SOLUTIONS

la putréfaction de la viande. 11 a, en outre, rendu ce bouillon très riche en peptone par l’autodigestion de l’estomac de porc.

On hache 500 grammes de viande de veau et on les fait macérer à froid, pendant 24 heures, dans un litre d'eau. Le mélange est mis à l'étuve pendant quelques heures ; la putréfaction fait disparaître le sucre.

D’autre part, 200 grammes d’estomac de porc finement haché ont été mis, pendant 24 heures, à + 50°, dans un litre d’eau additionné de 10 centimètres cubes d'HCl pur.

La macération de viande est filtrée sur de la ouate hydrophile alcalinisée et salée à 0,5 p. 100. La macération d’estomac est filtrée sur un linge. On les mélange. On alcalinise. On porte un quart d’heure à + 115°. On filtre sur papier Chardin ; on répartit en ballons et on stérilise un quart d’heure à -f- 110°. On peut clarifier, après le premier chauffage, avec un fragment de chlorure de calcium et un morceau de phosphate de soude.

Tel est ce milieu très peptoné et non sucré . Ce milieu imaginé pour la culture du bacille de la diphtérie de l'homme , a également servi à cultiver le microbe de la péripneumonie bovine, la bactérie du charbon symptomatique. Il convient très bien pour les autres microbes et peut être utilisé couramment avec avantages.

L. Pepto-gélo-sel de Metchnikoff. — Dissoudre à chaud, dans 1.000 grammes d’eau.

Peptone Chapoteaut 10 grammes.

Sel marin 5 —

Gélatine blanche extra ......... 20 —

Alcaliniser très légèrement. Cinq minutes à l’autoclave à -J- 115°. Filtrer sur papier Chardin. Répartir. Stériliser à -f 11 0°-ll 5°.

M. Bouillon-sang-sérum. — On ajoute 5, 10, 20, 50 p. 100 de sérum, de liquide d’ascite ou de sang. On peut (Achalme) employer la solution d'hémoglobine commerciale à 1 p. 100 préalablement filtrée sur l’appareil Kitasato.

JS. On se souviendra que des quantités, même très faibles de

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substances antiseptiques peuvent empêcher le développement des microbes dans le bouillon, ou en modifier profondément la morphologie, comme l’ont vu Charrin et Guignard (p. 10, fig. 4).

| 2. — Milieux solides

Les milieux solides se divisent, comme les milieux liquides, en naturels et artificiels.

Nous avons déjà parlé (p. 66) de leur découverte par Koch, en 1881. On se reportera au chapitre vu (p. 194) pour trouver l’explication des avantages de leur emploi.

A) — Milieux naturels

On peut solidifier des liquides naturels ou artificiels, ou

employer des substances naturellement solides.

1° Sérum sanguin. — Le sérum sanguin est le plus souvent employé à l’état solide.

Obtention du sérum. — Le mieux est de recueillir le sang aseptiquement, comme nous l'indiquerons à propos de la sérothérapie.

A l’abattoir le sang est recueilli, aussi proprement que possible, au moment de la saignée d’un bœuf,# d’un cheval ou de tout autre animal. On le reçoit dans des cristallisoirs en verre de Bohême, à couvercle (fig. 48), d’une contenance de deux litres et préalablemment stérilisés à l’autoclave1. (La stérilisation par la chaleur sèche a l’inconvénient de faire adhérer

1 Bien que l’opération ne se fasse pas aseptiquement, il faut néanmoins stériliser les récipients, et manipuler avec le plus de propreté possible, la stérilisation ultérieure ne devant s’effectuer qu’à 60°.

Fig. 48.

Cristallisoir en verre de Bohême, pour recueillir le sang du bœuf à l’abattoir.

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le caillot aux parois, ce qui diminue la récolte de sérum). Il ne faut pas se servir d'éprouvettes pour recueillir le sang, car le caillot peut occuper tout le diamètre de l’éprouvette et empêcher la prise d’un sérum clair. On préparera plusieurs

Fig. 49.

Bain-marie, avec régulateur métallique de Roux, pour la stérilisation du sérum liquide par la méthode de Tyndall.

cristallisoirs de deux litres, pour profiter de la saignée totale d’un bœuf ou d’un cheval.

Ces cristallisoirs, remplis de sang aux trois quarts de leur hauteur, sont laissés sur place dans un endroit frais. Il ne faut pas les transporter sous peine d’avoir un sérum coloré ; il faut les mettre dans un endroit aussi froid que possible pour éviter

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le développement des germes avant la stérilisation. Le sérum est un milieu qui convient mal pour la pullulation des microbes ; aussi cette précaution suffit-elle. Au bout de vingtquatre heures de repos, le caillot s’est rétracté et occupe le centre du cristallisoir. On répartit le sérum avec une pipette (en ayant soin de ne pas toucher le caillot) dans des tubes à essai bouchés à la ouate, stérilisés d’avance. On met environ 10 centimètres cubes de sérum dans un tube à, essai. Le sérum, ainsi obtenu, varie d’aspect suivant l’espèce animale dont il provient; celui du bœuf est jaune ambré, celui du cheval est presque blanc, celui de l’àne est lactescent, celui du lapin est limpide.

Les tubes sont alors apportés au laboratoire et stérilisés par la méthode de Tyndall ou du chauffage discontinu (p. 45). Ils sont placés, trois heures par jour, pendant plusieurs jours de suite, dans un bain-marie réglé de -f- 58° à + 60° 1. Entre ces séances, ils doivent être maintenus à -f 25° ou -f- 30° pour permettre la germination des spores non détruites, et dont le mycélium naissant sera tué aisément par le chauffage suivant.

Le sérum se solidifie à -f- 65° ou -f- 70° ; s’il est porté à une température trop élevée, il perd sa transparence ; il faut donc le chauffer au degré minimum nécessaire à sa coagulation, c’est ce qu’on appelle la gélification ou gélatinisation du sérum. Les tubes doivent être chauffés dans une position inclinée, pour que le sérum solidifié offre une longue surface ; il ne doit pas toutefois venir toucher le tampon d’ouate. Koch a fait construire un appareil spécial pour cette opération. C’est une étuve quadrangulaire peu profonde dont la coupe est représentée figure 50. L’espace (A) est rempli d’eau par le tube (B). Un couvercle en verre (C) est recouvert d’une lame de feutre (D). Une cale (E) permet l’inclinaison convenable de l’appareil.

Dans les appareils français, l’étuve de Koch est munie d'un

1 On a construit un bain-marie spécial muni d’un régulateur à membrane d’Arsonval représenté figure 51. Il est inutile d’avoir cet appareil qu'on peut aisément remplacer en réglant un bain-marie quelconque. Voir, page 327, le bain-marie de Wiesnegg.

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régulateur d’Arsonval (fig. 51). Elle est réglée à -f 65 e ou + 68°.

Étuve de Koch pour gélification du sérum, avec régulateur d’Arsonval.

Le temps nécessaire varie entre une demi-heure et une heure.

Il faut surveiller étroitement l’opération à travers le couvercle

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vitré. Dès qu’un tube prend une demi-transparence ambrée, il doit être examiné, et immédiatement retiré s’il est de consistance solide ; les tubes restés trop longtemps à la chaleur de l’étuve deviennent opaques. Le sérum ainsi obtenu est plus ou moins transparent suivant l’espèce animale dont il provient et la perfection de la gélatinisation. 11 va sans dire qu’on peut solidifier du sérum sans posséder une étuve de Koch.

Après avoir été éprouvés à l’étuve à + 38°, les tubes de sérum seront placés verticalement (à cause de l’eau de condensation qui s’accumule à la partie inférieure) dans une armoire avec un capuchon de caoutchouc pour éviter une trop rapide dessiccation (fig. 52) ; un tube dont la surface est desséchée ne pourra plus servir ; la végétation ne s’opérerait pas.

Les capuchons de caoutchouc seront stérilisés dans le sublimé ; sans cette précaution ils propagent des moisissures qui, descendant le long du coton contre le tube de verre, atteignent le sérum et le contaminent.

Si le sang a été recueilli aseptiquement, la gélatinisation se fait par le même procédé, mais sans qu'il soit nécessaire de recourir à la tyndallisation.

Le sérum solidifié sert à cultiver le Bacille de la tuberculose (Koch), à caractériser le microbe de la suppuration caséeuse, à faire le diagnostic bactériologique de la diphtérie de l’homme, etc.

Pour avoir du sérum glycériné , on ajoute 6 à 8 p. 100 de glycérine stérilisée au sérum avant la distribution dans les tubes à essai. Il faut une température de -f- 75° à + 78° pour gélifier le sérum glycériné. Il se dessèche moins que le sérum simple et convient particulièrement pour le développement du bacille de Koch (Nocard et Roux, 1887).

Gessard (1910) recommande pour les recherches qui récla-

Fig. 52.

Tube de sérum gélifié.

1, capuchon de caoutchouc. — 2, tampon de coton. — 3, sérum. — 4, eau de condensation.

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ment l’intégrité des principes animaux et des propriétés humorales de préparer à froid un milieu renfermant 7,5 p. 100 des principes du sang : le sang est recueilli dans le 4/3 de son volume d’eau salée à 20 p. 100, il n’y a pas de coagulation. Le liquide surnageant est apte à se coaguler quand on lui ajoute 9/10 d’eau. On peut incorporer au milieu des globules rouges lavés, des sels, du glucose, etc.

2° Liquides pathologiques. — On pourrait traiter, par les mêmes procédés, des liquides pathologiques tels que : liquide d’hydrocèle, d’ascite, de pleurésie, etc.

3° Œuf. — On a cultivé sur des blocs de blanc d’œuf cuit les bactéries colorées qui tranchent bien sur ce fond blanc. On découpera aseptiquement de petits cubes de blanc d’œuf dur, et on les mettra dans des tubes à essai, comme s’il s’agissait d’un morceau de pomme de terre (voir plus loin).

Dorset a recommandé (1901) dès milieux à l’œuf (blanc et jaune mélangés) soit au jaune seul. On peut incorporer le jaune d’œuf cru à de la gélose glycérinée (Capaldi, Bezançon et v. Griffon) ou à de la purée de pommes de terre glycérinée (Thisalix). Ces milieux sont préconisés pour l’obtention rapide des cultures du bacille de Koch. Le milieu à l’œuf complet (Dorset) stérilisé par chauffage discontinu à 72-74° constitue le milieu de choix.

4° Fragments d’organes . — Voir page 476, les cultures sur foie, rate.

Des fragments de placenta humain, découpés aseptiquement, après avoir grillé la surface, et introduits dans de larges tubes d’Esmarch, sont de bons milieux pour le B. pyocyanique, la B. charbonneuse, le Staphylocoque doré, etc. (P. Guéniot).

5° Pomme de terre. — La pomme de terre très riche en matières hydrocarbonées constitue un bon milieu, très fréquemment employé. Elle peut être utilisée crue, mais la végétation des microbes se fait mieux sur la pomme de terre cuite.

MILIEUX DE CULTURE

Le procédé primitif de Koch consistait à f-aire cuire à l’eau une pomme de terre entière, à la couper par le milieu avec un couteau flambé, et à déposer les deux moitiés dans un cristallisoir lavé au sublimé et muni d’un couvercle. Il a été modifié de la façon suivante, pour les cas, d’ailleurs rares, où on a besoin d’une grande surface de pomme de terre.

On choisit des pommes de terre de bonne qualité, de variété blanche, ayant la peau fine. On les lave en les frottant avec une brosse dure pour entraîner toutes les impuretés de la surface ; on enlève à la pointe du couteau tous les yeux, tous les points malades, et on les plonge pendant une heure dans une solution de sublimé à 1 p. 1000. Toutes ces précautions sont indispensables, car la pomme de terre est fréquemment souillée par le B. mesentericus vulgatus, communément appelé Bacille de la pomme de terre (. Kartoffelbacillus ), microbe extrêmement répandu dans le sol, et dont les spores peuvent résister quelque temps à + 130°. La pomme de terre peut aussi contenir le Bacillus mesentericus fuscus (bacille brun) et le B. mesentericus ruber (bacille rouge de Globig) dont les spores sont également très résistantes. On voit quelquefois ces bacilles se développer, malgré la stérilisation, sur la pomme de terre mal préparée.

On lave au sublimé de grands cristallisoirs (10 centimètres de diamètre sur 5 de haut) à couvercle rodé, en verre de Bohême (pour supporter de hautes températures), et on place dans le fond de ceux-ci plusieurs disques de papier filtre, humecté de sublimé. Les pommes de terre sont alors coupées en deux moitiés égales, et chacune de celle-ci est placée, la face plane en l’air, dans un cristallisoir.

On a construit des couteaux en verre pour sectionner les pommes de terre sans laisser à leur surface des sels de fer

Fig. 53.

Tube à pomme de terre.

capuchon de caoutchouc. — 2,

tampon de coton.

— 3, fragment de pomme de terre. —

4, rétrécissement. —

5, eau rendue par la pomme de terre.

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qui la rendaient noirâtre . On peut couper la pomme de terre avec un couteau quelconque à large surface, et laver la surface avec de l’eau stérilisée .

Les cristallisoirs, fermés hermétiquement par leurs couvercles rodés, sont soumis pendant une heure à 100°, et à + 125° pendant vingt minutes, dans l’autoclave.

Certains cristallisoirs présentent vers le tiers supérieur, une petite ouverture circulaire qu’on obture avec un tampon de ouate, et qui peut servir à ensemencer la pomme de terre sans soulever le couvercle.

Le procédé de Roux est bien préférable au précédent ; il est presque uniquement employé. Le récipient est composé d’un

Fig. 54.

Support de Rodet, pour l’observation simultanée de plusieurs cultures sur des cubes provenant de la même pomme de terre.

tube à essai de 2cm,5 de diamètre environ sur 25 centimètres de long, qui porte vers son quart inférieur un étranglement empêchant la tranche de pomme de terre de tomber au fond ; dans la chambre inférieure se condensera l’eau qui sortira de la pomme de terre pendant la cuisson (fig. 53).

On pourra toujours étrangler soi-même un gros tube à essai (tube d’Esmarch). Un tampon d'ouate placé au fond du tube à la rigueur remplacerait l’étranglement.

On coupe les pommes de terre crues, avec un couteau ou un emporte-pièces , en fragments parallélipipédiques ou semicylindriques pouvant entrer dans le tube ; on les lave à l’eau pour enlever les sels de fer, on les essuie au papier buvard. *Un tampon de ouate recouvert d’un capuchon de papier filtre ferme le tube qui est placé dans l’autoclave. On chauffe une demi-heure à 100°, et un quart d’heure à + 115° ou -f 120°. Les tubes sont prêts à être ensemencés. On peut, avec eux,

MILIEUX DE CULTURE

faire des cultures anaérobies, impossibles dans les cristallisoirs (voir p. 180).

Rodet a imaginé un petit appareil tout en verre pour faciliter l’observation simultanée de plusieurs cultures végétant sur des cubes de pomme de terre, lesquels peuvent provenir de la même pomme de terre. La figure 54 nous dispense d’une description. On coupe, dans une grosse pomme de terre, de tout petits cubes d’égale grosseur qu’on pique sur chaque pointe ; on place le tout dans un cristallisoir (comme il a été dit plus haut), et on fait stériliser. On a ainsi sous les yeux Ï8 ou 24 colonies ayant poussé dans les mêmes conditions sur la même pomme de terre.

La pomme de terre a été aussi employée en purée (bouillie) qu’on distribue dans des boîtes de Pétri (fig. 17) ou dans de petits cristallisoirs.

La pomme de terre entre dans la composition de la gélatine d'Elsner (voir p. 101).

Les cultures sur pomme de terre sont surtout commodes pour étudier les caractères macroscopiques des colonies. Elles ont été utilisées pour la différenciation de certains microbes (B. coli et Éberth). Tous les microbes ne cultivent pas sur la pomme de terre ( Pasteurella ), tandis que d’autres s’y développent abondamment ( Salmonella , Lignières).

On obtient de belles cultures du Bacille tuberculeux en humée-1 tant la pomme de terre avec de Veau glycérinée ou du bouillon glycériné, dont l’excès occupe la partie inférieure du tube. Ce milieu convient également pour le Bacille de la morve.

6° Artichaut. — Les cultures de certaines bactéries colorent l’artichaut en vert émeraude [B. coli ) tandis que d’autres [B. typhique ) végètent sans coloration (Roger). Ce milieu con^ vient également bien pour la culture des levures.

On enlève les feuilles, on coupe le fond en petits#cubes, en ayant soin de conserver le foin. On introduit les morceaux dans des tubes dont l’extrémité fermée est remplie d’ouate humide. On place le foin en haut. On ferme avec de l’ouate et on stérilise un quart d’heure à -J- 415°, dans l’autoclave. On ensemence au point où se fait l’insertion des fleurs.

MILIEUX SOLIDES ARTIFICIELS

7° Fruits. Racines. — Différents fruits , des racines ont été directement employés comme milieux de culture. C’est ainsi que la carotte convient très bien à la végétation des streptocoques, du champignon du muguet (G. Roux). Les figues, les * fraises, les abricots , les amandes ont été utilisés. On traitera les racines ou tubercules comme la pomme de terre; on partagera aseptiquement les fruits avant de les placer dans un tube ou un petit cristallisoir.

8° Milieu de Soyka. — Soyka a recommandé, pour ses cultures envases clos, le mélange suivant, qui est un milieu mixte, en partie artificiel et en partie naturel (animal ou végétal) :

10 grammes.

5 cent, cubes.

Bien mélanger, et distribuer dans des cristallisoirs en verre. Stériliser en plusieurs temps, dans la vapeur, deux jours de suite. On obtient un milieu solide, blanc opaque.

B) — Milieux artificiels

Pour les obtenir on solidifie un des milieux liquides artificiels déjà étudiés.

1° Gélatine. — La gélatine peut être définie : du bouillon rendu solide par l’addition d’une certaine quantité de gélatine. C’est un milieu très transparent. Son seul inconvénient est de fondre à une température relativement basse (+ 21° à -f- 22°) ; seuls peuvent donc pousser sur la gélatine solide les microbes qui végètent à cette température. C’est ainsi que le B. de la tuberculose, le Streptocoque pyogène ne végètent pas ou végètent mal sur la gélatine. 11 faut des étuves spéciales pour les cultures sur gélatine en hiver et en été (voir p. 121). La gélatine se liquéfie sous l'influence des diastases (trypsine) sécrétées par quelques microbes.

Il faut employer de la gélatine répartie assez récemment en tubes ; si elle a eu le temps de se dessécher, la surface est

Riz en poudre .

Lait

Bouillon neutre

MILIEUX DE CULTURE

absolument impropre à la végétation microbienne. On peut alors, pour régénérer la gélatine, ajouter au tube quelques gouttes de bouillon, fondre au bain-marie et laisser refroidir à * nouveau. Gomme tous les milieux solides, la gélatine est moins nutritive que le bouillon qui a servi à la fabriquer.

A. Gélatine-peptone. — La gélatine ordinaire est la gélatinepeptone. Nous supposons le bouillon peptoné , fabriqué comme il a été dit plus haut, neutre ou légèrement alcalin.

La gélatine est livrée dans le commerce sous forme de plaques minces (gélatine extra-fine). On les coupe avec des ciseaux en petits morceaux qu’on lave dans l’eau distillée. On ajoute au bouillon 10 p. 100 de gélatine, soit 100 grammes pour un litre. Le mélange se fait dans un vase émaillé, une capsule de porcelaine ou tout autre récipient qu’on met chauffer dans un bain-marie à -f- 100°, pendant dix minutes environ, jusqu’à ce que la gélatine soit fondue en totalité. On remuera constamment.

Il faut ensuite neutraliser avec une solution de carbonate de soude, car la gélatine acidifie souvent le bouillon. On prolonge l’ébullition quelques minutes après ia neutralisation.

'Pendant que la gélatine est encore très chaude, on la filtre sur papier Chardin, en ayant soin d’amorcer le filtre au préalable ; elle passe très claire et assez rapidement. Si la gélatine n’était pas suffisamment transparente, on lui ajouterait, à -f- 50° environ, deux blancs d’œufs bien battus dans 50 centimètres cubes d’eau, et on reporterait à l’ébullition : l’albumine du blanc d’œuf en se coagulant clarifiera la gélatine. La filtration s’opère en général très bien dans un entonnoir de verre ordinaire ; si la gélatine se solidifiait avant la fin de l’opération, on placerait l’appareil quelques instants à l’autoclave sans pression. On peut même laisser la filtration se faire complètement dans l’autoclave.

On a imaginé un entonnoir bain-marie pour filtrer la gélatine. Il est représenté et schématisé dans la figure 55. C’est un entonnoir, à double paroi métallique, (a) contenant de l’eau qu’on verse en [d). Un bec de gaz chauffe continuellement le