire une numération avec ce seul modèle de tubes. La réaction est caractéristique en vingt-quatre heures (production de gaz, fluorescence verte) (fîg. 181).

Lacomme a montré que la réaction est sensible à la présence de 1 QQ(j de centimètre cube de culture de coli dans 100 centimètres cubes d'eau. La fluorescence du B. sublilis ne s’étend qu’à quelques millimètres de la surface. Les autres microbes étudiés ne donnent ni gaz ni fluorescence. Seuls les mélanges contenant du B. coli donnent les réactions. Lacomme n’a jamais constaté de défaillances : toute eau donnant à la fois la fluorescence et les gaz contenait du Colibacille. La méthode est rapide, sensible, spécifique.

F. Procédés utilisant la concentration. — Ces procédés reposent sur le principe qu’il faut soumettre à l’analyse de grandes qualités d’eau pour y déceler le B. d'Eberth. Déjà Péré (p. 424) avait ouvert la voie. Loir avait filtré l’eau à travers une bougie Ghamberland et ensemencé le résidu.

On peut s’adresser à la précipitation, à la centrifugation, à la filtration.

a. Procédé de Vallet (1901). — L’auteur concentre les mi-

430 ANALYSE BACTÉRIOLOGIQUE DE L’EAU

Fig. 180.

Recherche du colibacille dans l'eau par le procédé au neutralroth.

A, culture négative (ni trouble, ni modification de la coloration). — ,B, Culture trouble sans modification de la coloration (pas de colibacille). — C, Culture de 24 h. verte et fluorescente (Colibacille). — D et E, évolution ultérieure, culture jaune.

RECHERCHE DU RACILLE TYPHIQUE DANS LEAU 431 crobes de l’eau par le procédé suivant. 11 commence par obte-

Fig. 181. — Méthode de Lacomme (tubes d’Eijkman).

A, ni gaz, ni fluorescence verte : pas de colibacille. — B, gaz (c) et fluorescence verte : colibacille.

nir un précipité en ajoutant, par 20 centimètres cubes d’eau, 4 gouttes d’une solution saturée et stérilisée d’hyposulfite

432 ANALYSE BACTÉRIOLOGIQUE DE L’EAU

de soude et 4 gouttes d’une solution saturée et stérilisée d'azotate de plomb. Le précipité entraîne les microbes. On centrifuge. On décante. On redissout le dépôt en ajoutant goutte à goutte de la solution primitive d’hyposulfite de soude. Ces réactions n’ont aucune influence antiseptique. On répartit le liquide obtenu à raison de 2 à 4 gouttes dans des tubes contenant 10 centimètres cubes de gélatine d'Elsner modifiée par Grimbf.rt (p. 101), qu’on étale en boîtes de Pétri.

Le Colibacille pousse en trente-six heures, le B. d’Eberth en trois ou quatre jours. On distinguera les colonies parles procédés ordinaires.

Ce procédé n’a que l’avantage de la concentration. Le reste de la technique est banal et offre tous les inconvénients déjà connus.

b. Procédé de Federolf (1909). On précipite par le sulfate de fer. On ensemence 3 à 8 boîtes de Pétri (gélose) par litre d’eau avec 1/2 à 1 centimètre cube du précipité. On compte les colonies.

Dold (1910) recommande le procédé de Federolf avec emploi d’un bouillon aux acides biliaires, comme le meilleur et le plus rapide de tous les procédés.

c. Procédé de Bordas (1901). — Une bougie filtrante plonge dans le récipient d’eau à épuiser, la tétine en haut. Celle-ci est raccordée à une trompe à eau qui fait aspiration. Lorsque toute l’eau a été filtrée, on lave l’enduit de la bougie dans quelques centimètres cubes d’eau stérilisée, et on ensemence d’après une quelconque des méthodes connues.

En somme : ces procédés de concentration ne peuvent être que le prélude de l’emploi d’une méthode (quelconque. Ce sont de simples adjuvants, mais excellents.

Gr. Procédés utilisant le rajeunissement préalable. — Faire végéter d’abord les quelques individus de B. d'Eberth que peut contenir une eau, et n’opérer l’isolement qu'ensuite. Le but est le même qu’avec la concentration, mais est obtenu par une pullulation. On peut d’ailleurs combiner les deux procédés.

Procédés de Chantemesse (1901). — Chantemesse attribue l’échec des anciens procédés au fait que le B. d'Eberth, obligé, de s’adapter à un milieu défavorable (l’eau), mélangé à d’autres

microbes plus ou moins nocifs pour lui, est recherché avec ses caractères saprophytes. 11 conseille de lui rendre d'abord sa force, sa jeunesse et les caractères que nous lui connaissons. Ce n’est que le B. d’Eberth rajeuni qu’il faut tenter d’isoler. Voi<;i la technique.

Faire porter l’examen sur 6 litres d’eau. Ces 6 litres sont filtrés sur bougie Chamberland. On lave cette bougie dans 200 centimètres cubes d’eau stérilisée renfermant 3 p. 100 de peptone Dufresne. On met à l’étuve à -f- 37° dans un bocal à large goulot, fermé par un bouchon de caoutchouc, percé de quatre trous, par où pénètrent : 1° une petite bougie poreuse filtrante ; 2° un tube de verre, muni d’un tampon de ouate, plongeant jusqu'au fond du liquide, pour le barbotage continuel de l’air ; 3° un tube de verre pour aspiration ; 4° un tube de verre communiquant avec un vase rempli d’une peptone stérile à 3 p. 100. On fait constamment l’aspiration ; l’air rentre et barbote par le tube. On aspire, toutes les six ou douze heures, par le tube à travers la bougie, le liquide usé chargé des produits solubles, Le tube remplace à mesure la quantité de liquide enlevée. Lorsque la culture est bien développée, on la centrifuge, on abandonne le culot. Avec le liquide de décantation (où les B. d'Eberth très mobiles sont déjà isolés de beaucoup de microbes entraînés dans le culot), on ensemence le milieu de différenciation.

Ce dernier est formé d’eau peptonée à 3 p. 100, additionnée de 2 p. 100 de gélose et portée trois quarts d'heure à 120° à l’autoclave. Il doit être parfaitement neutre. Quelques minutes avant de l'utiliser, on lui ajoute l&r,05 d’acide phénique cristallisé par 1 000 grammes. Pour cela, on fond la gélose à + 46°. et on verse dans 50 grammes de celle-ci, 2CC,1 d’une solution d’acide phénique cristallisé à 1/40. La gélose est répartie en tubes (2 centimètres cubes par tube). On ensemence avec le fii de platine chargé de bouillon de décantation du centrifugeur : le même fil ensemence successivement quatre tubes (trempé trois fois pour douze tubes). Les tubes sont alors fondus à -f- 46° (bain-marie) ; on roule la gélose et on renverse le tube l’orifice en bas. La gélose vient sur le coton, mais il en reste

ANALYSE BACTÉRIOLOGIQUE DE L’EAU

une couche très mince sur les parois. On enlève le bouchon de ouate et le culot de gélose qui lui adhère. On le remplace par un bouchon de liège qui sort de la paraffine en fusion ; la gélose ne se desséchera pas. Mise à l’étuve à + 37°. De la seizième à la dix-septième heure toutes les colonies de Colibacilles sont sorties : on les pointe à l’encre et on reporte les tubes à l’étuve. De la dix-huitième à la vingt-quatrième heure, sortent des colonies petites et qui le resteront. On les examine à la loupe. Les unes ont un centre foncé avec périphérie jaunâtre, ce sont des microcoques. Les autres ont la périphérie translucide; ce sont les colonies de B. cVEberth.

On prélève une de ces dernières colonies (avec l’aiguille de platine ou le micro-diérète de Chantemesse) et on l’ensemence en bouillon lactosé et tournesolé qui doit rester bleu. On peut parfaire le diagnostic par l’agglutinabilité, avec les réserves faites page 220.

Cette méthode exige trois ou quatre jours. Elle est assez compliquée, mais a donné de bons résultats à l’auteur. Elle a été imitée par Drigalski et Conradi (1902).

L'auteur l’a simplifiée, en 1902. La première partie de la technique est remplacée par la suivante : On ajoute à un litre d'eau suspecte, préalablement filtrée à travers un papier filtre, 30 grammes de peptone Dufresne neutralisée ; on place le liquide à -|- 24° pendant vingt heures ; on filtre à nouveau s’il y’ a des grumeaux ; on additionne de sérum antityphique; on filtre ; on ensemence les grumeaux du filtre sur gélose phéniquée, lactosée et tournesolée, etc.

Cette technique est plus simple ; elle nécessite, par contre, l'emploi d’un sérum antityphique.

H. Procédé de la culture filtrante. — C’est le procédé de Cambier. Cambier (1901) a proposé la méthode décrite page 153. Le B. d'Eberth seul pourrait traverser la bougie (fig. 182) et l’ensemencement, dans l’intérieur de celle-ci, du produit de la filtration ou de la centrifugation d’une grande quantité d’eau, donnerait, à l’extérieur de la bougie une culture pure du B. d'Eberth , si celui-ci était présent. Biffi a vite montré que le

Colibacille passait aussi bien que le B. d'Eberth. 11 a proposé (méthode impossible- en raison du graud nombre de variétés de Colibacilles , de Paracolibacilles, etc.) d’introduire à l’intérieur de la bougie un sérum agglutinant pour les Colibacilles, ce qui les empêcherait de passer. Cambier a reconnu que le Colibacille passe à travers la bougie si on emploie le bouillon ; il a, alors, préconisé le milieu suivant, qui entraverait, au maximum, la culture des autres microbes et favoriserait celle du B. d'Eberth :

Solut. aqueuse à 3 p. 100 depeptone

Dufresne .... 1 000 ce.

— à 1 p. 100 de soude

caustique. . . . 80-120 cc.

— saturée à froid de

chlorure de sodium 80-120 cc.

Mélanger à froid après stérilisation préalable à -f 115°.

Lesieur a repris ces recherches en 1902 ; voici ses conclusions 1 : « Le B. d’Eberth traverse, toujours et rapidement les parois des petites bougies Chamberland F. Le Colibacille (môme eh milieu de Cambier) les traverse aussi le plus souvent, et presque dans le même temps. Cependant, quelques échantillons ne les traversent pas. Il n’est donc pas toujours possible de séparer, à coup sûr, l’une de l’autre ces deux espèces par la méthode de Cambier. »

Pour Vherry (1902) la culture de Colibacille traverse en vingt-quatre heures la bougie Berkefeld n° 8 et met six jours à traverser la bougie Chamberland F. C’est inexact.

I. Procédé utilisant le sérum agglutinant. — Nous avons déjà vu le sérum antityphique agglutinant être employé dans le procédé de Chantemesse (p. 43i).

1 Lesieur, Sur la valeur du procédé de Cambier. Journal de Physiologie et de Pathologie générale, juillet 1902.

Fig. 182.

Procédé de Cambier.

A,tubed’Esmarch.

B, bougie filtrante. — Z, liquide nutritif.

ANALYSE BACTÉRIOLOGIQUE DE l’eAU

Procédé de Vindelbandt (1902). — L’auteur utilise le sérum d’un lapin immunisé, à pouvoir agglutinant supérieur à 1 p. 10 000. On met à l’étuve (3-5 jours) des ballons de bouillon ensemencés avec une grande quantité d’eau suspecte (eau 1 centimètre cube, bouillon 10 centimètres cubes). La culture développée, on enlève le voile, puis on agglutine avec le sérum. On centrifuge, on recueille le culot qu’on ensemence sur gélatine ou gélose tournesolée en boîtes de Pétri. Ce sont en grande majorité des B. d’Eberth qui se développent, entraînés qu’ils Avaient été en flocons, grâcè au sérum agglutinant. Cette méthode nous paraît peu pratique, bien que très sensible ; elle décèle le B. d’Eberth dans 100 000 litres d’eau contaminée par une anse de platine de culture (Schepilewski) .

J. Résumé. — En somme, on recherchera surtout la présence et la quantité de Colibacilles dans une. eau suspecte. C'est là le fond de l’analyse qualitative , en vue de savoir si une eau est souillée de matières fécales et peut, par conséquent, à un moment donné, devenir typhogène, si les matières fécales proviennent d’un typhique. On répond donc : eau pure, si le Colibacille est absent ou en très petite quantité ; eau à surveiller, si le Colibacille est déjà en quantité notable ; eau impure à rejeter, si le Colibacille est très abondant (voir plus haut, les chiffres, p. 420). L'analyse se réduit donc presque toujours à la recherche du Colibacille , et toute la technique précédente est orientée en ce sens.

Cependant, on peut rechercher le B. d'Éberth, soit en analysant, avec tous les procédés décrits, les cultures obtenues par la simple recherche du Colibacille, soit en se servant des méthodes spéciales ci-dessus décrites. Mais, cette recherche est rarement faite. Elle se heurte à de grandes difficultés, et peut être fort longue. Elle est, en outre, presque toujours négative, le B. d’Éberth n’existant plus dans l’eau suspecte au moment où les fièvres typhoïdes sont diagnostiquées. Enfin, cette recherche est inutile, puisque toute eau contenant du Bacille d'Eberth contiêndra (sauf dans le cas, rare, de contamination par les seules urines) beaucoup de Colibacilles, et que la présence de ces der-

niers suffira à faire considérer l’eau comme non potable.

Si, toutefois, on veut absolument arriver à isoler le B. d'Éberth d’une eau, on se souviendra de la série des caractères distinctif que nous avons résumés page 421. On se souviendra surtout que seule Y agglutinabilité , par un sérum anti-typhique expérimental •* très agglutinant, constitue un critérium spécifique. Beaucoup de B. d'Eberthy isolés des eaux, ne sont pas, ou sont peu, agglutinables à leurs premières générations ; il faudra rechercher cette agglutinabilité à la dixième ou douzième génération en bouillon.

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