T E G II NIQUE A P P L I Q U E E

viennent épineux , D’autres encore voient le centre de leur disque se déprimer d'un côté en faisant saillie de l’autre et se transforment ainsi en sortes de petites coupes ou de calottes (: globules en calotte). D’autres enfin se gonllent et deviennent globuleux. Au bout de quelques heures la préparation est absolument perdue et ne renferme plus un seul globule intact; le sang s’étant du reste coagulé, elle pourra servir à montrer la fibrine comme on le verra plus loin.

2U Examen direct du sang de grenouille. — On anesthésie profondément une grenouille au chloroforme, on la fixe sur une planchette et, incisant la peau au-devant du sternum on soulève ce dernier avec des pinces. On découpe dans le sternum une petite fenêtre et on découvre ainsi le cœur; on ouvre le péricarde, on attire au dehors la pointe du cœur que l'on tranche brusquement d’un coup de ciseau. On recueille une goutte de sang que l'on prépare comme il vient d’être dit sous une lamelle bordée à la paralline, et que l'on examine immédiatement. Pendant ce temps un aide recueillera en vue d’autres préparations le sang qui continue à couler. Ceci fait la grenouille sera tuée par destruction de la moelle et du cerveau.

Les globul es rouges du sang de la grenouille sont beaucoup plus gros que ceux des mammifères; ils sont en outre elliptiques et présentent un centre clair occupé par le noyau absolument incolore et qui tranche ainsi sur la teinte de l’hémoglobine. Ce noyau, arrondi et doué d’une certaine épaisseur, fait bomber le centre du globule sur les deux faces du disque elliptique formé par ce dernier, de sorte que, contrairement aux globules discoïdes des mammifères qui se montrent biconcaves même lorsqu’ils sont vus de profil, ceux de la grenouille se montrent alors biconvexes. Leurs déformations sont moins marquées et moins rapides que celles des hématies des mammifères ; cela tient peut-être à ce que leurs conditions de température sont moins changées par le fait de l’obervation que pour ceux-ci. Une de leurs principales modifications, signalée par Uanyier, est un plissement radjaire du disque du

globule. Les globules blancs, beaucoup moins volumineux que les rouges, se montrent sous la forme de petites sphères claires, finement granuleuses. Ils présentent des mouvements ami boïdes.

3° Examen du sang dans un sérum. — Lorqu'on examine directement une goutte de sang recouverte par une lamelle, il arrive souvent que les globules sont si nombreux qu'ils se touchent tous, se superposent et empêchent l’observation. On remédie à cela en diluant une goutte de sang obtenu comme il vient d’être dit dans un sérum ou dans un liquide indifférent. On peut prendre le sérum sanguin de l'animal qui fournit son sang, ou bien encore de l’eau salée à 7,5 p. 1000.

On peut aussi employer une solution de sulfate de soude à 5 p. 100.

Le sang dilué dans ces sérums se conserve intact pendant quelques heures, et si l'on se sert du sulfate de soude, la coagulation ne se produisant pas, on peut poursuivre aisément l’observation. Cependant la préparation finit par s’altérer, le sérum sanguin lui-même employé comme milieu indifférent ne met pas les globules rouges à l’abri delà déformation globuleuse (Ranvier). On ne peut donc faire avec ces méthodes que des préparations extemporanées.

§ 2. — Examen du sang après fixation

On peut fixer le sang, comme les autres tissus, mais le choix du fixateur importe beaucoup. En effet, non seulement les globules rouges sont très délicats et leur forme très altérable, mais encore la substance caractéristique qu’ils renferment, l’hémoglobine, se dissout aisément sous diverses influences et abandonne le globule qui lui sert de support habituel. Dans ces conditions le globule rouge manquant d'un de ses principaux caractères peut être méconnu dans une préparation. 'Il importe donc, avant toute tentative de fixation, de connaître l’action des divers réactifs sur la forme des globules et sur l’hémoglobine.

T E G H .N I Q U E A PPLIQUEE

1" Action des réactifs sur les globules et sur l'hémoglobine. — Parmi les corps qui peuvent être mis en présence des globules rouges, les uns dissolvent l’hémoglobine et l’enlèvent, les autres non seulement 11e la dissolvent pas, mais la fixent sur les globules, de telle façon qu’elle résiste alors à des lavages qui l'auraient enlevée sans cela. Nous indiquerons les corps qui dissolvent et ceux qui conservent l’hémoglobine, en même temps que leur action sur les globules.

a. Dissolvants de. V hémoglobine. — L’eau pure, naturelle ou distillée, dissout l'hémoglobine, elle décolore par conséquent les globules, puis les rend sphériques et transparents. Elle est donc toujours à éviter pour la préparation du sang.

Un grand nombre de solutions salines faibles et étendues agissent de même.

La bile dissout très rapidement l’hémoglobine, gonfle les globules et les fait éclater. Ils disparaissent sans laisser de traces.

L’éther dissout entièrement l’hémoglobine, 011 peut s’en servir pour isoler cette substance. Le chloroforme agit de même.

L'alcool étendu dissout aussi l’hémoglobine, et si les globules rouges fixés par l'alcool au tiers, conservent en majeure partie leur forme, ils sont par contre absolument décolorés. Lorsqu’on fixe des pièces dans l'alcool à 90°, dans le centre de la pièce où l'alcool n’est arrivé qu’à un état de dilution assez grand, les globules rouges contenus dans les vaisseaux sont décolorés. A la périphérie où l’alcool était plus pur l’hémoglobine est restée lixée aux hématies.

La congélation enlève aux globules rouges toute leur hémoglobine qui se dissout dans le plasma. Il faut s'en souvenir pour le cas où on ferait des coupes de tissus en se servant de ce procédé de durcissement.

L'électricité appliquée sous la forme d'une série d’étincelles obtenues par la bouteille de Leyde, ou sous la forme de courants d’induction, entraîne aussi la dissolution de l’hémoglobine dans le plasma.

Enfin la dessiccation lente d’une couche de sang dans l’air amène une déformation complète des globules qui peuvent en outre perdre une partie de leur matière colorante.

SANG

b. Fixateurs de V hémoglobine . — Une série <le réactifs conservent à la fois la structure des hématies et fixent l’hémoglobine. Ce sont :

L’eau salée à 7,5 p. 1000 qui peut être employée avec fruit comme milieu indifférent;

L'acide picrique, dont la solution aqueuse saturée conserve bien la forme des globules et lixe l'hémoglobine. Après son action les globules rouges se colorent admirablement par l'éosine ;

L'alcool absolu, à la condition d’être employé en grande quantité sur des morceaux peu épais, car on a vu avec quelle facilité il s'hydrate en traversant les tissus, et on sait qu'il dissout alors riiémoglobine ;

L’acide osmique en solution à 1 p. 100. Il fixe bien, sans empêcher toutefois quelques globules de devenir épineux ;

Le formol, qui pourtant dans l’épaisseur des pièces, gonlle un peu les globules rouges ;

Le liquide de Muller qui conserve bien la forme des globules rouges ainsi que l’hémoglobine, et permet la coloration caractéristique rouge brique par l’éosine ;

Le liquide de Flemming, qui lixe bien d’une manière générale, mais cependant gonlle un peu quelques globules et les décolore. Cette action est peut-être due à l'acide acétique qui entre dans la composition de ce réactif. Le liquide de Flemming coagule le plasma sanguin dans la lumière des petits vaisseaux ;

Le sublimé en solution aqueuse concentrée;

La dessiccation brusque qui conserve très bien et la forme des globules et l’hémoglobine, de telle manière que l'on peut étudier avec fruit une couche très mince de sang étalée sur une lame et rapidement desséchée.

De l’exposé ci-dessus résulte la possibilité d’un certain nombre de procédés de fixation. Nous indiquerons les suivants :

2° Fixation du sang par dessiccation rapide. — Une

goutte de sang recueillie comme il aété dit plus haut est placée

sur une lame de verre très propre et légèrement chauffée à la flamme d’une lampe à alcool. On l’étale très rapidement en une couche aussi mince que possible en se servant d’une aiguille ou d’une baguette de verre que l’on promène horizontalement sur la lame. 11 est indispensable d'aller très vite et d’étaler le sang aussi régulièrement et en couche aussi mince que l’on pourra. On passe alors la lame deux ou trois fois sur la flamme de la lampe à alcool, et la préparation est achevée. On recouvre d’une lamelle qu’on lute à la paraffine pour l’empôcher de glisser, et l’on peut examiner de suite.

La plupart des globules rouges sont parfaitement fixés et ont gardé leur couleur jaunâtre. Ils ont conservé les dimensions qu’ils avaient pendant la vie.

3" Fixation du sang dans un liquide. — On recueille quelques gouttes de sang vivant, on les fait tomber dans un verre de montre contenant quelques centimètres cubes de la solution à 1 p. 100 d'acide osmique. On agite avec une baguette de verre, puis, recouvrant le verre de montre d'une cloche pour le mettre à l’abri des poussières, on attend une heure environ. Au bout de ce temps la fixation est achevée et les globules sont tombés au fond du verre. On enlève l’acide osmique au moyen d’une pipette, ou mieux en se servant d’un fil de coton qui, plongé dans le liquide, agit à la manière d’un siphon, et l'entraine au dehors. On remplace l’acide osmique ainsi enlevé par de l’eau distillée que l’on renouvelle plusieurs fois, toujours en se servant du même procédé.

On peut alors examiner les globules dans l'eau, ou bien les colorera l’hématéine et à l’éosine.

Tout en les laissant dans le verre, on les colore par les procédés habituels, on les déshydrate en les laissant toujours en place et on y met ensuite quelques gouttes d’essence de girolle ou d’origan. On prend alors avec une pipette un peu du dépôt qu’ils forment, on le porte dans une goutte de résine dammar placée sur une lame de verre, on recouvre d’une lamelle et la préparation est achevée.

Cette méthode est longue, elle entraîne la perte d'un grand

nombre de globules qui sont nécessairement enlevés pendant les lavages successifs, mais elle donne des résultats très sûrs pour la conservation de la forme.

On peut l’employer avec n’importe lequel des fixateurs que nous avons indiqués.

Dans la pratique et pour les besoins ordinaires il vaut mieux se servir du procédé ci-dessous.

4" Fixation par un réactif du sang étalé sur une lame. —

Sur une lame bien propre, on étale rapidement en couche aussi mince que possible une goutte de sang, puis on plonge la lame dans la solution de sublimé.

Au bout de dix minutes environ la lixation est achevée.

On lave soigneusement à l’eau ou à l’alcool à 7()u et la préparation est prête à recevoir les réactifs colorants.

Le sang parfaitement fixé est collé sur la lame par coagulation de l'albumine et on peut le soumettre à diverses manipulations sans craindre de l’enlever.

On peut faire sur les préparations ainsi obtenues toutes les colorations qu’on désire. Nous en indiquerons seulement une, la coloration à l’hématéine et à l'éosine.

On hydrate progressivement le sang (si on a lavé à l'alcool). On le recouvre de quelques gouttes d’hématéine. Au bout de quelques minutes on lave soigneusement à l’eau. On colore par l'alcool éosiné et on déshydrate par l’alcool absolu. On monte au baume. Les globules rouges ont la teinte rouge brique caractéristique de l’hémoglobine. Les globules blancs ont leurs noyaux violets et leur protoplasma rose. Quelquesuns présentent de grosses granulations fortement colorées en rouge, ce sont les granulations éosinophiles d’EimucH.

5Ü Plaquettes de Bizzozero liématoblastes. — Ces éléments sont très délicats et se conservent mal dans les préparations que nous venons d’indiquer, et il importe pour les étudier d’employer des procédés spéciaux.

D’après Rizzozero, le cobaye est un des animaux chez lesquels on observe Je mieux les plaquettes. Un peut les étudier

dans le sang circulant du mésentère (voy. plus loin) ou dans la préparation suivante : La pulpe de la plante des pattes de cet animal est bien lavée et séchée aseptiquement. On y pose une goutte d'un liquide ainsi composé :

Solution aqueuse concentrée de violet de

méthyle I volume

Solution aqueuse de chlorure de sodium à 7,5 p. 1000 5 000 —

et à travers ce liquide on pique fortement. Une goutte de sang sort et se mêle à la matière colorante. On porte le tout sur une lame que l’on recouvre d’une lamelle et l'on observe. Les plaquettes se reconnaissent à leur coloration intense et se distinguent des leucocytes parce qu'elles sont plus petites, discoïdes et d'un brillant particulier.

6° Préparation de la fibrine. — Une goutte de sang un peu épaisse est placée sur une lame de verre et recouverte d’une lamelle qu’on lute à la paraffine. Au bout de douze heures environ on enlève la bordure de paraffine avec un scalpel et on écarte avec précaution la lamelle pour ne pas détacher le caillot qui s'est formé en dessous d’elle. Avec une pipette on arrose ce dernier d’eau distillée, de manière à entraîner mécaniquement les globules rouges. Cela demande un peu de temps et de patience. Lorsque le réseau de fibrine est suffisamment dégagé des globules qui le masquaient, ce dont on peut s’as-

surer en examinant de temps en temps la préparation à un faible grossissement, on colore fortement à l'éosine et on monte au baume.

La fibrine est teinte en rouge, Elle forme un réseau fin, aux nœuds duquel se trouvent de petits corps également rouges et doués des mêmes propriétés que les filaments de fibrine eux-mêmes, c’est-à-dire se gonflant dans l’eau et se dissolvant

dans l’acide acétique.

Les filaments de fibrine ont un aspect granuleux qui permet de les distinguer aisément des fibres élastiques, d’ailleurs beaucoup plus réfringentes et insolubles dans l'acide acétique

et des libres connectives beaucoup plus volumineuses, non granuleuses et moins colorées.

Pour reconnaître la fibrine dans les cas douteux on peut employer la méthode suivante (Weigert) : On traite les coupes pendant quinze minutes par le violet de gentiane, on lave à Peau, puis à l’eau iodo-iodurée (iode 1 gramme, iodure de potassium 3 grammes, eau 300 centimètres cubes), on lave de nouveau à l’eau puis on passe très rapidement dans l’alcool, dans un mélange d’huile d’aniline et de xylol (huile d’aniline 1, xylol 2), puis dans le xylol pur et on monte au baume. La fibrine reste bleue, le reste se décolore.

7° Réactions colorées des hématies. — Le sang ne s’observe pas seulement dans des préparations faites spécialement dans ce but, on le rencontre encore dans la plupart des préparations de tissus ou d’organes. Il importe donc de bien connaître les couleurs que prennent les globules rouges sous l’action des différentes matières colorantes, afin de les reconnaître au sein des organes, même lorsqu’ils sont comprimés et déformés, comme cela leur arrive souvent.

L’éosine leur donne une couleur rouge brique très caractéristique et que l’on ne saurait oublier lorsqu’on l’a vue une fois. C'est un des colorants par excellence des globules rouges, et c’est pourquoi nous donnons une place importante à la double coloration par l’hématéine et par l’éosine, qui permet de retrouver des globules rouges même très peu nombreux au sein d’une préparation.

Le picro-carmin les colore en jaune par l’acide picrique qu’il renferme.

Lasafranine teint les globules en rouge, mais elle s’attache peu fortement à eux et dans les colorations multiples, elle est chassée soit par le vert lumière dans la coloration de Benda, soit par l'orange G. Le violet de gentiane de même les teint en violet-noir, mais le plus souvent les globules ainsi colorés sont décolorés par l’orange.

L’orange G les teint en orange terne.

T ECU N 1 Q U E A 1’ P L 1 Q CEE

Le bleu polychrome les colore en jaune verdâtre ou en vert brillant suivant l’intensité de la coloration donnée à la préparation. C’est une réaction très caractéristique de ces éléments.

§3. — Examen du sang circulant dans les vaisseaux

Un des meilleurs moyens de connaître la forme et la structure des globules sanguins c’est d’examiner le sang circulant dans les vaisseaux. Différents objets d'étude permettent de faire cette observation. Ce sont les petits poissons à peine éclos et transparents que l’on peut tenir vivants dans une goutte d'eau sur une lame de verre, les têtards de batraciens anoures et les jeunes tritons dont la queue très transparente se prête admirablement à l’examen, et enfin différentes membranes minces, comme Ja langue de la grenouille, la membrane interdigitale de cet animal, son mésentère ou même celui d’animaux mammifères tels que le cobaye. Nous étudierons seulement deux cas très simples.

1° Examen du sang circulant dans la queue des têtards. — On prend des têtards très jeunes et peu pigmentés (ceux de rainette conviennent très bien), on les place sur une lame de verre dans une goutte d’eau, et on les maintient couchés sur le côté par quelques bandes de papier filtre mouillé placées en travers sur eux. On recouvre leur queue d’une lamelle et on observe avec un objectif de distance focale appropriée à l’épaisseur de la préparation. On distingue admirablement sur la ligne médiane ventrale le double courant de l’artère et de la veine caudale, puis des courants dérivés qui vont de l’une à l’autre par l’intermédiaire de petits capillaires recourbés en anse et qui s’étalent dans l’épaisseur de la lame caudale. On voit les globules rouges filer rapidement dans le centre de la lumière du vaisseau, les globules blancs les suivre dans ce mouvement, ou, dans les vaisseaux plus larges, circuler dans une couche liquide périphérique dont la course est moins rapide, et s’arrêter

SANG

même quelquefois contre la paroi du vaisseau. Les globules rouges doués d'une élasticité parfaite se prêtent à tous les mouvements que leur imprime le liquide, se déforment sur les éperons qui séparent deux capillaires à leur point de branchement, et reprennent ensuite leur forme sans présenter la moindre altération.

De temps en temps l'animal fait des mouvements qui forcent à interrompre l’observation, mais en général celle-ci est très facile, et il n’est pas besoin, lorsqu’on ne veut pas faire de dessin, de curariser les têtards.

2° Examen du sang circulant dans le mésentère de la grenouille. — On curarise une grenouille par l'injection sous-cutanée d'une ou deux gouttes de curare au millième. On prépare une planchette de liège qui servira à supporter l’animal et que l'on placera ultérieurement sur la platine du microscope en l'y faisant tenir à l'aide des valets. Sur un point de la planchette correspondant au trou que porte la platine du microscope et par lequel arrivent les rayons lumineux, on pratique un orilice circulaire au-dessus duquel on dispose un petit cylindre creux de liège, de la hauteur de i centimètre et demi à 2 centimètres. Le bord supérieur de ce cylindre présente en dedans une moulure verticale saillante de 2 ou 3 millimètres. On place alors la grenouille sur le dos, on fait à un de ses flancs une ouverture en évitant de blesser la veine latérale, et on attire au dehors une anse d'intestin que l’on place sur le cylindre de liège de manière à tendre modérément le mésentère sur l’ouverture de ce dernier. L’intestin retenu par la moulure saillante dont nous avons parlé n'a pas besoin d’être autrement fixé. On observe le sang circulant. La rapidité du courant est telle que l’on a. de la peine à distinguer les globules, on voit cependant bien que le courant est plus rapide au centre du vaisseau qu'à sa périphérie (couche adhésive). Au fur et à mesure que l’observation se prolonge, l’inflammation se produit et on peut observer la sortie des globules blancs hors des vaisseaux (diapédèse). On peut prolonger l’observation pendant plusieurs