GÉLATINE

Il suffit d’ajouter, avant la filtration, 4 ou 5 gouttes d’une solution phéniquée (à 1/20) pour 10 centimètres cubes de gélatine.

D. Gélatine d’Elsner. — La gélatine d’ËLSNER (1895) est un mélange de gélatine, de décoction de pomme de terre et d’iodure de potassium. Elle sert à déceler le B. d'Eberth dans les selles typhiques et à le distinguer du B. coli.

On prend 500 grammes de pommes de terre, qu’on pèle soigneusement, et qu’on râpe. On les fait macérer pendant trois ou quatre heures dans un litre d’eau. On tamise, et on laisse déposer pendant toute une nuit. On décante le liquide et on lui ajoute 150 à 250 grammes de gélatine. On fait dissoudre à feu doux. Ce milieu est très acide- On ajoute 20 à 30 centimètres cubes d'une solution de soude, jusqu'à ce que la réaction devienne faiblement mais encore nettement acide. On filtre, on stérilise et on répartit en ballons de 100 grammes environ. Quand on veut se servir de cette gélatine, on ajoute à chaque ballon de 100 grammes, 1 gramme d’iodure de potassium, et on le répartit en larges tubes à essai destinés à être roulés, d'après la méthode d’EsMARCH. Pour Grimbert, le milieu d’ELSNER devrait ses qualités à l’acidité de la gélatine.

Grimbert a modifié la technique de la fabrication de la gélatine d’Elsner. Après macération, le liquide est filtré pour le débarrasser de l’amidon, puis porté à l’autoclave pendant dix minutes pour coaguler les matières albuminoïdes. On filtre de nouveau. On ajoute 15 p. 100 de gélatine. L’acidité est alors titrée de façon que 10 centimètres cubes soient neutralisés par 4 à 5 centimètres cubes d’eau de chaux.

E. Gélatine de Piorkowsky. — On prend un litre d'urine, émise depuis quarante-huit heures, ayant donc une réaction alcaline. On y fait dissoudre à chaud, 5 grammes de peptone et 33 grammes de gélatine. On refroidit à 55° et on ajoute un blanc d’œuf battu dans 50 grammes d’eau. On stérilise à -f- 115°. On répartit en tubes à essai. On peut stériliser à nouveau à -}- 110°.

F. Raisin gélatiné. — Le raisin gélatiné est une décoction de 250 grammes de raisin sec dans un litre d’eau, avec 10 p. 100 de gélatine. Ce milieu a été utilisé pour cultiver les levures.

MILIEUX DE CULTURE

G. Gélatines colorées. — Les gélatines colorées sont constituées par de la gélatine peptone ordinaire additionnée de différents mélanges de substances colorantes. Les .microbes, en se développant, produisent, sur ces milieux, des changements de coloration qui peuvent servir à la différenciation de l’espèce. Les gélatines colorées n’ont pas donné tous les résultats qu’on espérait à ce point de vue. Elles se décolorent spontanément à l’air si on tarde à les employer.

Spina, dès 1887, avait montré qu’en colorant de la gélatine avec quelques gouttes d’une solution concentrée de sulfo-indigotate de soude ou de bleu de méthylène, on avait un milieu qui changeait de teinte suivant le microbe cultivé. C’est Noeggerath (1888) qui fit la première application de ces faits pour le diagnostic des microbes en général et du B. typhique en particulier.

La gélatine de Nœggerath est assez difficile à fabriquer. On mélange, dans l’ordre suivant, des solutions aqueuses saturées de couleurs d’aniline :

Bleu de méthylène Violet de gentiane Vert de méthyle .

Chrysoïdine . . .

Fuchsine

centimètres cubes.

et on ajoute de l’eau distillée jusqu’à 200 centimètres cubes. Le liquide ainsi obtenu est brun tirant sur le bleu, et colore le papier à filtrer en gris foncé. On attend une quinzaine de jours ; il se produit des changements de coloration qu’on corrige en ajoutant un peu de l’une ou de l’autre des couleurs ci-dessus de façon à revenir au bleu noirâtre. Il faut 6 à 8 gouttes de cette solution pour colorer à point un tube ordinaire de gélatine. On ensemence par stries et on met à 1 étuve. Chaque microbe fixe telle ou telle couleur qui imprègne la colonie ; autour de celle-ci est une zone décolorée qui peut s'étendre à tout le tube de gélatine. La culture de B. typhique est d’une belle teinte violet évêque.

Gasser (1890) n’ayant pas réussi en employant la gélatine de

GÉLOSE

Nœggerath, colora simplement la gélatine de quelques gouttes d’une solution de fuchsine. 11 vit que le Colibacille et le Bacille d'Eberth sont les seuls microbes qui poussent en colonies rouges.

Legrain (1891) a cultivé plusieurs microbes sur les milieux teints à la fuchsine.

Wurtz (1892), mettant à profit la remarque de Chantemesse et Widal sur la mise en liberté d’acide succinique par le B. coli cultivé en bouillon lactosé, a préconisé les milieux tournesolés qui ne changent pas de teinte sous l’influence du B. d'Eberth et deviennent rouges avec le B. coli.,

Ramond a fait remarquer qu’il faut une dose assez forte d’acide pour faire virer la teinture de tournesol ; il propose de la remplacer par la rubine acide, réactif très sensible de l’acidité. La gélatine, ou mieux la gélose lactosée à 4 p. 100, est additionnée de quelques grains de rubine acide jusqu’à coloration rouge cerise. On porte le tube à + 70° ou -f- 80°, et on ajoute deux gouttes de solution aqueuse saturée de carbonate de soude ; le milieu se décolore. On filtre et on stérilise. Ce milieu se colore en rouge, en quelques heures, sous l’influence du B. coli et reste incolore avec le B. d'Eberth.

2° Gélose. — La gélose, ou agar-agar, a, sur la gélatine, le grand avantage de rester solide aux températures inférieures à -f- 70°. Elle peut donc être mise à l’étuve aux mêmes températures que le bouillon. En outre, très peu de microbes liquéfient la gélose ; son inconvénient est d’être toujours plus ou moins louche. Son emploi en bactériologie date des travaux de Koch, enl881.

L agar-agar, ou varech corné , provient d’une algue des mers des Indes, nommée Gelidium spiriforme (ordre des Floridées). La matière gélatineuse qu'on en retire a été étudiée, en 1859, par Payen qui lui donna le nom de Gélose. C’est une substance amorphe, isomère de la cellulose, dure et cornée à l’état sec, se gonflant et se dissolvant dans l’eau bouillante. Elle se solidifie en gelée par le refroidissement. Elle solidifie cinq cents fois son poids d’eau, c’est-à-dire forme, à poids égal, dix fois plus de

MILIEUX DE CULTURE

gelée que la meilleure gélatine. A elle seule la gélose serait très peu nutritive ; il faut lui incorporer du bouillon. On la trouve dans le commerce sous forme de longs filaments roulés en paquets.

Miquel a conseillé, en 1885, l'emploi de la mousse d’Irlande , gelée provenant du Chondrus crispsus, algue également de l’ordre des Floridées, qu’on rencontre sur les côtes de l’Atlantique. Ce milieu a été peu employé.

A. Gélose-peptone. — Pour préparer la gélose-peptone, on se sert, comme pour la gélatine, de bouillon peptonéet alcalinisé, qu’on solidifie avec la gelée d’agar-agar.

Deux procédés sont préconisés. Le premier est une modification de celui de Macé, recommandé par Thoinot et Masselin ; le second est dû à Roux.

a. Premier procédé. — On fait digérer pendant vingt-quatre heures 10 à 15 grammes de gélose coupée en petits morceaux, dans un demi-litre d’eau acidulée à l’acide chlorhydrique, à 6 p. 100 ; on remue à plusieurs reprises. On filtre sur un linge, on lave largement à l’eau distillée la gélose qui reste sur le filtre ; on lave enfin à la solution de carbonate de soude jusqu’à ce que l’eau de lavage ne présente plus de traces d’acidité. L'algue gonflée qui est restée sur le filtre est alors1 jetée dans 500 grammes de bouillon peptoné, neutre ou alcalin, sans dépôt, chauffé préalablement au bain-marie à l’ébullition. On s’assure que le mélange est neutre (la gélose bouillant en milieu acide se transformerait en sucre ) ; on agite constamment avec un agitateur en verre. Dix minutes d'ébullition suffisent en général à incorporer la gélose au bouillon. Quelques auteurs ajoutent alors 10 grammes d’une solution aqueuse concentrée de gommet arabique, pour faire adhérer plus intimement la gélose aux tubes à essai ; mais la gomme rend la gélose assez louche ; nous

1 Macé recommandait de maintenir pendant vingt-quatre heures l’algue gonflée dans 500 grammes d’eau additionnée de 25 grammes d’ammoniaque, avant de la jeter dans le bouillon. Ce temps est inutile.

GÉLOSE

ne l’employons pas en général. La solation de gomme arabique doit être conservée neutre et stérile.

O.n filtre alors sur papier Chardin. Cette filtration doit se faire à chaud, plus nécessairement encore que pour la gélatine, car la gélose se solidifie vers 4- 50°. On opérera avec un des dispositifs décrits pour la gélatine, page 98. Nous conseillons de faire cette filtration avec un simple entonnoir en verre, garni de papier filtre, introduit dans un flacon; le tout sera placé dans l’autoclave sans pression. On répartit alors en tubes à essai, en ayant soin de ne pas souiller de gélose la partie supérieure du tube qui touchera le tampon de ouate. La stérilisation se fera en portant, pendant quinze à vingt minutes , les tubes de gélose dans l’autoclave à + 115°. Le chauffage à. de hautes températures présente moins d’inconvénients pour la gélose que pour la gélatine.

Les tubes, une fois stérilisés, seront refroidis dans la position inclinée pour que la gélose présente la surface nécessaire aux cultures par stries ; son peu de transparence ne permet pas d’apprécier les cultures par piqûre, néanmoins on les utilise pour conserver la vitalité des bactéries. En raison de l’élévation de son point de fusion, la gélose ne peut être enroulée en tubes d’Esmarch.

Le tampon de ouate sera entouré de papier filtre ou d’un capuchon de caoutchouc lavé au sublimé, et le tube sera conservé dans une armoire après avoir été éprouvé vingt-quatre heures à l’étuve à -f- 38°. On aura soin de conserver les tubes verticalement , car la gélose rend souvent une notable quantité d’eau qui viendrait souiller le coton; après l’ensemencement la même position verticale est de rigueur pour ne pas diluer les colonies.

b. Procédé de Roux. — 11 diffère du précédent pour les premiers temps de l’opération. A 1.000 grammes de bouillon peptoné alcalinisé, on ajoute 15 grammes de gélose en morceaux; on chauffe à -f- 100° pendant une heure, en agitant; on tamise sur de la mousseline; on laisse refroidir à -f- 50°, et on ajoute un blanc d’œuf. On mélange intimement, on réchauffe à -j- 110° pendant trois quarts d’heure, on filtre à chaud, etc.

MILIEUX DE CULTURE

Procède rapide. — On prépare, d’une part, du bouillon par macération de 500 grammes de viande dans 500 grammes d’eau, on filtre sur un linge et on chauffe jusqu’à l’ébullition pour coaguler les matières albuminoïdes après avoir ajouté le sel et la peptone. On fait dissoudre, d’autre part, 15 grammes de gélose dans 500 grammes d’eau. Lorsque les deux liquides sont en ébullition, on verse la dissolution de gélose dans le bouillon en maintenant quelques instants sur le feu pendant l’alcalinisation. La filtration, à chaud, sur papier Chardin, se fait très rapidement. Répartir, stériliser.

B. Géloses glycérinées, lactosées. — La gélose glycérinée est, depuis les travaux de Nocard et Roux, en 1887, très employée pour la culture du Bacille de la tuberculose , elle constitue également un bon milieu pour le Bacille de la morve. On se servira, de bouillon glycériné à 5 p. 100 et on opérera comme ci-dessus. Il en sera de même pour les géloses glycosée. laclosêe , glycoglycérinée, etc. On prépare le milieu nutritif qu’on désire et on solidifie avec la gélose.

La gélose glycérinée se dessèche moins que la gélose-peptone ordinaire.

c. Gélose de Veillon. — Pour la culture des anaérobies on fait macérer 600 grammes de viande de bœuf haché, pendant 2 à trois jours, dans un litre d’eau, puis on fait bouillir 10 minutes. On ajoute 1 p. 100 depeptone, 0,5 p. 1 00 de chlorure de sodium (le sel n’est pas indispensable) et 1,5 p. 100 de gélose. On porte à l’autoclave à 100° pendant vingt minutes. On alcalinise. Lorsque la température est descendue à 45° on ajoute un blanc d’œuf, puis du glucose dans la proportion de 1,5 p. 100 (ou 0,8 p. 100 de sucre dont 0,4 de glucose et 0,4 de lactose ou de saccharose, Tissier). On porte 45 minutes à 120°, on filtre à chaud sur papier Chardin et on répartit dans des tubes de 17 centimètres de hauteur et sur 17 millim. de diamètre à raison de ^centimètres de gélose. On stérilise 20 minutes à 110°.

C. Gélatine-gélose. — La gélatine-gélose (Jensen) est un milieu où la solidification du bouillon est obtenue par un mélange de gélose et de gélatine. Les avantages de ce mélange sont les

GÉLOSE

suivants : transparence, liquéfaction à basse température, mais au-dessus de + 30°. C’est donc un milieu clair, malléable et moins liquéfiable que la gélatine, il sera très utile en été.

On prépare de la gélatine comme il a été dit plus haut et on ajoute 1/2 p. 100 de gélose. Il faut veiller à ce que cette addition n’acidifie pas le milieu.

D. Gélose sanglante. — On puise aseptiquement du sang dans l’artère fémorale du chien, dans la carotide du lapin, et on mélange, à + 40°, à la gélose (1/3 de sang) (Bezançon et Griffon). On incline les tubes. On peut aussi (Pfeiffer) étaler simplement quelques gouttes de sang sur la surface de la gélose solide.

E. Géloses colorées. — Les géloses colorées se prépareront exactement comme les gélatines colorées (voir p. 102). L’usage en est le même.

Voir les géloses colorées (: milieux de Digralski ; milieux au vert malachite ) destinées à la différenciation du B. d’Eberth et du Colibacille, page 42 i.

F. Gélose Wertheim. — Le milieu de Wertheim, est un mélange d’une partie de sérum du sang (homme, veau) et de deux parties de gélose. Ajouter le sérum stérile à un tube de gélose qu'on fait liquéfier; agiter et laisser refroidir.

G. Gélose Ghantemesse. — On fait bouillir 10 grammes de gélose dans 500 grammes d’eau peptonée à 3 p. 100 (peptone Defresne). On ajoute ensuite 10 grammes de lactose. On filtre sur papier, on stérilise à -f- 120°.

Au moment de s’en servir, on ajoute, par 10 centimètres cubes du mélange, IV gouttes d'une solution phéniquée à 3 p. 100 etl centimètre cube de teinture de tournesol bleu sensible.

Ce milieu a été préconisé pour cultiver le bacille d’Éberth .

h. Gélose-pomme de terre. — Nicolle a recommandé pour obtenir rapidement des cultures abondantes du bacille de la morve un milieu préparé de la façon suivante : on fait macérer 12 heures 500 grammes de viande hachée dans un litre d’eau.

MILIEUX DE CULTURE

d'autre part, 500 grammes de pomme de terre coupées en gros morceaux dans un second litre. On mélange les deux macérés, on ajoute 30 grammes de peptone, 10 grammes de sel, 20 grammes de glycérine et 60 grammes de gélose. Le reste de la préparation n’offre rien de spécial. Le milieu doit être alcalinisé.

i. Mousse d’Irlande. — La mousse d’Irlande se prépare comme il suit : d’après Miquel, 300 grammes d'algue sont mis à digérer dans 10 litres d’eau bouillante ; on maintient l’ébullition pendant plusieurs heures, et on passe au tamis. Le liquide est de nouveau porté à l’ébullition, et filtré à chaud. La liqueur est évaporée au bain-marie, et on la laisse sécher dans des cuvettes de porcelaine. Ce résidu dur est ajouté au bouillon dans la proportion de 1 p. 100, pour faire une gelée nutritive, qu’on stérilise à + 110°. Le milieu ainsi obtenu ne fond qu’à + 55°.

En 1890, Puccinelli a conseillé de mettre simplement 6 grammes de Fucus crispas dans 200 grammes de bouillie de viande neutralisée, et de placer le tout pendant une heure dans le stérilisateur à vapeur. Le liquide, filtré à chaud, se solidifie par le refroidissement.

j. Moût de bière-agar. — Le moût de bière-agar (parties égales de moût et d’eau avec 1,5 p. 100 d’agar) sert surtout à cultiver les levures.

k. Gélose-placenta. — 250 grammes de placenta sont mis dans 500 grammes d’eau : ébullition pendant quarante-cinq minutes : filtration; ramener à 500 centimètres cubes; ajouter 1 p. 100 de peptone sèche, 0,5 p. 100 de chlorure de sodium et 1,5 p. 100 de gélose. Ce serait un excellent milieu. (Vicarelli. 1903.)

3° Mie de pain. — La mie de pain a été utilisée comme milieu de culture des champignons.

On peut se servir simplement de tranches de pain blanc stérilisées à la chaleur sèche, et imbibées d’eau, de bouillon, de jus de prunes, de décoction d’engrais, etc. (Brefeld).

Il est préférable de préparer de la poudre de pain. On émiette de la mie de pain blanc et on la laisse sécher à l’air. Lorsqu'elle est bien sèche, on la moud très finement dans un mou-

MILIEUX SOLIDES ARTIFICIELS

lin à café. On met quelques grammes de cette poudre au fond d'un ballon, on ajoute deux fois et demie le poids d’eau et on stérilise à la vapeur pendant une demi-heure, deux fois avec un jour d’intervalle.

4° Substances inertes imbibées de liquides nutritifs. —

On a imbibé de liquides nutritifs des substances solides inertes, telles que le sable ou le plâtre .

Soyka (1886) a cultivé le B. anthracis dans un « sol artificiel » composé de 25 grammes1 de sable stérilisé, imbibé de 2 à 4 centimètres cubes de bouillon peptoné. La formation de^ spores serait ainsi considérablement activée.

Engel, Hansen ont cultivé des levures sur du plâtre humide . On fabrique des blocs de plâtre, en forme de tronc de cône de 3 centimètres de hauteur, et on les place dans des cristallisoirs de verre contenant lcm,5 de hauteur d’eau stérilisée pour faire tremper la moitié du cône. Le cristallisoir est recouvert et le tout stérilisé. La sporulation des levures s’opérerait très rapidement dans ces conditions.

Salomonsen a utilisé des cylindres de plâtre, moulés dans des tubes de verre, et stérilisés à l’étuve sèche à 4- 115° dans une éprouvette bouchée à la ouate.

MUSROB. DES MAL. INFECT. DES ANiM.