ISOLEMENT PAR LA CHALEUR

faire circuler un gaz inerte dans la rigole qui entoure la goutte de culture. On pourrait se servir de la chambre humide de Ranvier ordinaire en mettant dans la rainure quelques gouttes d’un liquide réducteur (pyrogallate de potasse, formiate de soude, etc.).

On a également construit des platines chauffantes avec deux tubulures permettant d’amener un gaz inerte dans la cavité centrale.

11° Réactifs de l’oxygène. — L’indigo blanc se colore en bleu sous l’influence de traces d’oxygène. Il suffit de faire barboter un gaz dans une solution d’indigo blanc pour s’assurer qu’il est bien privé d’oxygène.

Pour savoir si une culture renferme encore de l’oxygène, on ajoute de la solution à 2 p. 1000 de sulfo-indigotate de soude jusqu’à coloration bleue, puis 1 p. 100 d’une solution normale de soude et 1 p. 100 de glucose. Dès que tout l’oxygène a été extrait, la coloration bleue disparaît, l’indigo étant réduit par le glucose.

§ 2. — Isolement des anaérobies

Nous supposons maintenant qu’on veuille obtenir une culture pure d’un anaérobie mélangé à d’autres microbes dans le sol, dans un produit pathologique quelconque, dans une culture mixte, etc. Les méthodes d 'isolement des anaérobies doivent être bien connues puisqu’elles seront la base de toute recherche concernant ces microbes.

1° Isolement par la chaleur. — La plupart des anaérobies pathogènes (Vibrion septique, Bacille de Nicolaïer, etc.) se reproduisent au moyen de spores très résistantes à la chaleur. On peut donc chauffer pendant 10 minutes à -f- 100° le mélange microbien, et tuer ainsi tous les autres microbes. Pasteur a, le premier, indiqué ce procédé pour l’isolement du Vibrion septique, et Kitasato l’a appliqué à celui du Bacille du tétanos. 11 va

ISOLEMENT DES ANAÉROBIES

sans dire- qu’on ne pourrait pas isoler l’un de l’autre ces deux anaérobies par cette méthode.

2° Isolement par inoculation. — On inocule à une espèce animale, très sensible au microbe anaérobie à isoler, le mélange qui le contient ; après la mort de ranimai, on ensemence aseptiquement les produits pathologiques de celub-ci. Exemple : on inocule sous la peau de la cuisse d’un cobaye une pincée de terre végétale, de terreau bien fumé, de vase. Le cobaye meurt, au bout de vingt-quatre ou trente-six heures, de septicémie gangréneuse. On ensemence la sérosité péritonéale, on cultive dans le vide, et on obtient une culture pure de Vibrion septique. Pour le Bacille tétanique, l’inoculation est moins utile, parce que le microbe reste cantonné dans la plaie avec les impuretés inoculées.

On fera bien de combiner la méthode de l’inoculation avec celle du chauffage, c’est-à-dire d’inoculer an cobaye des produits chauffés pendant dix minutes à -f- 100°, car certaines espèces facultatives, même non pathogènes, peuvent venir souiller les sérosités pathologiques et donner des cultures mixtes.

3° Isolement par des cultures liquides. — C’est la première méthode de Pasteur, qui faisait le vide et lui substituait de l’acide carbonique dans les milieux liquides. Nous n’entrerons pas dans de grands détails, car elle est facile à concevoir. On opère exactement comme pour les cultures aérobies;(voir p. 152), c’est-à-dire qu’on fait un certain nombre de dilutions et on répartit le liquide dilué par petites quantités dans un très grand nombre de récipients. Ces derniers, au lieui d’être de simples ballons ou tubes à essai, seront les tubes décrits plus haut pour la culture des anaérobies en milieux liquides (tube Pasteur, pipette, tube de Salomonsen, etc., p. 178 et suivantes). On fait le vide, avec ou sans refoulement par l’hydrogène, et on met à l’étuve à -f- 38°. On examine alors les tubes qui se sont troublés. On contrôle la pureté de la culture obtenue par une culture en tube de gélatine enroulée dans le vide, par l’ensemencement à l’air qui doit rester

ISOLEMENT PAR CULTURES SOLIDES

stérile à moins que l’anaérobie soit facultatif, par l'inoculation, par F examen microscopique, et, au besoin, par une nouvelle série de dilutions.

L’obligation de faire le vide dans un grand nombre de tubes rend l’isolement des anaérobies en milieux liquides très long, et, par conséquent, moins pratique que par les méthodes suivantes.

4° Isolement par des cultures sur milieux solides. — On peut employer indifféremment la gélatine ou la gélose.

Comme principe général on commencera toujours par faire des dilutions comme pour les cultures aérobies ; en général, on ensemence un tube de gélatine avec une goutte du mélange ; on prend une goutte de cette première gélatine pour ensemencer un second tube, et une goutte de ce second pour un troisième. La première goutte peut être diluée dans' de l’eau stérilisée, si on suppose très riche la flore microbienne du produit.

Fig. 105.

Tube de Liborius contenant des colonies anaérobies dans la profondeur de la gélatine.

A. Méthode de Koch. — La méthode primitive de Koch consistait à étaler la gélatine ensemencée sur une plaque et à appliquer sur cette gélatine encore chaude et visqueuse une feuille de mica stérilisée ; les bords de cette feuille étaient lutés avec de la paraffine. On pouvait observer le développement à travers le mica. Cornil et Babes conseillaient une lame de verre très mince. Ces méthodes n’appartiennent plus qu’à 1 histoire.

B. Méthode de Liborius. — Liborius a isolé des anaérobies en les cultivant simplement dans un tube de gélatine ou de gélose rempli aux trois quarts de la hauteur (p. 165). On mélange bien la goutte ensemencée à la gélatine ou la gélose en remuant celle-ci encore chaude avec une aiguille de platine, et on laisse refroidir. Les microbes anaérobies poussent dans la profondeur (fig. 105). Pour les recueillir, il faut couper le tube de verre à

ISOLEMENT DES ANAÉROBIES

leur niveau avec un couteau à verre et un charbon de Berzélius, et recevoir le morceau de gélose dans une boîte Pétri stérilisée. On coupe celui-ci en tranches minces jusqu’à la colonie -à étudier. On peut aller puiser la colonie avec une pipette sans sacrifier le tube et surtout sans le contaminer (Yeillon). Cette méthode est peu pratique lorsque les microbes liquéfient la gélatine (méthode de Liborius) ou développent beaucoup de gaz (méthode de Yeillon).

C. Méthodes de Klebs et Yignal. — Klebs et Yignal ont conseillé, en 1887, la culture sur gélatine en tubes capillaires pleins. On fait des pipettes longues de 1 mètre, avec un tube

Fig. 106.

Fragments du long tube de Vignal plein de gélatine avec colonies anaérobies.

de verre de 2 ou 3 millimètres de diamètre, et on les stérilise. On fait bouillir la gélatine dans un tube à essai ordinaire, et on la laisse refroidir dans un courant d’hydrogène, amené par une pipette plongeant au fond du tube. Yers -J- 25° on l’ensemence dans l’hydrogène, on l’agite, pour répartir les germes, et on aspire la gélatine encore liquide dans la longue et fine pipette. On ferme à la lampe les deux extrémités et on possède un tube capillaire clos, complètement rempli de gélatine privée d’oxygène et parsemée de germes anaérobies qui donneront autant de colonies (fig. 106) . On fera trois tubes pour diluer comme avec la méthode de Liborius. Pour aller saisir une colonie, on lave le tube de verre au sublimé et à l’alcool absolu, on le sèche avec du papier stérilisé, et on le coupe au niveau de la colonie.

D. Méthodes de Blugher et dé Botkine. — L’isolement peut se faire par cultures sur plaques de gélatine d’après la méthode de Koch pour les aérobies.

Pour priver les plaques d’oxygène, Blücher a recommandé

ISOLEMENT PAR CULTURES SOLIDES

un appareil consistant en une petite cloche de verre, en forme d’entonnoir, placée dans un cristallisoir rempli de glycérine diluée ; la cloche est chargée par un poids de plomb et l’hydrogène pénètre par en haut.

Fig. 107.

Tube de C. FrænJcel pour la culture des anaérobies sur gélatine enroulée par la méthode d’Esmarch.

Tube de Roux pour cultures sur plaques de gélatine enroulée par la méthode d’Esmarch.

L’appareil de Botkine est peu différent.

E. Méthode de Marino. — Marino (1907) préconise la gélose glucosée à 5 p. 100, additionnée de 3 p. 100 de sérum de cheval chauffé à 55° pour faire des dilutions successives. La gélose de chaque tube est versée dans la moitié la plus large d'une boîte de Pétri et recouverte de l’autre moitié, l’ouverture tournée vers le haut, on recouvre le tout d’une plaque plus grande .

ISOLEMENT DES ANAÉROBIES

Les modifications apportées par Liefmann, Fehrs et Sachsmuke à la technique de Marino n’ont pas remédié aux imperfections de la méthode.

F. Méthode de G. Frænkel. — C. Frænkel isole les anaérobies sur gélatine roulée en tubes d'Esmarch (voir p. 158) avec l’appareil dessiné (fig. 107).

C’est un simple tube à essai fermé avec un bouchon de caoutchouc qui laisse passer deux tubes de verre dont l’un (A)

Fig. 109.

Tube de Roux pour la culture des anaérobies sur plaques de gélatine, dans un gaz inerte.

plonge jusqu’au fond du tube. Le bouchon est recouvert de paraffine. On ensemence la gélatine liquide (on fait toujours plusieurs tubes pour diluer comme il a été dit plus haut), on fait barboter 1 hydrogène pendant quatre minutes, on ferme les deux tubes à la lampe et on enroule la gélatine, comme il a été dit page 158.

Ce procédé est très simple ; il a tous les avantages de celui d’Esmarch; on. peut aller puiser les colonies sans sacrifier le tube et sans le contaminer.

G . Méthode de Roux. — Le procédé de Roux isole aussi les anaérobies sur gélatine enroulée dans un tube. On prend trois tubes de verre ayant la forme figurée page 191, on les charge d’une petite quantité de gélatine stérilisée ; on les ensemence successivement (système des dilutions) avec le liquide à étudier.

ISOLEMENT PAR CULTURES SOLIDES

On étrangle le tube en (b), on pousse le tampon et on étire en (a) au-dessus du coton (fig. 108). On met le tube en communication avec une machine pneumatique pendant que la gélatine est encore liquide et on ferme en (a). On roule le tube d’après la méthode d’Esmarch. On peut aussi coucher simplement le tube sur le côté et avoir une culture sur plaque. On puisera avec une aiguille de platine les microbes des colonies par l’ouverture (a) du tube dont on aura cassé la pointe ; on pourra, si cela est nécessaire, couper longitudinalement le tube et détacher la gouttière supérieure lorsque la gélatine aura été simplement refroidie en plaque et non roulée en Esmarch ; la gouttière inférieure sera alors traitée comme une plaque ordinaire.

Pour éviter l’emploi d'une njachine pneumatique, Roux a conseillé le tube représenté figure 109. On remplit de gélatine liquide et ensemencée avec un petit entonnoir capillaire. On étrangle alors en (a) et (a’), on pousse les tampons de ouate (A) et (A’), on effile en (6) et (6’) et on met (b) en rapport avec une source d’hydrogène. On ferme dans le gaz en {b') puis en (6). Le tube peut alors être simplement couché horizontalement pour avoir une petite plaque ou roulé par le procédé d’Esmarch.