CULTURES DANS LES MILIEUX AÉRÉS

1° Cultures dans les couches profondes des milieux exposés à l'air. — Certains anaérobies poussent dans les couches inférieures des liquides nutritifs qui remplissent des récipients suffisamment étroits et profonds (éprouvettes, tubes à essai, flacons, etc.), sans qu’il soit besoin de faire le vide. Ce n’est pas un procédé à employer ; l'expérience prouve simplement que tous les anaérobies ne sont pas également exigeants et que certains supportent la présence d’une quantité notable d’oxygène.

Liborius a préconisé (1886) la culture des anaérobies dans les couches profondes des milieux solides et particulièrement de la gélose sucrée. La méthode de Liborius, modifiée par Veillon a permis de pousser très loin la connaissance des anaérobies.

2° Cultures dans les milieux aérés mais isolés de l’atmosphère. — Un procédé de culture assez employé consiste à recouvrir d’une couche d'huile de vaseline ou d’huile stérilisée de deux centimètres de hauteur le milieu nutritif liquide ou solide ensemencé. 11 vaut mieux faire stériliser l’huile dans le récipient en même temps que celui-ci vide ou déjà chargé du bouillon, de la gélatine ou de la gélose; ces milieux, privés d’air pendant le ch auffage, ne peuvent le reprendre pendant le refroidissement, l'huile surnageant à la surface. On obtiendra ainsi facilement des cultures du Bacille de Nicolaïer, de Baclerium Chauvœi , etc. L’huile, même très pure, est parfois émulsionnée au cours de la végétation de certains microbes, tels que le Vibrion cholérique : elle n’est cependant pas dédoublée, il n’y a pas production de glycérine (J. Courmont et Doyon).

Il est préférable d’employer Yhuile de vaseline.

Koch a proposé de recouvrir la surface de la gélatine, coulée sur plaques, d’une mince plaque de verre ou de mica qu’on dépose sur la gélatine encore molle. Ce procédé n’est plus employé. La culture en couche mince rend à peu près impossible une anaérobiose parfaite. Les variantes proposées (emploi de la gélose par Marino) n’ont pas permis de pallier aux inconvénients de la méthode.

Rosenthal cultive en tubes ; sur le liquide, il verse de la lano-

CULTURE DES ANAÉROBIES

Pipette pour conserver les cultures anaérobies.

A, pipette vide. — B, pipette chargée et fermée.

line liquéfiée à la chaleur (couche de 1 centimètre et demi). On bouche à la ouate et on stérilise à 4- 120°. On refroidit rapidement.

Pour ensemencer, on chauffe légèrement la lanoline (qui fond à -j- 42°) ; on refroidit rapidement.

C’est le procédé du tube cacheté.

Si le microbe doit dégager beaucoup de gaz, on étrangle la partie du tube occupée par la lanoline,

3° Cultures dans des récipients scellés à la lampe après

Fig. 84.

Tube à essai pour la culture des anaérobies.

A, tube rempli. — B, tube après la fermeture de l’étranglement à la lampe.

ébullition des milieux nutritifs. — L’ébullition chasse Pair

CULTURES SUR DES MILIEUX EXPOSÉS A l’AIR

contenu dans les milieux nutritifs ; on peut alors fermer le récipient avant le refroidissement. Il n’y a aucun inconvénient à porter pendant quelques minutes à l’ébullition du bouillon ensemencé avec des anaérobies à spores très résistantes tels que le Bacille du tétanos ou le Vibrion septique. On se sert pour cela de pipettes munies d’un étranglement (a) comme le montre la figure 83 (A), qui sont stérilisées à + 150° au four Pasteur. On chauffe le bouillon, la gélatine ou la gélose ensemencés, et on aspire dans la pipette après avoir cassé et flambé la pointe. Dès que la substance nutritive a atteint l’étranglement (a), on met le doigt sur l’ouverture supérieure, on relève le tube dans une position oblique et on ferme à la lampe l’étranglement, puis la pointe. Le tube complètement plein est figuré en (B). Cette méthode est un excellent moyen de conserver pendant de longs mois en bouillon des cultures anaérobies virulentes , par exemple le Bacille de Nicolaïer. On peut remplir ces tubes avec de la gélatine ou de l’agar et les ensemencer ensuite par piqûre en cassant une pointe pour quelques instants. Des tubes à essai avec étranglement (fig. 84) remplis de bouillon, ensemencés et fermés à la lampe, même sans ébullition préalable, suffisent pour cultiver les anaérobies peu exigeants. On peut en somme combiner les méthodes 3° avec celles décrites à 2°.

4° Cultures sur des milieux exposés à l’air mais additionnés de substances très oxydables. — Kitasato et Weyl (1890) ont proposé d’ajouter à la gélose peptonée des substances très oxydables, telles que : le formiate de soude, le sulfindigotate de soude, le pyrogallate de potasse, le chlorhydrate d'hydroxylamine, la résorcine, l’hydroquinone, etc. Dans le même but, Liborius ajoutait à la gélose une certaine quantité de glucose. Le milieu le plus employé est ainsi fabriqué :

Gélose peptonée 4 000 grammes.

Glucose 20 —

Sulfindigotate de soude 1 —

Cette gélose, de couleur bleu noir, est coulée dans un tube à essai jusqu’à quelques centimètres du bord. L’ensemencement

CULTURE DES ANAÉROBIES

se fait par piqûre aussi profonde que possible, avec une longue aiguille de platine. Les tubes ensemencés sont mis à l’étuve à + 38°. Au bout de quelques heures, des gaz abondants se produisent qui peuvent même faire sauter le bouchon de ouate. La gélose se décolore ; le glucose et le sulfindigotate s’oxydent sous l’influence du développement microbien (le même phénomène se produirait à la longue sans culture) et s’emparent de l’oxygène dissous ; le tube bleu noir passe au jaune foncé, l’indigo bleu s’étant transformé en indigo blanc.

On peut également se servir, dans le même but, de gélose ordinaire additionnée de 0,5 p. 1000, de formiate de soude, ou colorée en violet par quelques gouttes de teinture de tournesol.

Tarozzi (1905) cultive les anaérobies, en bouillon, à l’air, en ajoutant au milieu des fragments de foie, de rate, de rein, de ganglions, fraîchement excisés au lapin, au cobaye, à la souris (mettre un jour ou deux en présence et faire bouillir 5 minutes), Bandini et Gerardi, plus récemment Guillemot et Szcawinski ont confirmé ces recherches.

H Arras (1906) obtient de bons résultats avec du bouillon de foie ou de cerveau.

Wrzosek, Pfuhl (1907), Kata (1908) ajoutent au bouillon 0,3 à 0,7 p. 100 de Na2 SO3 et un fragment de gélose ; les anaérobies se développent, lentement d’abord, puis de façon intense et produisent leurs toxines habituelles, Pour Kata, le sérum frais, à la place de la gélose, augmente la production de toxines.

Grixoni cultive les anaérobies en présence de l’air en ajoutant au bouillon des sels d’ammonium. Ori ajoute 10 gouttes d’extrait glycériné de foie par 5 centimètres cubes de bouillon.

5° Cultures dans une atmosphère confinée dont l’oxygène est absorbé par des substances très oxydables. — ;

La substance oxydable n’est plus mélangée au milieu nutritif, comme dans la méthode précédente, mais est déposée autour de lui dans l’atmosphère restreint d’un tube clos qui enveloppe le tube à culture.

Hans Buchner (1889) fait absorber l’oxygène par l’acide

CULTURE DONT l’OXYGÈNE EST ABSORBÉ 169

pyrogallique (fig. 85). Le petit tube (A), chargé d’agar ensemencé avec l’anaérobie, bouché à la ouate, est soutenu dans le grand tube (B) par un support en fil de fer (C) ou un ressort à boudin. Une solution alcaline d’acide pyrogallique (1 gramme d’acide pyrogallique dans 10 centimètres cubes d’une solution

Fig. 85. Fig. 86.

Appareil de H. Buchner. Appareil de Turro.

de potasse caustique à 10 p. 100) est versée dans le tube (B) qui est fermé à frottement par un bouchon de caoutchouc. Le tout est mis dans une étuve à + 38°. De légères secousses imprimées fréquemment au tube activent l’absorption de l’oxygène. Buchner a pu cultiver ainsi le Vibrion septique.

Turrô (1902) emploie le dispositif représenté ligure 86. Il s’agit d’un tube à culture (a) dont le col (c) est entouré d’un ballon (6) destiné à contenir l’acide pyrogallique.

Bordet (1904) place ses cultures sous une cloche à vide et ne fait le mélange de potasse et d’acide pyrogallique, grâce à une dispositif ingénieux, que lorsque le vide est déjà réalisé.

MICROB. DÉS MAL. INFÊCT. DES ANIM.

470 CULTURE DES ANAÉROBIES

Les plaques de Stüller sont de petites boîtes de Pétri (voir p. 25), retournées après avoir été chargées en agar. On verse dans le couvercle devenu la partie inférieure, 2 grammes de pyrogallol et 20 centimètres cubes de solution à 10 p. 100 de KOH. On coule 5 centimètres cubes de paraffine liquide dans la rainure et, par-dessus, 10 centimètres cubes de KOH à 10 p. 100. On peut examiner les colonies avec un grossissement de 60 D.

Sellards (1904) utilise les propriétés réductrices bien connues du Phosphore. En deux heures, le phosphore absorbe tout l’oxygène, les vapeurs ne sont pas nuisibles aux microbes. L’anaérobiose se conserve pendant des semaines et des mois ; 'jj elle n’est pas gênée par le prélèvement des colonies. La méthode est applicable aux milieux solides ou liquides.

6° Cultures dans des milieux dont l’oxygène est absorbé par des microbes aérobies. — U utilisation de V oxygène libre par les microbes aérobies peut faciliter la culture des anaérobies ; les aérobies remplissent le rôle de substance oxydable. Dès 1886, Liborius avait obtenu des cultures anaérobies sur gélatine recouverte d’une culture des microbes de la putréfaction.

Roux (1887) a institué l’expérience de la façon suivante :

On met dans un tube à essai bouché à la ouate quelques centimètres cubes de gélose ; on fait bouillir et refroidir rapidement dans l’eau froide. On ensemence l’anaérobie par piqûre aussitôt la solidification effectuée. On verse sur la gélose une petite quantité de gélatine liquide qu’on laisse également solidifier. On verse ensuite sur la gélatine quelques gouttes d’une culture d’aérobie, de Bacillus subtilis par exemple. On ferme le tube à la lampe et on dépose dans l’étuve à -f- 38°. L’aérobie consomme tout l’oxygène et l’anaérobie se développe bien. Il faut casser le tube pour prélever de la semence anaérobie non contaminée par le B. subtilis.

Cet inconvénient n'existe pas avec le dispositif représenté figure 87 et dù à Sai.omonsen. Le petit tube (A) chargé de gélose est destiné à l’anaérobie ; le grand (B), chargé de bouillon, est ensemencé avec un aérobie. On ferme à la lampe en (a).

CULTURE SUR DES MILIEUX EXPOSÉS A l’AIR 171

J. Courmont et Nicolas sont arrivés, les premiers, à cultiver un anaérobie (le Vibrion septique) à l'air libre, dans du bouillon étalé en couche mince mais contenant en même temps un microbe aérobie (un diplocoque) qui absorbait l’oxygène (le bouillon en était dépourvu malgré sa grande surface d’exposition à l’air). Toutes les cultures mixtes d’un aérobie et d’un anaérobie ne donnent pas ce résultat : ainsi le mélange du Vibrion septique et du Staphylocoque pyogène ne laisse pas pousser l’anaérobie parce que le staphylocoque sécrète des substances solubles qui entravent la pullulation du Vibrion septique. Ces expériences expliquent bien la végétation possible des anaérobies dans la nature.

La culture des anaérobies peut être réalisée à la faveur du Proteus vulgaris et du m. prodigiosus (Penso et Noog), d’un tétragène (Van ErxMengen) du Micrococcus candicans (Kaninsky), du bac. fluorescens var. non liquefaciens, du B. du rouget 1, et des blastomycètes (Beyerinck).

Pour expliquer la culture des anaérobies en présence de certains aérobies, on a invoqué, outre l’utilisation de l’oxygène, la présence de ferments solubles (Kedrowski), de ferments organisés (von OEttingen) , de substances réductrices (Tarozzi). Il est certain que, dans certains cas, la culture de l’anaérobie a lieu sans que l’aérobie ait consommé l’oxygène.

Toutes les méthodes précédentes ne sont pas essentiellement pratiques; la plupart constituent simplement des expériences curieuses2.

1 Le B. du rouget agirait à la faveur de l’hydrogène sulfuré qu’il produit. On peut remplacer le B. du rouget par l’addition à un milieu glucosé de traces de sulfure de calcium (M. Nicolle; Alleaux et Césari),

2 Voir page 790 l’utilisation de ce procédé pour obtenir en grand la culture du B. de Nicola'ier à l’air libre.

Fig. 87.

Dispositif de Salomonsen pour la culture des anaérobies en présence d’un aérobie.

CULTURE DES ANAÉROBIES

7° Cultures dans une atmosphère confinée dont l’air a été refoulé et remplacé par un gaz inerte. — Un appareil à faire le vide n’est pas indispensable pour chasser l’air d’un récipient à culture. Il peut être remplacé par le refoulement de l'air à l’aide d’un gaz inerte. Wurtz a proposé, en 1889, l’artifice suivant : on charge de gélose un tube à essai et on le bouche par un bouchon de caoutchouc muni de deux tubes de

Fig. 88. Fig. 89.

l Appareil de Wurtz pour la cul- Appareil de Roux pour la culture des anaérobies dans une ture des anaérobies dans un atmosphère de gaz d’éclairage. gaz inerte.

verre (A) et (B) (fig. 88). Le tube (A) effleure la gélose et est embranché sur un tube de caoutchouc qui amène du gaz d'éclairage. On fait passer le courant de gaz pendant cinq minutes en même temps qu’on fait bouillir la gélose à l'aide d’un bec Bunsen pour empêcher qu’elle ne s'imprègne de gaz. Au bout de cinq minutes on verse par le petit entonnoir (B) 1 ou 2 centimètres cubes de pétrole stérilisé. On enlève le bouchon de caoutchouc et on le remplace par un tampon de ouate. Pour ensemencer, on incline le tube de façon à mettre à nu la