II. — COLORATION PAR LA LAQUE FERRIQUE
Il y a deux procédés principaux de coloration par la laque ferrique, celui de Heidenbain et celui de Weigert. Le premier est essentiellement une méthode indirecte et régressive, tandis que
1. Ce liquide se rapproche beaucoup de riiématoxylinc acide d'Ehrlicli qui était une des meilleures formules anciennes. Voici d'autre part la nouvelle ibrmule de Carazzi (Ztschr. f. wisR. Mikr., XXVIII, p. 273, 1911) : Eau dist. 400; glycérine 100; alun '20; iodate de potassium 0,01: hcmatoxylinc 0,5. Mêler le tout ensemble et laisser dissoudre, sans chautier.
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le second est encore une méthode progressive. Ces procédés sont exclusivement réservés aux coupes 1.
Hématoxyline ferrique de Heidenhain (1891).
Préparer les deux réactifs suivants :
1° Mordant. — Solution à 3 p. 100 d'alun de fer (sulfate double d'ammonium et de sesquioxyde de fer).
2" Colorant. — Solution aqueuse d'hémaloxyline à 1 p. 100, préparée en mélangeant 10 cm"', de solution d'hémaloxyline à 10 p. 100 dans l'alcool à 90 avec 90 cm-\ d'eau.
Pour préparer la solution d'alun de fer, il ne faut employer que des cristaux violets bien clairs- : s'ils présentent une teinle jaunâtre, ils sont altérés et doivent être rejelés. Pour avoir sûrement du bon alun de fer, il ne faut pas acheter de petits cristaux, ni de l'alun de fer pulvérulent; mais, suivant le conseil de Francotte, exiger de très gros cristaux qui se conservent parfaitement en bocaux bien bouchés à l'émeri. Au moment de faire la solution, on racle avec un scalpel la ([uanlité nécessaire et on obtient ainsi une dissolution immédiale. Le licjuide, qui est jaunâtre, doit être absolument limpide. 11 ne faut pas préparer à l'avance une quantité de cette solution, car elle ne se conserve pas. 11 est essentiel de faire la solution à froid.
La solution d'hémaloxyline est d'autant meilleure ([u'elle est plus ancienne. Elle devient noire, par suite de l'immersion des coupes imprégnées d'alun de fer, mais il n"y a pas à s'en occuper. D'après Mayer, il ne s'y formerait pas (riiêinaléine, mais d'autres composés plus ric'ies en oxygène.
Le temps consacré au mordancagc cl à la coloration diffère beaucoup, suivant la nature des pièces, le mode de fixation, le résultat cherché. Pour une simple coloration nucléaire topographique, il suffit d'un mordançage et d'une coloration de trente minutes à une heui^e, tandis que, pour les différenciations cytologiques, les bains doivent être prolongés pendant douze et même vingt-quatre heures. Dans le premier cas, la coloration obtenue est bleue, tandis que dans le second, elle est parfaitement noire.
Voici la marche générale du procédé. On opère avec une batterie de cylindres Borrel ou de tubes JoUy.
1° Mordancer les coupes dans l'alun de fer pendaid trente minutes à douze heures;
2° Laver rapidement à l'eau distillée;
1. Pourtant llœraers est arrivé à colorer en masse, par le procL'dé de Heidenhain, en prolongean;; le mordançage et la coloration pendant 2-3 jours; on lave ensuite à l'eau sans différencier. Biblioyr. anat., IX, p. 1. 1900. Voir aussi, p. 380, le procédé de Morel et Bassal.
2. ?se pas confondre avec le sel double de proto.xyde de fer ou sel de Molir, en cristaux verts.
3° Colorer dans la solution criiématoxyline pendant trente minutes à vingt-quatre heures.
On accélère beaucoup la coloration dans l'étuve à 37" ^ La préparation doit prendre une coloration noire encre de Chine;
A'^ Laver rapidement à Teau distillée ;
5" Différencier dans l'alun de fer. 11 faut prendre un liquide différent de celui qui sert à mordancer. La concentration peut être la même ou plus faible (1 p. 100), s'il y a intérêt à ralentir le processus pour le suivre plus exactement -. En effet, il est indispensable de retirer les coupes de temps en temps, pour contrôler la différenciation. On les lave rapidement à l'eau et on les examine avec un grossissement approprié.
C'est dans ce cas qu'un objectif à immersion à l'eau peut rendre des services. Pour les objectifs à sec forts, il est nécessaire de déposer une lamelle à la surface de la préparation. Pour retirer cette lamelle, sans endommager les coupes, il suffit de plonger la lame dans un tube Borrel plein d'eau : la lamelle se délaclie d'elle-même.
11 faut prendre soin de ne pas répandre de l'eau ou de l'alun de fer sur la platine du microscope; pour cela, il faut essuyer soigneusement la face inférieure de la lame ou, mieux encore, recouvrir la platine d'une plaque de verre ou d'une boîte de Pétri. Bien entendu, cet examen ne doit pas être pratiqué avec le cliariot, dont il faut enlever la partie amovible.
6" Après différenciation, laver soigneusement à l'eau, colorer si on le juge utile par un colorant plasmatique (voir p. 397 colorants acides), puis déshydrater et monter au baume.
La différenciation peut varier dans de très larges limites; on la pousse plus ou moins loin, suivant les parties qu'on veut mettre en évidence. C'est là à la fois l'avantage et Fécueil de la méthode de Heidenhain; elle permet au travailleur exercé de différencier les plus fins détails cylologiques, mais elle expose le débutant à de graves erreurs d'interprétation. En effet, non seulement le résultat obtenu varie, suivant la durée de la coloration et de la différenciation, mais encore il ne faut pas prendre tous les corpuscules sidérophiles pour des inclusions nucléaires ou cytoplasmiques, ni tirer des conclusions erronées d'une différenciation incomplète ou
1. Gurwitscli inordance et colore à chaud (étuve à 40"), puis différencie à la tempéi'ature ordinaire. On arrive ainsi à avoir en dix minutes une bonne coloration. Ztschr. f. wiss. Mikr., XVIII, p. 291, 1902.
2. On peut différencier par immersion dans le tube Borrel ou simplement en mettant sur les coupes, lavées et égouttées, une grosse goutte d'alun de fer. On installe sur le microscope et on surveille la marche de la différenciation.
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trop poussée. Il faut savoir aussi que Tépaisseur des coupes ou des froUis iuflue beaucoup sur le résultat final de la différencialion. Par conséquent, dans une même préparation, les noyaux ne seront pas tous au même point : les uns seront trop différenciés, les autres pas assez et il faudra savoir choisir ceux qui se présentent à l'état voulu, pour le détail à démontrer.
Dans une préparation bien réussie, les structures nucléaires ressortent en noir intense sur un fond incolore ou à peine coloré. La coloration est à la fois très énergique et très précise; au point de vue optique, elle présente donc des avantages considérables, car elle permet l'examen avec les plus forts grossissements et même l'emploi des oculaires les plus puissants, ce qui n'est pas toujours possible avec les colorations à la laque aluminique ou avec les couleurs d'aniline. Aussi, cette méthode est-elle certainement la plus importante de toutes les techniques cytologiques, aussi bien pour les coupes que pour la coloration des Protozoaires dans les frottis. Elle parait devoir remplacer presque toutes les méthodes aux couleurs d'aniline, qui donnent des résultats moins stables. Il est certain que Thématoxyline ferrique et le Romanovsky sont maintenant les deux pierres angulaires de la cytologie et de la protistologie.
Hématoxyline ferrique de Weigert^ (1904).
Dans ce procédé, on emploie le perchlorure de fer au lieu d'alun de fer et on mélange extemporanément le colorant et le mordant, pour les faire agir ensemble sur les coupes.
A. Hématoxyline crist. de Grûbler 1 gr.
Alcool à 95'' lOU cm3.
B. Perchlorure de fer officinal 2 4 —
Acide chlorhydrique pur 3 1 —
Eau distillée 95 —
Au moment de l'emploi (ou mieux dix minutes avant), mélanger parties égales de A et de B et colorer avec ce mélange pendant
1. Weigcrt, Eine kleine Vcrbesserung der Haematoxyli a-van Gieson Méthode. Ztschr. /'. iviss, Mikr., XXI, p. 1, 1904. Les méthodes de Weigert, spéciales pour le système nerveux, seront étudiées p. 659. La méthode que nous donnons ici est une méthode générale.
2. De la pharmacopée allemande, à 10 p. 100 de fer. Mallory pratique le procédé de Ileidenhain avec du perchlorure de fer à lu p. 100, au lieu d'alun de fer. Ztschr. /'. wiss. Mikr., XVIII, p. 177, 190J.
