M E T II O DES G E N E R A L E S

histologiques, à la condition de se rappeler que son faible pouvoir pénétrant force à le réserver pour de très petites pièces, ou pour de très petits fragments d’organes.

2° Indications de la fixation par l’acide osmique. —

Ce réactif est souvent employé pour la recherche des graisses dans les tissus, parce qu'il se réduit énergiquement à leur niveau, et les teint en noir absolu, mais cette réaction n'est pas exclusive à celles-ci, et il suffit de rappeler que les grains de proferments des cellules pancréatiques se teignent en noir par l’acide osmique, pour montrer que cette réaction 11e suffit pas à elle seule pour affirmer la nature graisseuse des particules que l'on peut trouver teintes en noir après son action.

L'acide osmique gêne la coloration ultérieure par le carmin

et l'hématéine des pièces qui ont été fixées par lui, mais cet inconvénient est beaucoup atténué si, au lieu de la solution, 011 emploie les vapeurs ; il n’existe pas pour les couleurs d’aniline.

§ 4. — Formol

Le formol, entré depuis peu dans la technique, a été bien vite l'objet de recherches multiples et a pris une place assez importante parmi les fixateurs. 11 consiste dans une solution aqueuse à 40 p. 100 d’aldéhyde formique. Cette solution incolore, très limpide, est livrée par le commerce ; pour faire le liquide fixateur 011 verse de 3 à 10 centimètres cubes de la solution dans 100 grammes d'eau distillée. Le titre exact de la liqueur fixatrice sera indiqué ci-dessous, suivant les applications.

1° Mode d’emploi. — lia solution de formol est un liquide incolore doué d’une odeur forte qui provoque des picotements dans les muqueuses conjonctive et nasale. D’ailleurs les vapeurs qui causent cette action 11e sont pas nocives, 011 peut les respirer sans danger, et la sensation désagréable qu’elles produisent cesse immédiatement avec leur éloignement : elles ne laissent donc pas de lésions après elles.

Pour remployer, on la verse dans un flacon de capacité déterminée suivant la nature des pièces à fixer, et dont le fond est garni d’ouate, pour élever la pièce au milieu du liquide. On y plonge alors les tissus destinés à subir la fixation. Comme le formol est très pénétrant, on peut y mettre des pièces assez volumineuses, à la condition toutefois d'employer une grande quantité de liquide et de renouveler ce dernier. 11 est bon de le changer une première fois au bout de vingt-quatre heures puis tous les deux ou trois jours pendant deux semaines, et enfin au bout de ce temps seulement lorsqu’il se trouble.

La fixation est généralement obtenue en vingt-quatre heures, mais comme on vient de le voir, on peut laisser les pièces dans le formol assez longtemps, car il agit comme liquide conservateur.

Les organes traités par le formol prennent une consistance spéciale, à la fois dure et élastique comme celle du caoutchouc, de telle sorte qu’avec un peu d’habitude on peut faire des coupes au rasoir directement au sortir du liquide et sans inclusion préalable. Lorsqu'on veut faire une inclusion, on peut passer les pièces sorties du formol dans l’alcool, ce dernier ne les ratatine pas, car l’action fixatrice du formol a été suffisante pour les rendre résistantes; cependant il est bon de commencer par l'alcool à 70° pour s'élever ensuite jusqu’à celui à 90°.

2° Indications. — Le formol a été employé comme fixateur à peu près pour tous les organes, en faisant varier, suivant la nature de ces derniers, le titre de la solution.

Pour les objets très délicats comme les embryons, une solution à 3 p. 1 00 donne de bons résultats.

On peut aussi, comme l'a faitGEROTA, employer une solution alcoolique dans l’alcool à 85° :

Solution.

( Formol. .

( Alcool à 85°

Les viscères, rein, poumon, foie, intestin, testicule, ovaires, etc., doivent être fixés dans une solution de 4 à 6 p. 100. On peut aussi employer la solution alcoolique.

MÉTHODES GÉNÉRALES

Enfin le système nerveux central est très Lien fixé par une solution à 10 p. 100. C’est pour les organes nerveux que le formol donne les meilleurs résultats et qu'il doit vraiment être employé d’une manière courante. Grâce à son grand pouvoir pénétrant, il permet de fixer aisément un cerveau entier.

Pour un cerveau d’homme adulte il faut employer au minimum deux litres de solution : on change le liquide toutes les vingt-quatre heures pendant les trois premiers jours, puis tous les cinq jours; la fixation est achevée en deux semaines. Il permet aussi de traiter parla méthode de Golgi les obj ets qu'il a fixés.

En dehors de ses applications au système nerveux central pour lequel il donne vraiment d’excellents résultats, le formol ne me paraît pas supérieur aux fixateurs qui sont indiqués ici, et il est certainement inférieur à quelques-uns tels que le liquide de Flemming et le sublimé. Quoi qu'on en ait dit, il ne fixe pas très bien les globules du sang, du moins dans l'épaisseur des pièces, il les rend globuleux et les gonfle un peu. II dissout aussi l’hémoglobine, qui reste dans les vaisseaux et prend une teinte un peu noire; il produit toujours un léger gonflement si on l’emploie à un titre supérieur à 10 p. 100, et il conserve assez mal les muscles, le foie, le placenta, les poumons (Gerota).

Ce qui a beaucoup étendu son emploi, c'est sa valeur comme liquide conservateur, et ce fait qu’il ne décolore et ne déforme pas les pièces. On peut conserver des petits animaux entiers, chats nouveau-nés, etc., si l’on a soin de les injecter de formol par l’aorte et de les plonger dans la solution en ouvrant leurs cavités viscérales. On peut ensuite prendre sur ces individus telle pièce qu’on voudra pour l’examen histologique.

Les pièces fixées au formol se prêtent bien à toutes les colorations ultérieures, à la condition d’être bien lavées à l’alcool à 70° pour enlever toute trace du fixateur.

§ 5. — Liquide chromo- a céto-osmique (Liquide de Flemming.)

Flemming remarqua, il y a déjà plusieurs années, que si l’on mélange de l’acide osmique avec une solution d’acide chromi-

F TX A T 1 0 N

que, Ton obtient un réactif fixateur très puissant, supérieur à l'acide osmique et à l’acide chromique employés seuls et dont la valeur est encore augmentée par l'adjonction d’une petite quantité d’acide acétique. Ce fut là l'origine des mélanges chromo-acéto-osmiques dont plusieurs formules différentes ont été proposées par Flemming lui-même , et par d'autres histologistes, notamment par Fol.

Actuellement celui de ces mélanges qui paraît avoir le plus » la faveur des techniciens, est le mélange fort de Flemming, dont la formule est la suivante :

Acide chromique (sol. aqueuse à 10 p. 1 00). 15 parties Acide osmique (sol. à 1 p. 100) .... 80 —

Acide acétique cristallisable 10

Eau distillée 95 —

Ce mélange a la couleur rouge-brun de l’acide chromique et émet d’abondantes vapeurs osmiques, qui nécessitent pour son emploi les mêmes précautions que pour ce réactif employé seul. Il se conserve assez bien pendant quelque temps, néanmoins il vaut mieux le faire au moment de s'en servir. On prépare séparément et d'avance la solution chromique et l’acide osmique, puis on fait le mélange et on ajoute les autres éléments au moment de l'emploi.

1° Mode d’emploi. — Le liquide de Flemming est, comme la solution osmique, du reste, peu pénétrant; il importe donc de n'y plonger que des organes de petit volume, ou de petits fragments de pièces volumineuses. Ces fragments, suspendus dans le milieu du liquide par un fil, sont fixés suivant leur grosseur, en quelques heures ou bien en un ou deux jours.

Les très petits morceaux peuvent être retirés du bain fixateur au bout de trois à six heures, les autres y seront maintenus plus longtemps, de vingt-quatre à quarante-huit heures.

D'ailleurs, une pièce même petite peut rester dans le liquide de Flemming pendant quarante-huit heures, sans qu'il en résulte d’inconvénients. Comme dans les autres cas, il faut

changer le liquide fixateur s'il se trouble avant que le temps nécessaire à la fixation soit écoulé.

Les pièces une fois fixées sont retirées du liquide et lavées soigneusement à l’eau. C’est là un temps fort important de la technique de ce réactif auquel on ne saurait accorder trop d’attention. Une pièce qui est restée quarante-huit heures dans le liquide de Flemming doit être lavée pendant douze heures sous un robinet d’eau courante. Pour faire ce lavage, on procède de la façon suivante : les pièces sont placées dans un bocal, sur l'ouverture duquel on met un entonnoir, séparé de la paroi du bocal par un agitateur de verre destiné, en écartant les deux instruments, à laisser passer l’eau de lavage. On porte le tout sur un évier, et on ouvre un robinet dont on règle le débit de manière que l’eau arrivant compense exactement celle qui sort du llacon. Comme les petites pièces pourraient se glisser entre l’ouverture et l’entonnoir, et être entraînées par l’eau, on les place dans la petite boîte de porcelaine perforée qui a été décrite précédemment. Il est préférable, si on le peut, d’opérer le lavage avec de l’eau tiède (45° au maximum), qui enlève mieux et plus rapidement la partie du fixateur qui, ne s’étant pas combinée avec les tissus, reste dans les mailles de ces derniers et, précipitée par l’alcool, gâterait ensuite les préparations.

Lorsque le lavage est achevé, ou porte la pièce dans de l'alcool à TO0 souvent renouvelé, puis au bout de quarante-huit heures au plus tard dans de l'alcool à 90°, qui permet de la conserver pendant un certain temps pour un emploi ultérieur, mais dans ce cas comme dans les autres, il vaut toujours mieux effectuer les préparations de suite que de laisser séjourner longtemps la pièce dans l’alcool.

Les pièces traitées parle liquide de Flemming ont une teinte qui varie du brun plus ou moins foncé au noir, suivant la quantité de graisse qu'elles renferment.

2° Indications. — Le liquide de Flemming est un fixateur de premier ordre. On doit l'employer toutes les fois qu'on veut faire des recherches délicates. Il conserve très bien les

figures de la division cellulaire, tant celles qui se rapportent aux filaments nucléaires que celles fournies par les filaments des fuseaux et les asters.

Il a de plus un autre avantage précieux, c’est que, mieux que tout autre, il donne aux éléments cellulaires une résistance considérable aux actions mécaniques qu’ils ont à subir du fait des manipulations ultérieures (gonflement par hydratation, ou dislocation par les déshydratations et hydratations successives, employées pour achever la préparation). Cette résistance est probablement due à la combinaison de l’acide chromique avec les parties élémentaires, combinaison qui donne à ces dernières une solidité plus grande qu’après tout autre fixateur. Aussi les pièces fixées par le liquide de Flemming résistent mieux que les autres à la déformation produite par l'inclusion dans la paraffine. A ce titre, pour les cas où l’on désire des coupes en série qui nécessitent à peu près sûrement l'inclusion dans la paraffine, la fixation par le liquide de Femming s’impose de préférence à toute autre.

Le liquide de Flemming étant acide dissout les sels calcaires.

11 décalcifie par conséquent les os de très petit volume, tels que les lames osseuses minces, ou la faible croûte osseuse qui se forme autour des cartilages tout au début de l’ossification. Lors donc que l'on a fixé par ce liquide pendant quarante-huit heures des embryons chez lesquels l’ossification ne fait que commencer, on peut effectuer des coupes sans recourir à une décalcification préalable comme cela est nécessaire pour les cas où les os sont plus développés (voir p. 253).

Le liquide de Flemming rend les pièces friables, et certaines d entre elles, comme les blastodermes de poulet, les embryons très jeunes, le foie se brisent sous la moindre pression. Il est bon d’en être averti.

Les coupes faites sur des organes fixés par ce réactif se colorent très lentement et très difficilement par Fliématoxyline et par le carmin ; cela a même contribué à limiter, dans quelques cas, l’emploi de la liqueur en question comme fixateur, mais depuis la généralisation de l'emploi des couleurs d’aniline pour les colorations de pièces, on n'a plus à se préoccuper de