III. — INDICATIONS DE L'EXAMEN A L'ÉTAT FRAIS
On trouvera, au cours de l'étude des méthodes spéciales, de nombreuses indications de l'examen à l'état frais. Je mentionnerai seulement ici les principales. En général, on examinera par ce
1. F. Schaudinn, Ein Mikroaquarium, welches auch zur Paraffineinbettung kleiner Objeckte benutzt werden kann. Zlschr. /. mas. Mikr., XI, p. 3-2G-0-29, 1891.
procédé, tous les éléments cellulaires isolés à l'étal vivant, que ce soient des Prolozaires ou des cellules isolées des Métazoaires (sang lymphe, leucocytes, etc.). Celte méthode esl particulièrement indiquée jionr la recherche des parasites du sang, Texamen des urines, des matières fécales, des pulpes d'organes, le diagnostic et Fétude des Champignons para-ites, etc. L'examen à Tétai frais esl indispensable toutes les l'ois qu'il s'agit d'étudier un organisme ou un élément figuré mobile. Ajoutons enfin qu'en botanique celle méthode esl encore plus employée qu"en zoologie et qu'elle s'applique à tous les végétaux microscopiques, aux spores, aux grains de pollens et même aux coupes d'organes.
Nous avons reproché à la technique d'examen à Tétat frais de ne pas nous montrer les détails des ohjets. La méthode des colorations vitales constitue un procédé intermédiaire entre cette technique et celle des colorations après fixation. Elle a pour but de faire apparaître certaines parties de la cellule, telles que le novau ou les inclusions, sans toutefois causer de modifications physiques ou chimiques pouvant amener la déformation, Taltéralion et finalement la mort de Félément examiné. Celui-ci finit bien par mourir, mais non pas uniquement du fait de la coloration.
Les colorations vitales permettent de démontrer la réalité de l'existence de certaines inclusions cellulaires qui pourraient être prises pour des précipités colorés, autrement dit pour des artifices de préparation. Cette existence réelle ne sera prouvée qu'autant que la coloration aura eu lieu sans que la vie de la cellule soit arrêtée. C'est ainsi qu'à l'aide du roug-e neutre, on a démontré le rôle digestif des granulations et des vacuoles de beaucoup de Protozoaires. On a découvert, grâce à cette méthode, des phénomènes intra-cellulaires d'oxydation et de réduction qu'on met eu évidence par la décoloration de certains réactifs (p. 2.52). Il faut savoir en outre que, parmi les inclusions cellulaires, tout ce qui se colore n'est pas vivant : des pigments divers et des cadavres de Bactéries se colorent souvent très intensément. Enfin, dans beaucoup de cellules, surtout chez les Protozoaires, les noyaux sont bien plus difficiles à colorer que les inclusions.
La valeur des colorations vitales est très contestable et très contestée. Des techniciens de premier ordre, comme Galeotti, Lee, Mayer, arrivent à conclure que les résultats obtenus ne constituent pas de véritables colorations. Le colorant peut diffuser dans la cellule vivante, mais ne produit pas une véritable teinture. Généralement le noyau et, particulièrement la chromatine, ne se colorent pas : si la coloration se produit, c'est que la cellule est morte. Les meilleures colorations vitales sont celles des granulations du protoplasma : mais justement ceux de ces corps qui se colorent le mieux ne font pas partie intégrante du cytoplasme. Ce sont généralement des matériaux nutritifs ou des produits d'échanges.
Il s'agil donc de savoir si le phénomène de la coloration est compatible avec la vie, si un élément vivant peut réellement se colorer ou si la teiniure ne se produit qu'après sa mort. Un fait est certain, c'est que les éléments vivants peuvent réagir chimiquement sur les matières colorantes. On sait, en ce qui concerne le bleu de méthylène, que ce corps peut être fixé par certains éléments (terminaisons nerveuses, cylindres-axes) et réduit par d'autres éléments (parenchyme rénal). Ces deux réactions sont évidemment compatibles avec la vitalité de la cellule. D'autre part, les travaux de Przesmycki ', pour ne citer qu'un exemple, ont montré que, chez certains Infusoires, Rotifères, Vers et Crustacés, le noyau peut fixer des matières colorantes et continuer ensuite à vivre et à se diviser.
On pourrait citer beaucoup d'autres exemples, car cette question comporte une littérature très toulTue 2. Contentons-nous de remarquer que, parmi toutes ces observations, aucune ne se rapporte à un véritable phénomène de teinture. Il ne s'agit en réalité que de phénomènes d'imbibition. Les animalcules de Przesmycki, transportés dans de l'eau pure, se décolorent rapidement; leur mort amène aussi leur décoloration. Chez les animaux qui ont reçu du bleu de méthylène dans la circulation, il faut se hâter de mettre le système nerveux à nu et en contact avec l'oxygène atmosphérique, si on ne veut pas voir la coloration disparaître par suite des phénomènes de réduction. Pour conserver ces colorations, il faut les fixer par des liquides oxydants (procédé de Bethe). Il y a donc une véritable défense cellulaire, qui se manifeste par des phénomènes de réduction tels, que les auteurs recommandent toujours d'opérer le plus possible au contact de l'air.
Les colorations, dites vitales, se réduisent donc généralement à la succession des phénomènes suivants : coloration des inclusions non vivantes, action réductrice de la matière vivante, insuffisante cependant pour empêcher d'abord Vimbibition progressive, puis la mort de la cellule qui subit alors la véritable teinture.
Je ne ci'ois pas que, sauf dans des cas parliculiers, la coloration vitale puisse constituer une méthode de travail courante. Je passerai donc sous silence la plus grande partie de ces expériences, dont on trouvera la description dans les ouvrages spéciaux de technique hislologique. A mon avis, les coloralions vitales ne peuvent trouver un emploi journalier que dans Tétude des Protozoaires et du sang, etdans certaines réactions microchimiques. On trouvera dans les chapitres qui y sont consacrés (p. 469 et 624) des indications suffisantes.
Colorants vitaux proprement dits. ^ Les colorants, dits
L Przesmycki. Ueber iutravitale Fârbung des Zellkcrns. Silzungsber. Gesell. f. Morphol. und Pliysiol. Mimchen, 1899.
•2. Par exemple : A Fischel, Untersucliungen ùbcr vitale Fàrbung. Anat. Hefte, 1 Abt., XVI, p. 417, 1901. — De Beaucliamp, Les colorations vitales. Année biologique, XI, p. 1906, 1909 et Tlièse doct. se, Paris, 1909. — Article Colorations vitales, dans Encyklopûdie d. mikr. Technik, 2'= éd., 1910.
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Vitaux^ ne devront })as être quelconques. Ils seront choisis parmi (les sul)slances peu on pas toxiques et seront toujours employés en solntions très diluées. Ce sonten général les colorants basiques qui conviennent le mieux. Les couleurs acides sont bien moins favorables. D'ailleurs, cette règle n'est pas absolue, car des corps très voisins et de même réaction peuvent produire des effets très diflerenls, sans qu'on puisse expliquer celte élection particulière des tissus. Parmi les théories qui tentent de rendre compte de ces phénomènes, nous ne mentionnerons que celle d'Overton \ pour qui la faculté de se prêter aux colorations vitales dépend de la solubilité des couleurs dans les lipoïdes. Les colorants vitaux posséderaient cette solubilité, notamment vis-à-vis de la cholestérine et de la lécilhine qui, d'après Overton, imprègnent la pellicule protoplasmique externe des cellules.^
Les couleurs acides seraient précisément très peu solubles dans les lipoïdes. C'est pourquoi, à part quelques exceptions, elles sont peu propres aux colorations vitales.
Liste des colorants vitaux. — Les j^lus usités sont :
Bleu de méthylène chimiquement pur de Hochst ou de Merck, eu solution à 1 p. 500, 1 p. 1000, 1 p. 10 000.
Bleu de Nil (sulfate ou chlorhydrate à 1 p. 1000).
Bleu de crésyl brillant (Brillantkresvlblau) à 1 p. 1000 (p. -469 et 624).
Azur I ii[ II (i^. 389).
Rouge neutre (p. 251, -469 et 625).
Colorants indicateurs (p. 252).
Technique des colorations vitales. — H y a deux principaux moyens d'employer les colorants vitaux. Ou bien on mélange une gouttelette de la solution très étendue, avec une goutte de liquide renfermant les éléments à étudier, ou bien on prépare des lames, en y déposant une goutte de solution colorante qu'on laisse sécher avec ou sans étalement préalable (méthode de Pappenheim, p. 624). Sur cette couche desséchée, on dépose une goutte de liquide à examiner, on recouvre d'une lamelle et on lute pour éviter la dessiccation.
Les colorants vitaux s'emploient toujours en solutions très étendues : au mitlième pour l'examen entre lame et lamelle, au dix-miUieme et au cent-millième pour les colorations par immer-
1. Overton, Studicn ûber die Aufnahmo der Aiiilinfarbcii diircli die lebcnde ZeUe. Jnfir/j. ivis\s. Bot.XXXW. p. CIO. 1910.
sion, au ceiilirnu- jioui' les injections. Ces i)iO|)oilions varient d'ailleurs suivant les cas" parliculiers.
Le dissolvant sera de Teau pure, lorsqu'il s'agit de colorer des hnerlébrés aquatiques. Pour les injections, on prendra toujours de Teau physiologique et on chauffera le liquide à la température de l'animal.
La coloration dite posl-vitale, d'après Arnold, se fait en détachant des fragments d'organes, des lambeaux de membranes ou même en raclant des éléments cellulaires à la surface des muqueuses. Ces ébhnents sont plongés dans le bain colorant très dilué et rendu soigneusement isotoniaue.
Entin, lorsque Texanien par transparence n'est pas possible, il faut, après un temps jugé suftisant, fixer la coloration par une méthode appropriée (p. 658, note 1) et pratiquer des coupes.
Les deux principaux colorants vitaux sont le bleu de méthylène et le rouge neutre.
Le bleu de mét/njlène (p. ^^84) doit être chimiquement pur. On pourra prendre indifféremment celui de Merck, de Hochst ou de Griibler. On en fait des solutions à 1 p. 500, 1 p. 1000, 1 p. 10 000, dans Teau distillée \ pour l'examen entre lame et lamelle, par exemple pour la coloration vitale des Protozoaires et la coloration post-vitale de lambeaux de membranes ou de cellules isolées par raclage d'une muqueuse. Les solutions à Ip. 100 dans la solution physiologique conviennent pour certaines injections, par exemple l'étude des sacs lymphatiques des Batraciens ; on peut l'administrer aussi par la voie digestive, à raison de 10 centigrammes par kilogramme d'animal pendant une semaine.
Chez les Métazoaires, la coloration vitale par le bleu de méthylène est surtout employée pour la recherche des terminaisons nerveuses et des cyUndres-axes.
Le rouge neutre a été découvert par Witt en 1879 et introduit dans la technique microscopique par Ehrhch. C'est une poudre de couleur foncée à l'etlets verdàtres, facilement soluble dans Teau distillée, avec une couleur rouge tirant un peu sur le violacé. On en fait des solutions à 1 p. 1000, 1 p. iOOOO et 1 p. 100 000. Il possède la précieuse propriété de virer sous Tiidluence des réactifs acides ou alcalins. Une faible trace d'un acide organique donne à la liqueur une belle couleur rouge cerise ou l'ouge fuchsine.
1. Voir p. 6-^5 rexcelloiitc môTliodo de Sabrazès pour la coloration vitalo du sanp: et des Protozoaires.
Une très faible alcalinité, telle que celle de l'eau de source, fait virer au jaune brunâtre les solutions faibles et au brun rougeâtre les solutions plus concentrées. Ces phénomènes permettent d'étudier les réactions du cytoplasme et de ses inclusions, particulièrement chez les Infusoires (p. 535).
En solution alcoolique, le rouge neutre est brun rouge en liqueur concentrée et brun jaunâtre en liqueur étendue.
Ce corps est très propre à fournir des colorations vitales, parce qu'il est relativement peu toxique. On peut l'administrer aux animaux par la voie sous-cutanée ou même intraveineuse et par la voie digestive. Pour les animaux aciuatiques, il suffit souvent de les plonger dans une solution très diluée (Mollusques, larves de Batraciens). Pour les injections, on emploie des solutions plus concentrées (i à 2 p. 100) et on peut en inoculer chaque jour plusieurs centimètres cubes. La résistance des Mammifères est assez variable. Les Lapins et les Cobayes supportent très longtemps ces injections, tandis que les Souris meurent généralement au bout d'une semaine. Les résultats obtenus sont médiocres. La peau, les muqueuses, l'urine, les fèces prennent bien une coloration rouge, mais, à l'examen microscopique, on trouve que le colorant n'a pénétré que dans les espaces intercellulaires. Les cellules ne se colorent ni dans leur noyau, ni dans leur cytoplasme, et la coloration produite par le rouge neutre est très fugace. Pour pratiquer des coupes sur les tissus ainsi colorés, il faut fixer la coloration par la méthode de Golovine '.
Colorants indicateurs. — Les propriétés indicatrices du rouge neutre nous amènent à parler d'une série de colorants qui, sans fournir des colorations vitales proprement dites, peuvent être utilisés avantageusement, dans les examens à l'état frais, pour déterminer la réaction acide ou alcaline de certains organismes ou éléments figurés. L'étude de ces corps touche de près à la microchimie au sujet de laquelle on trouvera p. 669 des renseignements complémentaires.
Le rouge Congo se ]»résente sous forme de poudre brun rougeâtre, facilement soluble dans l'eau. C'est surtout un bon réactif indicateur qui vire au bleu avec les acides. Scholz s'en est servi le premier pour colorer vitalement les Piotifères et mettre en évidence la réaction acide du tube digestif, qui tranche en bleu sur le fond rouge de l'animal. Il est bon de savoir que ces réactions ne sont pas toujours fidèles : le virage au bleu ne se produit pas en présence de l'ammoniaque, ou d'un coagulum albumineux ; en outre l'acide carbonique est sans action.
L Zeitschrift f. wiss Mikr., XIX, p. 176-185, 1902.
Les iropéolines 00 (orange I eL II de HiJclisl) et 000 (orange .IV de Gas^ella) rougissent immédiatement avec la moindre trace d'alcali. Elles sont insensibles à l'acide carbonique.
Le Sudan III colore électivemenl les graisses (p. 656) et certains éléments végétaux tels que la cire, la culine et la subérine (p. 729). Un colorant voisin, le diméthylamidoazobenzol, s'emploie aussi en solution alcoolique (0,4 p. 100) ; il colore le protoplasma en jaune, les graisses et certaines vacuoles en rouge.
L'orangé de dhnétliylaniline (Goldorange, hélianthine) peut servir pour l'étude de la réaction du cytoplasme, au moins chez les végétaux. La solution aqueuse à 0,01 p. 100 est d'un jaune orangé. Les acides, mêmes organiques, la font passer au brun rouge d'une manière très nette.
Le vert diazine convient pour l'étude des réductions, au cours desquelles il se dédouble en deux leuco-composés (incolores), dont l'un redevient rouge par oxydation. La couleur verte n'est jamais régénérée.
Injections intravitales. — Outre les injections de bleu de méthylène, destinées à l'étude du système nerveux, je mentionnerai les injections de poudres colorées, nécessaires pour les travaux sur les cellules ou les organes phagocytaires : les substances les plus employées sont l'encre de chine et le carmin pulvérisé. Pour Tétude de ïappareil excréteur, on emploie le carminate d'ammoniaque et le carmin d'indigo: cette dernière substance n'est d'ailleurs pas un colorant vital proprement dit. Le carmin et l'encre de chine servent aussi pour l'étude de la nutrition des Amibes et des Infusoires.
On trouvera l'exposé de cet important sujet au chapitre consacré à l'étude des injections physiologiques (p. 677).
