DISSOCIATION. DIGESTION ARTIFICIELLE. DECALCIFICATION

de manière à pouvoir les étudier par la méthode des coupes. Chimiquement, les liquides décalcilianls, qui possèdent tous la fonction acide, déplacent les sels de chaux unis à la substance collagène du tissu osseux, et se combinent k eux pour les transformer en sels solubles. Du cuté du décalcifiant, il se produit donc une neutralisation progressive par les bases terreuses.

En ce qui concerne la composition de la solution acide, il faut éviter deux écueils : une dissolution trop lente des sels calcaires et une altération des éléments figurés du tissu à décalcifier. Aussi la décalcification nécessile-t-elle les précautions suivantes :

1° Ne décalcifier que du matériel préalablement bien fixé, mais jamais du matériel frais. Comme fixateur, on emploiera un liquide très pénétrant et facile à éliminer tel que le picroformol de Bouin (p. 284), ou simplement le formol à 5 p. 100, surtout s'il s'agit de grosses pièces.

2" Ne jamais employer les acides minéraux forts (excepté l'acide azotique), sans addition d'une substance destinée à empêcher le gonflement ou la géliflcation du collagène.

3° Accélérer le plus possible la dissolution des sels calcaires et, pour cela, employer un très grand volume de décalcifiant, suspendre l'objet à décalcifier au milieu du liquide et changer fréquemment ce liquide si l'os est volumineux.

4° Il est indispensable, après la décalcification, de neutraliser les tisssus, par action chimique ou par lavage.

Décalcifiants. — On a proposé, comme décalcifiants, un grand nombre de corps acides, choisis parmi ceux qui forment des sels solubles avec les bases alcalino-terreuses. Remarquons que tous les fixateurs acides agissent plus ou moins comme décalcifiants, mais celte action est très lente et insuffisante.

Le meilleur décalcifiant est certainement V acide azotique. On l'emploie, soit pur, en solution aqueuse (Schaffer) ou alcoolique (Mayer), soit additionné de substances qui empêchent son action gonflante et parmi lesquelles la plus importante est la phloroglucine.

i° Solution aqueuse (F acide azotique à 2-15 p. JQO d'après Schaffer. Cette solution se prépare en ajoutant à 3-23 volumes d'acide azotique concentré, de densité J,4, la quantité d'eau distillée nécessaire pour faire 100 volumes. Ses avantages sont les suivants d'ai»rès Schaffer * : elle décalcifie plus vite que tous les autres acides (12-24 heures) et elle ne gonfle pas le collagène, à

l. Schaffer, Article Knoclien v.nd Ziihne in Encyclopadie der mikroskopischen Technik; pour les méthodes de Retterer, cf. Journal de V Anatomie et de la physiologie, XLI. Ifi05 et C\R. Soc. de biologie, janvier 1906.

2G4 MCTIIODRS GENKRALES

condilioii (le 110 jias descendre au-dessous de 1,6 p. 100 el de ne pas mettre le (issu en contact avec de l'eau pure, pour éliminer l'acide après décalcification.

SchalTer conseille de ne rien ajouler pour empêcher le fçonflement : toutes les formules proposées ont, d'après lui, Tinconvénient de relarder beaucoup la décalcification i (sauf la phloroglucine-).

L'élimination de l acide ne doit jamais se faire par immersion dans l'eau pure. Il faut commencer par un lavage de vingt-quatre heures dans l'alun de potasse à 5 p. 100. On peut ensuite laver dans l'eau sans inconvénient.

2° Solution d'acide azotique à 5 p. 100 dans l'alcool à 90" (Maycr). D'après Mayer, contrairement à ce que dit Schaiïer, Talcool azoti({ue ne produit jamais d'altération ou de gondement sur les os préalablement bien fixés. Ce liquide agit beaucoup plus lentement que la solution aqueuse (2 à 3 semaines). On lave, d'après Thoma, pendant huit à quinze jours, dans de l'alcool tenant en suspension un excès de carbonate de calcium précipité (ol)tenu en précipitant une solution de chlorure de calcium par une solution de bicarbonate de sodium et lavant bien le précipité), jusqu'à ce que le liquide resle neutre au papier de tournesol.

L'acide sulfureux est aussi un excellent décalcifiant, presque aussi ra]nde que l'acide azotique et moins nuisible au collagène que les mélanges à la phloroglucine. Son emploi a été réglé j^ar Ziegler, dont la méthode est recommandée par Schaffer, Mayer et Mann.

On hxe d'abord les fragments dans le formol, puis on les plonge dans une solution aqueuse d'acide sulfureux commercial à 5 p. 100. Le phosphate Iricalcique insoluble est converti en monophosphate très soluble, de telle sorte qu'un humérus de Cobaye adulte peut être décalcifié en douze heures à -f- 3o° et de gros os humains en une semaine (Mann). On lave longuement à l'eau courante et on déshydrate graduellement pour inclure à la paraffine ou au collodion.

1. Pourtant Malassez obtenait de très bons résultats avec une sohition aqueuse saturée d'acide picrique, additionnée de -2 p. 100 d'acide azotique.

2. D"aprcs xVndecr et Haug, la phloroglucine préserve les tissus de l'action destructive des acides et permet de les employer en solutions concentrées. Haug dissout 1 gr. de phloroglucine dans 10 gr. d'acide azotique pur, en chautiant légèrement, puis ajoute 50 gr. d'eau. On complète le volume de 300 cm^ avec de l'acide à 20 p. 100 ou moins fort. L'action est très rapide. Ensuite on lave deux jours à l'eau courante.

GIlAl>ITHi-: VI THÉORIE DE LA FIXATION

Les mélhodes (rexamen à rétal irais ne donnenl que des renseignements insnllisanlssnr la cellule vivante, parce que les éléments qui la constituent possèdent tous à peu près le même indice de réfraction. La nature des rayons auxquels Tœil humain est sensible ne permet pas de surmonter cet obstacle par des procédés optiques et d'arriver ainsi à distinguer nettement les détails de structure du noyau et du cytoplasme. Nous avons vu (p. 80) que l'emploi des rayons ultra-violets permet, jusqu'à un certain point, de révéler ces détails sans colorations, mais c'est une méthode })urement photographique, sans intérêt pratique. Il faut donc, pour étudier la structure de la cellule, la colorer, afin de suppléer aux différences de réfringence par des différences de coloration. Nous savons que celte coloration est à peu près impossible k Télal vivant et que, pour la prali(iuer avec succès, il faut tuer la cellule. C'est là le rôle de la fixation.

Définition de la fixation. — La fixation est donc une opéralion destinée à tuer les cellules, en les conservant, autant que po&sible, dans l'étal où elles se trouvaient pendant la vie. Une bonne fixation doit, en quelque sorte, immobiliser la cellule, conserver exactement toutes ses parties constituantes et ne pas faire apparaître artificiellement de nouveaux détails de structure. Cette fixation exacte est impossible à réaliser avec les procédés actuels. Une action prompte et énergique du réactif empêche bien les altérations spontanées j^ost morlem, mais elle modifie aussi plus ou moins profondément la structure cellulaire. Les meilleurs de nos fixateurs sont ceux qui, tout en agissant raiiidemenl, |»roduisent le moins possible de modifications secondaires ou artifices, susceptibles de nous donner une idée très fausse de la morphologie interne des cellules.

En quoi consiste donc essentiellement la fixation ? Il est certain que la masse cellulaire, formée cralbuminoïdes, ne peut être conservée exactement que par un procédé qui la solidifie. Or, en mettant à part la congélation et la dessiccation, cette solidification ne peut être obtenue que par coagulation ou précipitation.

Mann a très bien fait ressortir la diiTérence qui existe entre ces deux phénomènes : la coagulalion (bien distincte de la solidification par le refroidissemenL), est produite par les agents physiques, tandis que la précipitation, toujours accompagnée de modifications chimiiiues, est produite par les agents chimiques. Le véritable but de la fixation est donc de produire une coagulalion ou une précipitation aussi complètes que possible de tous les albuminoïdes cellulaires, en leur conservant un aspect correspondant à leur nature amorphe (cytoplasme), granuleuse (grains de sécrétion, mitochondrics), filamenteuse (ergastoplasme, appareil réticulaire), etc.

Ces réserves faites sur Timperfection théorique de la fixation et sur sa nature, nous pouvons envisager pratiquement en quoi elle consiste. Elle a d'abord pour but de tuer les éléments anatomiques, avec une rapidité suffisante pour qu'ils n'aient pas le temps de modifier leur forme et leur structure.

Elle doit les durcir suffisamment pour leur permettre de résister, sans déformation, à toutes les manipulations subséquentes (déshydratation, inclusion, coupes, etc.). il faut bien savoir que le durcissement est une opération distincte de la fixation : la plupart des fixateurs actuels durcissent suffisamment les tissus, mais la réciproque n'est pas vraie et les anciens liquides durcissants ne sont pas pour cela des fixateurs. C'est pour cette raison que leur usage tombe de plus en plus en désuétude. Pourtant, il peut être nécessaire, dans certains cas, de faire suivre la fixation par un durcissement consécutif.

La fixation doit produire, en même temps, V insolnbilisation des éléments constitutifs des cellules et des tissus. Il est, en effet, de toute nécessité que les détails de structure, conservés par le fixateur, ne soient pas détruits ensuite par l'action des liquides de lavage ou les solutions colorantes. Celte insolubilisation peut être produite par déshydratation, coagulation et surtout par combinaison chimique du réactif fixateur avec les albuminoïdes cellulaires.

Le lavage des pièces, après la fixation, devra être réglé suivant la nature de ces combinaisons, d'ailleurs très mal connues, mais dont la stabilité et l'insolubilité varient avec les fixateurs.

Certaines de ces combinaisons jouissent aussi de la propriété de se coml)iner avec certaines matières colorantes. Elles peuvent donc mordancer les tissus et permettre des coloralions caractéristiques, qu'un ne pourrait réaliser autrement. Mais elles peuvent aussi être réfractaires à d'autres colorations.

De ces différentes réactions peut résulter aussi une véritable différenciation optique. En effet, la coagulalion ou la précipitation du contenu de la cellule amène des modifications plus ou moins grandes dans la réfrangibilité de ses diverses parties. Il en résulte que des détails, invisibles à l'état vivant, parce que leur indice de réfraction était très voisin de celui de l'eau, apparaissent nettement après que l'action des

fixateurs a notablement élevé cet indice, mais de (juantilés variables suivant la nature de chacun d'eux.

Un tissu bien fixé montrera donc des cellules pleines, non vacuolisées, ni gonflées, ni ratatinées, mais présentant beaucoup de détails de slructure fine.

Nécessité de la fixation. — Il est superflu, après ce que nous venons de dire, d'insister sur la nécessité de fixer les tissus pour en faire l'étude microscopique. La rapidité des altérations jjost morlem, la difficulté des examens à l'état frais et de la coloration des objets non fixés, en sont des preuves suffisantes.

On peut donc dire que la fixation est la jjierre angulaire, le fondement de toute bonne histologie.

La valeur des faits observés au microscope et des conclusions qu'on en tire dépend entièrement des procédés de fixation. Si ces méthodes ont réellement pour résultat d'immobiliser la cellule telle qu'elle est à l'état vivant ou, au moins, d'une fagon adéquate et de mettre en évidence ses parties constitutives, nous pourrons acquérir des notions exactes sur la structure des tissus et de leurs éléments. Si, au contraire, l'action des fixateurs fait apparaître des précipités dans le noyau et le cytoplasme, ces formations artificielles pourront être confondues avec de véritables org-ancs cellulaires.

Valeur de la fixation. — Quelle est donc, dans la fixation, la part qu'il faut faire aux productions artificielles? A la suite d'expériences exécutées in vitro, sur difi'érents albuminoïdes, Fischer est arrivé à admettre que la coagulation du protoplasma est toujours due à un phénomène de précipitation. Chaque albuminoide cellulaire aurait sa figure de précipitation et chaque fixateur produirait sa fig-ure de fixation. Les précipités obtenus peuvent être plus ou moins éloignés de l'aspect vital des éléments : dans certains cas, ils peuvent être purement artificiels et constituent alors des artifices de préparation, dont il faut toujours se défier.

Les recherches de Fischer ont eu une grande influence et une portée considérable, mais on peut leur adresser beaucoup de critiques. Celles-ci ont été très heureusement présentées par Mann dans son admirable ouvrage i. Nous ne saurions trop en recommander la lecture à ceux qui désirent se documenter sur les phénomènes physico-chimiques qui président aux manipulations histologiques.

D'abord, il ne faut pas conclure de ce qu'on observe in vitro à ce qui se passe dans l'intimité des cellules vivantes. Ensuite, la plupart des éléments de la cellule (noyau, centrosome, grains de sécrétion, protoplasmes spécialisés) peuvent être vus à l'état frais, dans certaines conditions, et leur existence ne saurait être révoquée en doute.

Pour les autres détails, qui ne nous sont révélés que parles fixateurs, le meilleur moyen d'en apprécier la valeur est de soumettre les cellules

1, Mann, Physiological histolGQxj, inelhods and theory, Oxford, Clarendon Press, 190-2. Voir aussi à ce sujet Boites Lee et Henneguy, Traité des mcthodes techniques ■d.e Vanatoinie microscopique, o" édit., Paris, Doin, 1002.

268 MÉTHODES GKNKI'.ALES

à rnclion de toule une série de réactifs. Si le lésullal est iderili(|ue dans tous les cas, il est corlain (|ue l'objet révélé préexistait réellement et ne nous était invisible qu'à cause de ses propriétés optiques. Il reste à savoir si la fixation nous montre cet objet dans son état naturel ou si nous ne le voyons jamais que modifié. L'emploi des fixations convergentes, suivant l'expression de Henaut, c'est-à-dire du plus grand nomltre de fixateurs possibles, appliqués au même objet, peut seul permettre de formuler une opinion sur l'aspect morpbologique réel le plus probable.

Dans l'emploi des lixalions convergentes il faut, avec Apathy, distinguer \es fixateurs généraux qui permettent d'obtenir une fixation à peu près homogène de tous les éléments et les fixateurs différentiels qui mettent en évidence certains détails au détriment des autres.

Remarquons enfin, que le pouvoir de précipitation n'est pas proportionnel au pouvoir fixateur : l'acide osmi({ue, qui est un fixateur très puissant (p. 272) a un indice de précipitation très faible. D'autre part, le tannin, qui précipite énergiquement tous les albuminoïdes, n'a aucune propriété fixatrice. Les fixateurs ne produisent pas tons des précipités; il y en a qui donnent des congulations homogènes. Nous aurons occasion de revenir sur ces particularités en étudiant les différents agents fixateurs.

Nous pouvons donc conclure à la haute valeur de la fixation, pourvu qu'elle soit accomplie dans certaines conditions bien définies, au moyen d'agents possédant des qualités parliculières.

Qualités des fixateurs. — Le lixaleur idéal serait celui (jtii conservei'ait la cellule clans un élal identique à Télat vivant, en gardant à ses éléments conslitutifs Tintégi^ilé de leui^s caractères morphologiques. Nous savons que ce fixateur idéal n'existe pas encore et que les meilleurs agents que nous possédons doivent réunir un ensemble de (|ualités nécessaires pour réduire autant que possible les artifices de préparation.

La première qualité d'un bon fixateur est la puissance de pénétration^ au moins en ce qui concerne les tissus, de manière à ce que le liquide puisse fixer aussi bien les zones profondes que la couche sujieriicielle. Le tannin est un fixateur déi)lorable, tnalgré son remarquable pouvoir de précipitation, parce que son pouvoir de diffusion est très faible; les cellules ont le temps de se nécroser avant d'être atteintes par le réactif.

Le fixateur doit produire une coagulation totale des albuminoïdes, mais cela ne veut pas dire que la coagulation doive être violente et instantanée. Il faut, au contraire, que la coagulation soit en quelque sorte fractionnée afin d'éviter les contractions. Von Tellyesniczky a bien montré que, dans les mélanges à base d'acide acéticiue, qu'il considère comme les meilleurs fixateurs, ce réactif prépare la coagulation totale, en acidifiant les protoplasmes et en les précipitant en partie. Les autres agents qui fout partie du

mélauge (acide osmi(|ue, bichromale de potassium, elc.), dilîusent plus lentemenl et n'arrivent au contact des cellules que lorsque celles-ci ont été tuées et en i)arlie précipitées par Tacide acétique. La rapidité d'action d'un fixateur doit donc avoir pour objet de tuer le plus vite possible les cellules : la précipitation totale, au contraire, doit se produire secondairement, de façon à ne pas produire de contractions. Pour résumer d'un mot ces propriétés, nous dirons que la mort des cellules doit être immédiate et que leur coagulation doit être médiate. 11 ne faut pourtant pas que la diffusion soit trop leule, sous peine de caus5r des altérations dans les cellules des parties profondes.

L'acidité du fixateur est donc une qualité indispensable. L'acide acétique est l'acide le ])kis employé : la plupart des fixateurs en renferment de 1 à 5 p. 100. Ce cori)S agit non seulement comme fixateur de la cliromaline, mais surtout en neutralisant ou acidifiant les tissus. En effet, la puissance de coagulation ou de précipitation de la plupart des fixateurs no peut s'exercer qu'en milieu neutre ou acide; un milieu alcalin la paralyse presque complètement ^ Uona et Golodetz- ont montré que tous les bons fixateurs sont des oxydants acides, qu'ils neutralisent b's propriétés réductrices des tissus,' et qu'ils favorisent ainsi les colorations (}). 271).

Visotonie est une qualité plus discutable. 11 semble que son importance, invoquée }tar Sjobring, soit plutôt tbéorique. En eiïet un liquide, isotonique pour un tissu donné, cessera de l'être dès le premier contact et n'atteindra les couclies profondes ([u'après avoir perdu son isotonie. 11 ne faut pas oublier non plus qu'une augmentation ou une diminution de concentration peuvent i)roduire une surfixalion de la périphérie des objets, ou nuire à la rapidité de la diffusion. L'emploi des liquides isoioniques a été repris à un autre point de vue par Dekhuyzen (p. 297) et par Rubenthaler (p. 296).

Notons enfin qu'un bon fixateur ne doit pas ratatiner les tissus, ne pas les noircir ni les rendre cassants et friables, enfin ne pas gêner les colorations ultérieures.

1. Pourlaul V. Bariial.io aurait obtenu de très bous résultats liistologiques et cytologiques (système nerveux, testicule), avec des fixateurs ulcalvts renfermant parties égales de chlorure de sodium et de sublimé et alcaliuisés par le bicarbonate de soude. Pour obtenir des fixations encore plus fines on ajoute du formol. Bull, délia Soc. zool. ital., XIII, p. 198-v>00, 1904 et XIV, p. 139-1419 : 205-i>ll, 1905. Je n'ai pas essayé ces méthodes.

2. Unna et Golodetz, Die Bedeutung des Saucrstoll'es in der Fàrbcrei. iJcrmat. Studien, XXII, 191-2.

GHAPITHE VII AGENTS FIXATEURS

Les agents fixateurs peuvent être d'ordre physique ou d'ordre chimique. Nous allons étudier séparément les uns et les autres.

Agents physiques. — Le froid ne peut exercer une action fixatrice. Il durcit les tissus et suspend les altérations cellulaires dues à la nécrose et à l'auto digestion. Aux températures ne dépassant pas 0°, cet agent ne saurait donc être qu'un adjuvant, par exemple dans la méthode de Borrel (p. 281). La congélation des tissus frais paraît être, a priori, un détestable procédé iiislologique : l'augmentation de volume des liquides qui remplissent les éléments et la formation d'aiguilles cristallines ne peuvent manquer de produire de véritables délabrements. Son seul avantage est de ne pas précipiter les albumines et de ne pas les altérer. Nous aurons à revenir sur cette question à propos des procédés de coupes par congélation (p. 329).

La chaleur exerce une action bien différente, suivant qu'elle est appliquée à des objets humides ou secs. La fixation par l'eau bouillante peut rendre des services pour les Invertébrés et pour les recherchés microchimiques. Von Tellyesniczky pense que l'action successive de l'acide acéli(iue et de l'eau bouillante peut donner de bons résultats, mais cette méthode ne paraît pas devoir se généraliser. La chaleur sèche est un agent fixateur 1res important : elle ne peut s'appliquer qu'aux frottis desséchés (p. 630).

Ceci nous amène à parler de la dessiccation dont le rôle est capital dans l'étude du sang et de beaucoup de Protozoaires, Nous V reviendrons à propos de la méthode des frottis desséchés (p. 626). Au point de vue microchimique, cette méthode serait très précieuse si elle pouvait être appliquée pratiquement aux tissus ; malheureusemement elle présente de grandes difficultés techniques (p. 365).

Nous mentionnerons ici l'emploi de la narcotisation comme adjuvant de la fixation. Ce procédé a été employé par Rubenthaler (p. 296) pour les tissus et il est d'usage courant (p. 537 et 619) pour les petits animaux aquatiques.

AGENTS FIXATEURS 271

/igents chimiques. — Pour Télude des lissus, les fixateurs chimiques so:il préférables à tous les autres. Nousallojis passer en revue les principaux agents, puis nous étudierons les mélanges fixateurs les plus employés.

Acide chromique (CrO^). — Cristaux rouges très déliquescents, à conserver en flacons bien bouchés à Témeri, ou mieux en solution à 1 p. 100 dans Teau distillée. Son action fixatrice ne s'exerce qu'en solutions très diluées (0,1 à 1 p. 100) car, en solutions plus concentrées, c'est un dissociateur puissant (p. 259) quoiqu'il fixe bien les noyaux. Ce corps est rarement employé seul à cause de ses nombreux inconvénients : il manque de pénétration et il produit, dans le cytoplasme, des réseaux artificiels, quelquefois très réguliers et très trompeurs; il empêche en outre certaines colorations, parce qu'il donne lieu à la formation d'oxyde de chrome dans les protoplasmes. Par contre il fait partie de nombreux mélanges, dont le type est le liquide de Flemming et dans lesquels il joue un rôle très important. D'après Unna et Golodetz, il cède facilement de l'oxygène et, employé avec d'autres acides qui forment des chromâtes solubles avec l'oxyde de chrome mis en liberté par réduction, il augmente la colorabilité des tissus.

Acide acétique cristallisable. — Liquide incolore, cristallisant au dessous de-f-17°. Réactif des plus importants, faisant partie de presque tons les mélanges fixateurs en tant que fixateur de la chromaline et élément acide très pénétrant. D'après Unna et Golodetz, il augmente les contrastes, empêche la séparation des oxydes métalliques et, mélangé avec des acides oxydants, augmente la colorabilité de tous les tissus. Employé seul (en solution aqueuse à 1 p. 100), il met en évidence le noyau des Protozoaires, au cours des examens extemporanés, mais ne peut servir de fixateur proprement dit, car il conserve très mal le cytoplasme et ses enclaves.

Acide picrique ou trinitrophénoî. — Petits cristaux jaunes, qu'on emploie en solution aqueuse saturée ou en solution alcoolique ^ Solubilité à froid dans l'eau : 0,6 p. 100, beaucoup plus soluble à chaud. Pour préparer la solution saturée à froid, mettre

1. L'acide picrique fait des taches indélébiles sur la laine et la soie. Sur le linge les taches s"effacent au lavage. Les taches des doigts s'enlèvent très facilement avec une solution de carbonate de lithium. .Jellinek (Z^sc/ir. f. wiss. M'ikr., XI, p. 243, 189-2i a montré que ce sel forme avec l'acide picrique une combinaison très soluble. On peut proliter éventuellement de cette propriété pour décolorer rapidement les tissus jaunis par les fixateurs picriques (p. 348).

au Tond (ïun gvimd llacon, bouclu' an liège ou à IVuiicri, uue épaisseur de un cenlimèlre d'acide picrique; verser par-dessus d(^ Teau distillée chaude, agiter et laisser reposer au moins douze heures. Quand on prélève une partie de ce liquide, on la remi»lace par un égal volume d'eau distillée, de manière à avoir toujours une provision de solution saturée. Ce liquide est inaltérable. Eviter de chauffer à feu nu les cristaux avec l'eau, à cause des propriétés explosives de l'acide picrique.

Ne s'en)|tloie seul qu'en histologie végétale. En histologie animale, l'acide picrifjue, qui est un des réactifs les plus pénétrants, fait partie de mélanges dont le type est le liquide de Bouin (p. 284).

Bichromates. — L'action de ces sels est bien connue grâce aux recherches de Burchardl^ Cet auteur les divise en deux groupes : certains bichromates alcalins (K, Na, AzH', Mg) et même ceux de strontium et de zinc fixent bien le cytoplasme, mais détruisent les noyaux. Au contraire les bichromates de baryum, de calcium et de cuivre fixent bien les mitoses, mais non le cytoplasme. Burchardt et von Tellyesniczky ([). 282) ont montré qu'on peut corriger ce défaut par l'addition d'acide acétique et (ju'on obtient ainsi d'excellents fixateurs.

Le plus employé de ces sels est le bichromate de potassium (K-Cr-0'), gios cristaux d'une belle couleur rouge orangé, facilement solubles dans l'eau (12,4 |). 100). Celte solution se conserve bien, de préférence en flacons à l'émeri.

Bichlorure de mercure ou Sublimé corrosif (llgCl-j. — Petits ci'islaux blancs très toxiques, solubles dans l eau (à froid 7 p. 100, à l'ébiillition 54 p. 100), très solubles dans l'alcool (33 i>. 100). Pour préparer la solution aqueuse saturée à froid, on dissout à chaud 10 p. 100 de ce sel et on laisse refroidir. Il se dépose do belles aiguilles cristallines et on décante le liquide clair au fur et à mesure des besoins.

Ce corps est un fixateur de premier ordre, mais il est nécessaire de l'éliminer complètement des tissus, dès que la fixation est terminée, pour éviter la formation de cristaux. Il est bien entendu qu'aucun objet métallique ne doit entrer en contact avec les solutions de sublimé, sous peine de précipitation immédiate.

Acide osmique (Os 0''). — Ce corjis devrait être nommé plus exactement tétroxyde d'osmium, parce qu'il ne possède pas en

1. Burchardt, Bichromate und Zellkcrn. La Cellule, XII. p. .'537, 1897.

AGENTS FIXATEURS 273

réalité de propriétés acides et ne fait pas virer le tournesol. Il se présente sous forme de cristaux jaunâtres. On le vend dans de petits tubes de verre scellés, renfermant des quantités variant de

0 gr. 1 à l gr. se méfier des erreurs de pesage). La manipulation de ce corps présente en effet des diflicultés [)articuliéies. Il est très volatil et émet sans cesse des vapeurs extrêmement irritantes; il faut bien se garder de respirer ces vapeurs et de sV exposer, car elles peuvent déterminer des conjonctivites très graves ^ Ce corps est d'ailleurs un oxydant très énergique; aussi est-il très rapidement réduit par des traces de matière organique. De ces particularités découle la nécessité de prendre des précautions spéciales pour préparer la solution. Le titre babituel est de 1 ou 2 p. 100; elle peut être faite dans de Teau distillée on mieux encore, comme l'indique Bolles Lee, dans de l'acide cbromique à

1 p. lO'O. Sous celle dernière forme, elle se conserve beaucoup mieux et se prête parfaitement à la fixation par les vapeurs osmiques et à la fabrication des mélanges chromo-acétiques. On peut encore, d'après Gori, ajouter à la solution aqueuse une très petite quantité de permanganate de potassium, sufiisante pour produire une coloration rosée. On renouvelle cette quantité si la solution se décolore. On peut enfin, d'après Pintner et Mayer, ajouter à 100 cm^ de solution aqueuse 10 gouttes de solution de sublimé à

On peut employer sans inconvénient un flacon en verre blanc, pourvu qu'il soit bien bouclié à Témeri, î3olles Lee a montré que la lumière ne réduit pas la solution, pourvu qu'on la tienne à l'abri de la poussière. L'essentiel est de nettoyer le flacon avec le plus grand soin, d'abord avec une solution de permanganate de potassium, puis avec de l'acide azotique et enfln de l'eau distillée. On nettoie aussi le petit tube qui renferme l'acide osmique : en enlève l'étiquette et toute trace de colle par un lavage minutieux. On donne alors un trait de lime sur le tube, on le laisse tomber dans le flacon, on bouche et on agite pour briser le tube. Dès que ce résultat est obtenu, on ajoute la quantité de liquide voulue : les débris du tube restent au fond du flacon. L'acide osmique se dissout assez lentement à froid, mais il faut bien se garder d'employer de l'eau cliuude qui pourrait le dissocier.

Les solutions d'acide osmique doivent être manipulées avec des soins particuliers. Non seulement les vapeurs qu'elles émettent

1. Les avis sont partages à ce sujet. Mais, tout en tenant compte des idiosyncrasies, on fera bien de prendre des précautions, parce que l"aition de ce rcactit' sur les yeux ne se fait pas sentir immédiatement, comme pour d"autrcs substances, telles f[ue le formol ou l'ammoniaque, dont les vapeurs sont intolérables.

M. Laxgeron. — Précis de Microscopie. 18

sonl dangereuses, mais il laut les préserver avec soin de la poussière qui les réduit très rapidement, avec formation d'un précipité noir. Comme c'est un prodiii[ 1res coûteux, on a intérêt à empêcher autant que possible cette réduction qui rend les solutions inutilisables. Il faut donc essuyer avec soin le pourtour du bouchon et du goulot avant d'ouvrir la bouteille, ne jamais y reverser un liquide déjà employé, même })our fixer par les vapeurs, et ne jamais y puiser avec une pipette.

L'acitle osmique ne forme pas de sels, mais seutement des composés d'addition ou d'oxydation. Ce n'est pas un électrolyte et les composés d'addition (ju'il forme avec les tissus, ne sont pas électrolysables; aussi peut-on dire avec Mann que ce corps tient, parmi les composés métalliques, la même place que l'aldéhyde formique parmi les composés organiques. Gomme lui, il fixe sans précipiter, c'est-à-dire d'une toute autre manière ({uo les sels métalliques. 11 lue rapidement les cellules et lixe bien le cytoplasme, mais moins bien le noyau. Il donne aux éléments une apparence homogène, qui nuit à la bonne différenciation optique des lîns détails de structure. De plus, il a grande tendance à se réduire dans les tissus et à les noircir, surtout Iors([u'iIs renferment beaucoup de cellules adipeuses. Son plus grand défaut est d'être très peu dilfusiblc, et par conséquent très peu pénétrant, de sorte que les couches superficielles des pièces sont surflxées (p. 280) bien avant que le réactif n'ait pénétré dans la profondeur. La surllxalion donne aux éléments des couches superficielles une grande fria!)ilité et une apparence homogène.

Ces inconvénients se présentent surtout avec la solution aqueuse, aussi l'emploie-t-on très rarement isolément. On l'associe généralement aux acides chromique et acétique dans les mélanges du Ivpe Flemming (p. 280).

Au contraire, à Tétat de vapeurs, c'est un llxateur parfait, mais il ne convient qne pour des objets très petits ou très minces, tels que les Protozoaires ou les frottis de sang. Pour le faire agir sous cette forme, le mieux est de préparer un bocal à large goulot sans col, bouché à Témeri (fig. 135), dont on garnit le fond de billes de verre, pour augmenter la surface d'évaporalion. Sur ces billes, on verse quelques centimètres cubes de solution à 2 p. 100. Pour des Protozoaires en suspension dans une goutte d'eau, on pose pendant 30 à 40 secondes la lame renversée sur l'orifice du bocal. Pour les frottis humides ou desséchés, on procède plus simplement, en introduisant la lame tout entière dans le bocal qu'on ferme immédiatement . L'exposition dure de 30 secondes à 1 minute.

Alcool éthyliqiie. — Ce corps ne peut servir de fixateur à

AGENTS FIXATEURS 275

l'élat isolé que sous îorme d' alcool absolu K Aux autres concentratious, l'action déshydratanle Temporle sur raction fixatrice et produit des contractions énergiques. Au contraire, Talcool bien absolu peut donner des fixations excellentes, surtout pour le système nerveux. Il fixe aussi très bien les frottis desséchés (p. 630).

Dans les bonnes maisons de produits chimiques, on trouve de l'alcool suffisamment absolu. Un bon moyen de s'en assurer consiste à verser quelques gouttes de cet alcool dans un tube à essai à demi plein de toluène ou de xylol; s'il ne se produit aucun louche, même très léger, Talcool est absolu. L'épreuve contraire ne signifierait rien car le xylol se mélange très bien avec un excès d'alcool à 90, sans produire de trouble. On peut encore employer le carbure de calcium, qui dégage de l'acétylène au contact de la moindre trace d'eau.

On peut arriver à déshydrater de l'alcool insufPisamment absolu, en l'additionnant d'une certaine quantité de sulfate de cuivre calciné. Ce dernier existe aussi dans le commerce, mais il est bon de le calciner de nouveau, au rouge, dans une capsule de porcelaine ou un têt de terre poreuse, en le brassant avec un fil de fer ou de cuivre, jusqu'à ce (|u'on obtienne une poudre bien blanche. Sous cette forme, le sulfate de cuivre est un corps extrêmement avide d'eau, dont il s'empare en bleuissant. On répétera donc le traitement de l'alcool, par addition de poudre calcinée et décantations successives, jusqu'à ce que le sulfate de cuivre ne bleuisse plus.

On ne saurait trop répéter que la fixation })ar l'alcool seul est d'un emploi délicat sauf pour la grosse anatomie végétale. L'oubli de ce principe est trop souvent la cause de très mauvaises fixations. On ne tient pas compte de ce que la plupart des tissus renferment environ 80 p. 100 d'eau : or. si on n'emploie pas une grande quantité d'alcool, le titre de ce dernier baisse immédiatement et, au lieu d'une fixation véritable, on obtient simplement une déshydratation, plus ou moins compliquée de macération.

Lorsqu'on emploie l'alcool bouillant, il tant opéi'er au bainmarie (l'alcool éthylique bout à 4- 78°5) et avec précaution, à cause de l'infiammabililé des vapeurs.

D'après Kittsteiner-, on pourrait employer l'alcool dénaturé par

1. i^a fixation par des alcools de concenlratiou croissante, très employée par les anciens liistologistes, est tout au plus bonne pour conserver leur forme aux objets destinés aux recherches de systématique.

2. Kittsteiner. Untersuchungen ûber die Einwirkuug des denaturierten Alkohols auf tierische Organe und seine Vorwendbarkeit in der mikroskopischer Technik. Zlschr. f. miss. Mikr., XXVI. p. 191-192. 1909.

â76 MÉTHODES GÉNÉRALES

la pyridine, dans les niènies conditions que Falcool à 90'\ c'est-àdire comme constituant de mélanges fixateurs et comme liquide de lavage, mais jamais comme fixateur unique, parce que les bases pyridiques contractent les noyaux et en dissolvent certaines parties. L'acide acétique neutralise cette action.

Alcool méthyliqiie. — Réactif très important dans la technique des frottis desséchés {\). -411 et 630).

Acétone. — Ce corps i)eut constituer, dans certains cas, un fixateur assez passable pour les frottis desséchés (p. 411) mais il n'est pas à recommander pour les tissus, car il cause encore plus de contractions que l'alcool. C'est surtout un agent de déshydratation (p. 303).

Formaldéhyde. — Ce corps est un gaz, dont la solution aqueuse porte le nom de formaline ou de formol. Toutes les fois que nous parlerons de formol pur, nous aurons en vue la solution commerciale à 40 p. 100.

Le formol a pris en technique une importance considérable à cause de son prix peu élevé et de la facilité de son emploi. 11 a môme été Tobjet d'un véritable engouement, dont on tend d'ailleurs à revenir. On a notamment abusé de ce produit comme liquide conservateur, mais on n'a pas tardé à s'apercevoir qu'il présente, dans certains cas, les plus graves inconvénients (p. 432).

Comme fixateur, il joue un rôle important à cause de son pouvoir coagulant et de sa remarquable puissance de pénétration. 11 importe de dire que ces propriétés ont été signalées pour la première fois par un Français, ïrillat, en 1892^ et non par Blum, dont la publication est postéiieure d'une année ^. Ce corps a fait depuis Tobjel d'un grand nombre de travaux, parmi lesquels il convient de citer ceux de Hermann" et de Sjobring'.

Le formol du commerce est un liquide incolore, émettant des vapeurs très irritantes mais beaucoup moins dangereuses que celles de l'acide osmique. 11 est fort désagréable de manipuler des pièces imbibées de formol, à cause des violents picotements qu'on ne tarde pas à ressentir dans, les yeux : l'action sur la muqueuse pituitaire est peut-être moins sensible, mais ])lus durable, et l'olfaction peut finir par se trouver sensiblement diminuée. Il faut éviter

1. C. li. Acud. des Se, CXIV, p. 1278, 1802. " 2. Ztschr.f. loiss. Mikr., X, p. 313, 1893.