CHAPITRE?X

Après avoir fait choix d'un lixaleur, nous devons délerminer de quelle manière il doit être appliqué aux tissus, pour donner les meilleurs résultats. Nous laissons de côlé les procédés physiques (dessiccation, chaleur), dont Tétude sera mieux placée dans les méthodes spéciales. Nous ne nous occuperons que du traitement des tissus par les mélanges fixateurs.

Nous devons examiner successivement le mode de prélèvement des pièces, le volume de fixateur à empjoyer, la durée et la température de la fixation et enfin le traitement consécutif au lavage.

Prélèvement des pièces. — L'animal est saigné de préférence ou tué par le gaz d'éclairage ^ ou par le chloroforme et lixé comme il est expliqué pour les autopsies (p. 545). Nous supposons ici ranimai ouvert et l'organe à étudier mis à nu. L'essentiel est d'extraire cet organe, sans lui faire suLir de traumatisme qui puisse altérer sa structure. Pour le libérer de ses attaches conjonctives., on se servira de préférence d'un bistouri bien tranchant et on évitera de le saisir avec les pinces à dissection. Celles-ci ne sont appliquées que sur la gaine conjonctive ou graisseuse qui entoure l'organe. Une fois l'organe isolé, le traitement variera, suivant que le tissu est contractile ou non contractile.

Organes non contractiles. — Ce sont par exemple les glandes, le système nerveux, les organes parenchymateux tels que le foie, la rate, le rein. Pour le travail courant, notamment avec le mélange de Bouin, la fixation doit être faite en deux temps.

Premier temps. — On coupe d'abord dans ces organes des

1. Dans un bocal ou sous une cloche pour les petits anioiaux. dans le four Pasteur pour les gros animaux : on fait arriver le gaz par une des tubulures du couvercle.

fragments assez volumineux, gros comme une noix ou une noisette et on les jette dans le fixateur. Celui-ci sera contenu dans un bocal à large ouverture, garni au fond d'une couche d'ouate pas trop épaisse. Les morceaux seront disposés de façon à ne pas se toucher.

Deuxième temps. — Dès qu'ils sont suffisamment durcis, c'est-à-dire au bout d'une heure ou deux, on les retire un à un, pour procéder au second temps de la fixation. Celui-ci consiste à débiter les morceaux en fragments définitifs, ayant au maximum 5 mm. d'épaisseur, et à les plonger dans du mélange fixateur neuf.

Ce procédé en deux temps a pour luit d'obtenir des morceaux bien réguliers et convenablement orientés. En eiïet, les organes frais sont très mous et très difficiles à couper correctement en tranches minces : on risque d'obtenir des fragments informes, qui se recroquevillent dans le fixateur. Au contraire, en ayant soin de durcir la périphérie de morceaux un peu volumineux, on peut les réduire ensuite en tranches de l'épaisseur voulue. Pendant la fin de la fixation, ces tranches conservent leur forme.

Pour couper les organes, il faut prendre une lame à la fois large, mince et bien tranchante, telle qu'un couteau à cerveau. A son défaut, on se servira d'un rasoir réservé à cet usage, à cause de l'action du fixateur sur la lame. 11 est nécessaire de poser l'organe sur une plaque de liège, afin que les sections puissent être complètes, franches, et que le tranchant du couteau puisse pénétrer légèrement dans le support, sans toutefois s'émousser. Pour pratiquer les sections, il ne faut pas appuyer la lame mais la tirer à soi d'avant en arrière, de manière à diviser les tissus sans les écraser. On comprend qu'un scalpel ou bistouri, même très affilé, a une lame trop étroite et trop légère pour effectuer correctement ces mouvements.

Lorsque les tranches définitives sont débitées, on les porte dans un nouveau liquide fixateur frais, sur une légère couche d'ouate. On laisse ainsi s'achever la fixation.

Cette méthode ne peut être pratiquée avec les fixateurs à base de sublimé, car il faut éviter absolument le contact des instruments métalliques avec les pièces et avec le liquide.

Organes contractiles. — Dans cette catégorie, nous rangeons le tube digestif et la vessie. Il est essentiel de les fixer en extension, afin que les couches musculaires ne déforment pas la muqueuse en se contractant irrégulièrement.

Intestin. — On isole une anse intestinale ou une portion du gros intestin. On ligature une des extrémités et, par l'autre, on injecte, avec une pipette ou une seringue de verre, une quantité de liquide fixateur suffisante pour distendre modérément la cavité On achève de her l'extrémité par laquelle on a pratiqué finjeclion

et on plonge le loul dans le fixaleur, en maintenant la pièce S!ispendue par un des fils de ligature. Après fixation complète, on l)eut débiter en rondelles.

Estomac. — Pour les estomacs de petite dimension, procéder comme pour Tintestin; pour les grands estomacs, dont on ne peut fixer que des portions, voici comment il faut s'y prendre. On prépare une lame de liège de la dimension convenable (4 cent, de côté environ), de préférence percée en son centre d'une large ouverture (de 2 cm. de côté environ). On a soin de la tremper dans de la paraffine dure (60"), fortement chauffée (80°), de manière à ce qu'elle soit bien imbibée. Cette précaution est indispensable pour empêcher le liijuide fixateur de mouiller le liège et de faire diffuser le tannin dans la pièce à fixer.

On découpe rapidement une portion de la paroi stomacale et on retend sur le liège, sans l'étirer, en la fixant au moyen de fines épingles métalliques ou d'aiguillons de Hérisson, suivant la nature du fixateur. On fait fiotter le tout sur le fixateur, en ayant soin que la membrane soit en dessous. Si on s'est stîrvi d'une lame percée d'un orifice, on a soin de remplir cet espace de fixateur. Au bout de quelques heures, la membrane est suffisamment fixée pour qu'on puisse enlever les épingles et débiter en tranches.

Vessie. — Les vessies de petite dimension seront distendues modérément avee le liquide fixateur injecté à la seringue, puis liées au col et plongées dans le fixaleur.

Peau. — Opérer comme pour l'estomac, en ayant soin de ne pas distendre plus qu'à l'étal normal.

Poumon. — Il y a deux cas à distinguer. Lorsque les poumons forment de véritables sacs, comme chez les Amphibiens et les Reptiles, on les traite comme les anses intestinales ou les petits estomacs. Pour les poumons des grands Mammifères, si on ne peut les remplir de fixateur en les injectant par la trachée, le mieux est d'en prélever des fragments qu'on jette dans un fixateur alcoolique très pénétrant, de préférence le mélange de Duboscq- Brasil. En effet, dans les mélanges aqueux, les fragments surnagent et se iixent incomplètement. Pour l'étude fine du poumon, le mieux est de noyer dans le fixateur des fœtus de petits Mammifères ayant respiré.

Volume des pièces. — Nous avons déjà dit, à propos des li(juides osmiés très peu pénétrants, que les objets à fixer ne devaient pas avoir une épaisseur supérieure à 1 ou 2 mm. Cette règle est

commune à lous les fixateurs; même avec les liquides les plus pénétranls, il n'est pas bonde faire des tranches dont l'épaisseur dépasse 5 mm. Avec des morceaux de 1 cm. d'épaisseur, la fixation des parties centrales est insuffisante. On proportionnera donc ïépaisseur des pièces à la puissance de pénétration du fixateur : avec le Flemming, 2 mm. au maximum ; avec le Bouin, 5 à 6 mm. au maximum. Il n'en est pas de même pour la surface des tranches : celle-ci pourra être au?si considérable qu'on le désire. Pour les travaux topographiques, on pourra très bien faire de belles li^anches ayant 2 cm. sur 3 cm., dont les coupes tiendront sous une grande lamelle 22 X 32. Par contre, pour les études cytologiques, on ne prendra que des fragments très petits, de manière à favoriser autant que possible la fixation et à raccourcir la durée des manipulations.

Volume du fixateur. — Il est nécessaire que la composition du fixateur demeuie aussi constante que possible, pendant toute la durée de la fixation, malgré les actions osmotiques et chimiques exercées par les pièces à fixer. Il faut donc employer un volume de fixateur très grand par rapport à celui des pièces. Le chiffre classique est de cinquante fois, mais il pourra être diminué beaucoup pour les fixateurs osmiés (p. 281).

Pour faciliter la pénétration du fixateur et les courants de diffusion à l'intérieur de l'objet à fixer, il est nécessaire que ce dernier soit suspendu dans le liquide. On y arrive, soit au moyen d'un fil pour les organes ligaturés (intestin), soit en faisant flotter imemliranes piquées sur liège), soit en mettant une couche d'ouate au fond du récipient, soit enfin en suspendant l'organe dans un nouet de mousseline.

Durée de la fixation. — Nous l'avons définie à propos de chaque mélange fixateur. En principe, il vaut mieux prolonger la fixation, surtout avec les mélanges picroformolés, dans lesquels les pièces peuvent rester longtemps. Par contre, il ne faut laisser les pièces dans les fixateurs osmiés et dans le subhnié acétique que juste le temps nécessaire à la fixation, car ces liquides rendent les objets cassants. Pour le sublimé, on compte une heure par millimètre d'épaisseur. Enfin cette durée est fonction de la température; on peut la diminuer de moitié en fixant à l'étuve à 40°.

Température de la fixation. — Dans la majorité des cas, on fixe à la température ordinaire : c'est la règle pour les mélanges osmiés, à cause de la très grande volatilité de Tacide osmiqne,

Pour les autres liquides, il y a intérêt à fixer à l'éluve à 37" ou 40° au maximum. Les courants ascendants, qui se produisent dans le liquide chaud, mettent à chaque instant des nouvelles portions de fixateur en contact avec Tobjet. En outre, le pouvoir pénétrant est augmenté par l'élévation de la tem})érature. Il faut avoir soin de boucher hermétiquement les flacons, afin d'éviter la déperdition des produils volatils (formol, alcool, acide acétique).

Les liquides bouillants ne doivent être employés que pour des objets très difficiles à pénétrer, tels que les Arthropodes. Nous reviendrons sur ce sujet à propos des méthodes spéciales (p. 555).

Le froid retarde la fixation. Son emploi n'est indiqué que dans des cas très particuliers, par exemple pour éviter Tauto-digestion des cellules à grains de sécrétion. C'est ainsi (]ue Borrel fixe à la glacière avec un mélange d'Hermann modifié fp. 281).

Lavage après fixation. — Cette opération, souvent trop négligée par les débutants, est d'une importance capitale. En principe, dès que la fixation est terminée, il faut éliminer le plus tôt possible les substances fixatrices, parce que ces corps nuisent à la coloration ultérieure et à la conservation des coupes. Le dissolvant employé varie avec la nature du fixateur.

Les pièces fixées par les mélanges osmiés et bichromates, doivent être lavées à Veau courante ou au moins souvent renouvelée. Il est essentiel que celte eau ne soit ni trop calcaire, ni séléniteuse, de fagon à ne pas former de dépôts adhérents à la surface des pièces. La durée de ce lavage sera à peu près égale à celle de la fixation. On ne transportera les pièces dans l'alcool à 70" qu'après ce lavage, de manière à éviter la foimation des précipités. Pour les pièces fixées au Tellyesniczky (p. 282) il faut d'abord passer par l'alcool à 15°, et n'employer l'alcool à 70", que lorsqu'il ne donne plus de précipités.

Les pièces fixées au sublimé doivent être lavées à Valcool iodé. En effet l'alcool dissout le sublimé beaucoup mieux que l'eau; l'iode contribue encore à réliminaliun de ce sel, en le transformant en iodure de mercure. On met donc les pièces, au sortir du sublimé, dans de l'alcool à 70", auquel on ajoute une quantité de teinture d'iode suffisante pour lui donner une légère teinte brune. Au bout de quelque temps, l'alcool se décolore et on ajoute de nouveau de la teinture d'iode. On continue ainsi, par additions successives et en surNcillant, jusqu'à ce que l'alcool ne se décolore plus. On a soin de renouveler aussi l'alcool deux ou trois fois, suivant le nombre et le volume des pièces, car il faut éviter la formation, à leur surface, de cristaux d'iodure de mercure.

Ce lavage a une très grande importance pour faciliter la coloration des coupes, et pour éviter la formation, dans les tissus, de fins précipités, sous forme de poussières, d'aiguilles ou de granulations. Ces précipités sont dus non seulement au sublimé, mais encore aux combinaisons que forme ce sel avec les phosphates alcalins des tissus ou à

ses transformations en sels basiques insolubles. L'emploi de l'iode a pour but de solubiliser tous ces produits et d'empêcher la formation des précipités '.

Les pièces fixées dans les mélanges picriqiiés doivent toujours être lavées à Valcool. Il n'y a pas là seulement une raison de plus grande solubilité : l'acide picrique ne forme pas avec les éléments des tissus, comme les sels des métaux lourds, des combinaisons insolubles dans l'eau. Bien au contraire, les précipités formés par l'acide picrique avec les albuminoides sont facilement détruits par l'eau et doivent être d'abord durcis par l'action de l'alcool. 11 ne faut pas non plus effectuer le lavage à chaud, même avec de l'alcool (voir p. 271, note 1, et p. 348 le procédé de lavage de Jellinek).

L'élimination de l'acide picrique n'a pas besoin d'être complète pour pratiquer la déshydratation et l'inclusion. Pour les pièces fixées au Bouin et au Duboscq-Brasil, on pourra déshydrater de suite par l'alcool à 90" et l'alcool absolu.

Lorsque les liquides picriques renferment du sublimé, on lave d'abord rapidement à 1 alcool à 70" ordinaire, pour éliminer la plus grande partie de l'acide picrique, puis on passe à l'alcool iodé comme il a été dit plus haut.

Conservation des pièces fixées. — Après le lavage, les objets fixés peuvent être gardés longtemps dans ralcool à 70°. Mais il faut bien savoir que dans ce liquide^ et plus encore dans Talcool à 90'^ les tissus deviennent friables et perdent assez rapidement leur colorabilité ; notamment, par suite de Thydrolyse des composés phosphores de noyau, la coloration de ce dernier devient bien moins élective. La conservation dans Talcool n'est donc qu'un pis aller et il faut, dès qu'on le i>eut, procéder sans tarder à Tinclusiondansla paraffine. Sous cette forme, les tissus peuvent se conserver indéfiniment, sans aucune altération.

API^ENDIGE

Nous ne pouvons passer sous silence deux méthodes particulières de fixation, qui ont l'une et l'autre pour but une conservation des éléments

1. Les avis sont partagés sur la question de savoir si on peut employer aussi la solution aqueuse criode dans l'iodure de potassium. En tout cas, l'addition d'un peu d'iodure de potassium à l'alcool de lavage ne peut que favoriser la solubilisation des précipités mercuriques. Mais il ne faut jamais employer l'iodure de potassium seul, car il donne naissance à du protoiodurc de mercure qui se décompose en biiodure et mercure métalli<|uc. Ce dernier forme des précipités opaques et insolubles (Mayer).

beaucoup plus parluile que celle que peut donner l'ablation des organes et leur immersion pure et simple dans le liquide fixateur. Nous devons aussi dire un mot de la fixation des animaux marins.

Fixation par injection. — On trouvera dans Fouvrage de Mann ' la description complète de celte méthode. Les principaux avantages sont la rapidité de la lixation (toutes les cellules sont tuées en 50 secondes), la lixation parfaite des organes les plus délicats, l'uniformité complète de la fixation dans toute l'épaisseur des organes, la conservation de la forme de tous les organes creux.

L'appareil à injection pourra être un simple entonnoir de un ou deux litres muni d'un long tube de caoutchouc. On emploie comme fixateur le Bouin ou le Mann, chauffés à 38\ Ou commence par insensibiliser l'animal par le gaz d'éclairage qui dilate les vaisseaux et relarde la coagulation du sang. On lave d'abord les vaisseaux en y faisant passer de la solution physiologique, puis on injecte le fixateur.

Méthode rationnelle de Rabenthaler. — Nous ne pouvons donner ici qu'un aperçu de celte mélliode. Les cylologistes désireux de l'expérimenter pourront trouver des détails très complets dans les publications de l'auteur 2.

Rubenthaler trouve que l'immersion pure et simple de l'objet à fixer dans le fixateur est un procédé brutal, dont l'action est assez violente pour produire de nombreux artilices sans être a^sez puissante pour effectuer une fixation instantanée. Son procédé a pour but d'atténuer la réaction cellaluire, au moment du contact avec le fixateur. On y arrive, d'une part, en produisant l'anesthésie des cellules, d'autre part en graduant, par des dilutions successives, l'action du liquide fixateur. Toutes les opérations sont pratiquées à la tempérnture .du corps de l'animal au^iuel est emprunté l'organe à fixer : pour les ^Mammifères, on doit donc opérer à l'éluve à 37' ou 38''.

1. Anesthésie des cellules. — L'objet, très petit, est placé dans cent fois son volume d'un liquide isotonique, variable avec sa nature (sérum sanguin pour les muscles, liquide céphalo-rachidien pour le cerveau, liquide amniotique pour les embryons, sève ou sucs de plantes, etc.). On a préparé, d'autre part, une solution de chlorhydrate de cocaïne à 1 p. 100 dans le même liquide. L'anesthésie est produite peu à peu, en remplaçant par tiers le liquide isotonique par la solution de cocaïne, avec des intervalles de 10 minutes.

2. Fixation progressive. — Opérée avec trois dilutions du fixateur avec un quart, un demi, trois quarts d'eau. Ces trois dilutions doivent de même remplacer par tiers le liquide anesthésique, avec des intervalles de 10 minutes. On laisse ensuite le temps voulu dans le fixateur pur, à froid ou à chaud.

L'anesthésie demande 30 minutes et la fixation progressive 2 heures.

Fixation des animaux marins. — Celle fixation exige des précaulions parliciilières, l\ cause de la teneur élevée de ces organismes en substances salines; leurs liquides intérieurs doivent en effet être isotoniques avec Feau de mer. Il faut donc éviter Temploi