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nigra. Le taux d’azote est de 6,6 dans les récoltes inférieures à 0,1 gr. et 5,3 quand le poids de récolte est compris entre 1 gr. et 1,5 gr. Ce phénomène paraît donc général, qu’il s’agisse de plantes à chlorophile, de moisissures ou de bactéries.

Variations de la teneur du Bacille Grass II° en azote avec la nature et la concentration de l'aliment azoté.

J’ai fait varier la nature ou la quantité de l’azote alimentaire, le milieu par ailleurs demeurant le même (la glycérine en tout cas reste l’aliment ternaire), dans le but de voir si ce changement peut déterminer aussi des variations dans la teneur en azote du baeille.

Comme sources d’azote j’ai employé: l’asparagine, l’acide aspartique, l’'urée, puis le Succinate d'ammonium, le Citrate d’ammonium, le tartrate. d'ammonium et le sulfate dammonium.

L’asparagine fut employée aux concentrations de 10 gr, 5 gr. et 2,25 gr. par litre. Le tableau n° 4 rend

Tableau N° 4.

Age de Poids sec moyen Teneur en azote la culture Nature de l'aliment azoté … nine” jar pour 100 gr. en jours de bacilles secs

gr.

20 Asparagine 5 %o 0,4058 8,300 » » 2,5/5 0,2505 6,147 » Urée 49/50 0,3690 8,114 22 Succinate d’ammonium

10,76 gr. °/00 0,4144 6,746 » Tartrate d’ammonium

12,22 gr. °/6 0,3591 6,720 » Citrate d’ammonium

10,76 gt. °/ 0,4090 6,1318 » Sulfate d'ammonituüm

8,76 gr, °/ 0,1072 6,318

» Acide aspartique.

4 gr, ‘lo 0,356 4,090

he: ee

compte de l’expérience et des résultats obtenus. La technique du dosage est restée la même que précédemment. Malgré les différences des poids des récoltes, on peut voir que les bacilles avaient dans tous les cas une alimentation suffisante permettant leur développement, même dans les milieux les plus pauvres en azote, c’està-dire contenant 5 gr. d’asparagine; la totalité de l’azote n’a pas été utilisée.

On voit que si l’asparigine est remplacée par de l’urée (avec même apport d'azote), la teneur des baciiles en azote n’est presque pas modifiée. Au contraire si on remplace l’asparagine par de l’acide aspartique on voit un abaissement assez sensible de la teneur des bacilles en azote.

Lobstein en 1922 a observé le même fait sur le bacille tuberculeux. En remplaçant l’asparagine par le Succinate d’ammonium (avec même apport d'azote) on constate une diminution du taux d’azote. Avec le Citrate d’ammonium, le Tartrate d’ammonium, le Sulfate d’ammonium et l’azotate d'’ammonium: même observation.

Avec le sterigmatocystis, Terroine, Wurmser et Monlané ont vu une influence nette dûe à la nature de l’aliment azoté.

En substituant l’urée, ou du nitrate d’ammonium ou du sulfate d’ammonium, ils voient une légère diminution de l’azote de 6 à 5,57 et 5,2 tandis que la guanidine produit une diminution sensible (3,3 gr. d’azote % bacille secs).

Variations de la teneur du bacille en azote avec la réaction du milieu.

Si on fait varier l'acidité ou l’alcalinité du milieu initial et que le taux de l’azote alimentaire reste constante, ces variations peuvent provoquer aussi des variations dans la teneur en azote, Le fableau n° 5 réunit les don-

es "OA mn

Tableau N° 5.

Poids moyen en

bacilles secs par ballon Teneur/en azoie

Nature de l'aliment azoté et pour 100 gr.

Age de la culture

nn jours réaction du milieu FE guide matt de Eh secs 22 4 30/66 0,2305 6,994 , [Asparagine 10°/0) 1504, 0,2840 7,146 s Alcalinité 15°/» 5/60 0,2545 7,150 » Neutre — 0,2251 7,810 » 10 °/50 0,3600 7,833 » 150756 0,4320 8,149 »y |Acidité | 20 °/60 0,3822 7,955 » 30°/50 0,3620 71,928

nées de l’expérience et les résultats obtenus. De l’inspection de ce tableau, on peut conclure qu’il y a une diminution de taux d’azote avec l’augmentation de l’alcalinité, tandis que en augmentant l’acidité on a au début augmentation (acidité 15%) et après il y a aussi une diminution.

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Variations de la teneur du Grassbacillus II° en matières albuminoïides avec la nature de l'aliment ternaire.

Technique: Le dosage des matières albuminoïdes a été fait selon la méthode de Voit qui se résume ainki qu'il suit:

On prend 2 gr. de bacilles frais cultivés sur le milieu initial, matière azotée: Asparagine 10%, on fait un broyage avec du sable de verre, puis on passe le tout dans une fiole jaugée de 250 cm, on ajoute 40 cm° d’eau distillée, 4-5 gouttes d’une solution de tropéoline 0,0. Ensuite on ajoute de l’acide de chlorhydrique concentrée goutte à goutte jusqu’à coloration rouge, puis 190 cm? d'alcool à 90°. On laisse reposer 6 heures et après on ajoute 5 cm? d’une solotion de sulfate de soude à

200 gr. %. On remplit le ballon avec de l’alcool à 96° et on laisse reposer encore une heuse, en agitant de temps en temps.

L'alcool en milieu acide précipite toutes les matières albuminoïdes. On filtre et on prélève 50 cm? du liquide dans un ballon Kjedahl de 1006 cm3. Après évaporation dans le vide de l’alcool, on fait la destruction de la matière organique et le dosage de l’azote soluble selon la méthode de Kjeldahl et dans l'appareil de Parnas-Wagner. On a ainsi l’azote non protéique.

D'autre part, sur un autre échantillon, on fait le dosage de l’eau suivi d’un dosage d’azote total.

Le calcul des matières albuminoïdes se fait d’après la formule suivante:

Azote. totale — Azote soluble — Azote albuminoiïde. Azote albuminoide X6,25—Matières albuminoïdes.

Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau suivant n° G:

Tableau N° 6.

Teneur en matières

Age de Nature de Azote Azote Azote albu= albuminoïdes pour la culture l'aliment totale % | soluble % | inoïde A ee en jours ternaire gr. gr. a:

20 Glycérine 8,320 1,4018 6,919 42,334 » Glycérine et 9,345 1,728 7,617 47,616 Glucose » Glucose 11,614 2,084 9,530 59,562 40 Glycérine 7,180 1,826 5,354 33,462 » Glycérine et| 8,524 2,180 6,344 39,650 Glucose » Glucose 10,246 2,450 7,196 48,725

Ce tableau montre que le taux des matières albuminoides au cours du développement passe par un

maximum et, d'autre part, que le bacille soumis à une

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inanition partielle continue à vivre aux dépens de sa matière albuminoïde propre. Il montre encore nettement que les bacilles cultivés sur des milieux glycérinés et glucosés et surtout sur le milieu glucosé possédent une teneur en matières albuminoïdes plus élevée que les bacilles cultivés sur le milieu glycériné.

Il est probable qu’il y a formation dans ces milieux d’aspartate d’ammonium et la présence de ce sel nous a créé beaucoup de difficultés au cours de nos expériences, pour le dosage de l’azote soluble, fait qui nous a empêché de suivre complètement la formation et la dépense des matières albuminoïdes au cours du développement, desideratum qui a exprimé Lobstein dans une de ses publications.

Nous comptons pouvoir procéder ultérieurement à cette recherche.

Variations suivant la nature de l'aliment ternaires de la teneur du Grassbacillus II° en phosphore total

c’est-à-dire: phosphore lipoïdique, phosphore nucléinique, phosphore organique soluble et phosphore mi néral soluble et insoluble.

Je vais d’abord décrire la méthode publiée par Machebœuf et j'indiquerai ensuite les modifications qu’il m’a paru intéressant et utile d'y apporter.

Méthode de Machebœuf: Elle comporte 5 opérations principales:

1) Destruction sulfonitrique des matières organiques du sang: Dans un tube à essai mesurant environ 20 cm. de long et 2 cm. de large, on ajoute 1 c.c. de sang puis 1 c.c. d'acide sulfurique concentré pur, on porte à une légère ébullition en chauffant pendant une dizaine de minutes, on laisse refroidir et on ajoute 1 cm$ d’acide nitrique fumant, on porte de nouveau à l’ébullition.

Après la disparition des vapeurs nitreuses et apparition d’une couleur brune on ajoute de nouveau quelques gouttes d’acide nitrique fumant et on continue à chauffer; la destruction est achevée, lorsque le mélange réactionnel est complètement décoloré ou ne possède qu’une faible teinte jaune.

2) Précipitation du phosphomolybdate d'ämmoniaque.

On laisse refroidir le liquide obtenu, puis on létend avec 6 cm d’eau distillée, on ajoute 2 cm? d’uné solution saturée d’azotate d’ammonium et on porte le tube dans un bain-marie bouillant. Après une dizaine de minutes, on introduit dans le tube à essai 6 cm d’une solution à 5 p. % molybdate d’ammonium, on agite, et on laisse encore 10 minutes dans le bain-marie.

Le précipité formé est rassemblé au fond du tube, une partie cependant surnage et grimpe le long des parois, on laisse refroidir, puis on ajoute 5 cm° d’alcoo!l à 95° qui rassemble dans le liquide le précipité déposé sur le paroï, on décante rapidement. Dans mes expériences, j’ai employé ce mode opératoire avec une légère modification consistant à supprimer l’emploi de l'alcool à 95°. Jai remarqué, en effet, que par l’addition d’alcoo!l le précipité est légèrement coloré en bleu et que le dosage du phosphore dans ce précipité donne un chiffre supérieur de 2 à 3 p. % à celui du phosphore contenu dans un précipité recueilli sans addition d'alcool.

3) Filtration.

Machebœuf s'était servi de l’appareil de Pregel voir fig. 1. En A est un filtre d'amiante fin tassé sur coton de verre, B est en relation avec une trompe à l’eau.

Le tube T doit descendre seulemnt à 1 em. du fond du tube à essai E.

On fait l’aspiration du liquide surnageant en ayant soin d'entraîner le moins possible de précipité. On rince ensuite avec 5 cm d’alcool à 50° et on décante de la

TS

même façon. On opère ainsi 5 lavages avec de l'alcool à 50° en rinçant les parois du tube et laissant déposer le précipité, avant de relier à la trompe à l’eau. Finalement le bouchon C est enlevé et avec quelques gouttes d’alcool à 50° on lave l’extrémité du tube T et l’intérieur de l’entonnoir A.

Le lavage ainsi terminé, le précipité de phosphomolybdate d’ammonium est en majeure partie resté au fond du tube à essai, une partie cependant est en A sur l'amiante.

4) Dissolution du précipité.

Le bouchon est enlevé de la fiole conique que l’on vide et rince avec de l’eau distillée, ainsi que l’extrémité F de l’entonnoir A. L'appareil étant remonté, on verse dans le tube E quelques cm? d’ammoniaque diluée de 4 volumes d’eau distillé et l’on remet l’appareiïl en communication avec la trompe à eau ouverte très modérément afin que le passage de l’ammoniaque soit lent. Cet ammoniaque dissout le précipité et la solution obtenus est recueillie dans la fiole conique. On rince 2 ou 3 fois le tube à essai et le filtre.

J’ai modifié l’appareil de Pregel comme le montre la figure 2.

Je remplace le filtre d'amiante à courte tige par un filtre d'amiante A’ modèle G. Bertrand N° 4 à longue tige qui, passant par la boule B’ pénètre dans une fiole en pyrex de 250 cmÿ.

La boule B° à l’aide d’un bouchon en caoutchouc

est mis en communication avec la fiole en pyrex de 250 cmè.

La marche de l'opération reste la même, mais celleci est simplifiée parce qu'après le lavage complet du précipité du phosphomolybdate d’ammonium par l’alcool, on lave l'extrémité de la tige, on remplace la fiole par une autre propre. On continue l’opération par la dis-

£ oN ‘8

= Tue

solution du précipité et enfin on passe au titrage du phosphomolybdate.

5) Titrage du phosphomolybdate.

La solution contenue dans la fiole conique est introduit dans un ballon genre Kyeldahl de 200 cm°. On ajoute 10 cm? d’une solution 1/25 de soude et une petite cloche capillaire, puis on porte à l’ébullition dans le vide.

L’ammoniaque libre ainsi que l’ammoniaque fixée à l’acide phosphomolybdique et que déplace la soude est éliminée par la chaleur après une quinzaine des minutes, ainsi qu’on peut le contrôler au moyen d’un papier de tournesol rose humide placé dans les vapeurs sortant du col du ballon.

On ajoute 10 cm* d’une solution d'acide sulfurique 1/25, on porte de nouveau à l’ébullition pendant 2 minutes, puis on fait le titrage de l’excès d’acide sulfurique par la soude à chaud et en présence de phénolphtaleine.

La couleur rose obtenue par la neutralisation de l'acide doit persister cinq minutes; s’il n’en est pas ainsi, on ajoute au liquide pour y réussir une goutte de la soude 1/25.

Le nombre des cm? de soude versés multipliés par 0.0448 donne en milligrammes le poids de phosphore contenu dans la prise d’essai.

Ici j’ai simplifié complètement le dispositif employé par Machebœuf, ce qui m’a permis d’éviter de faire des transvasements, cause possible de pertes pendant cette opération.

Dans la solution phosphomolybdique ammoniacale contenue dans le récipient, on ajoute quelques gouttes de phénolphtaleine, on porte à l’ébullition 10 minutes, lammoniaque libre est éliminée et on a une faible coloration rose, on ajoute 10 cm de soude 1/25 on porte à l’ébulition 10 minutes pour chasser l’'ammoniaque com-

un NE

binée puis on ajoute 10 cm* d’acide sulfurique 1/25 et on titre à chaud l’excès de cet acide par la soude 1/25.

C’est un fait bien connu en physicochimie que les bases fortes telles que (Na. OH) sont capables de déplacer les bases faibles (NHAOH) ; donc il n’y a nul besoin d'utiliser le mnodus operandi de Machebœuf.

En résumé la méthode envisagée par nous peut se résumer ainsi qu’il suit:

1) Destruction sulfo-nitrique des matières organiques du Grassbacillus I. Dans une fiole Kjeldahl de 25 cm on introduit 0.2 grammes de bacilles frais 2-3 cm d’acide sulfurique concentré, on porte à l’ébullition en chauffant légèrement pendant 10 minutes, on laisse refroidir et on ajoute 1-2 cm° d'acide azotique fumant, on porte de nouveau à l’ébullition. Après la disparition des vapeurs nitreuses et apparition d’une couleur brune, on ajoute de nouveau quelques gouttes d'acide nitrique fumant.

La destruction est terminée lorsque la décoloration est complète ou bien lorsque le mélange n’a plus qu’une coloration faible jaune pâle.

2) Précipitation du phosphomolybdate dammonium.

On laisse refroidir le liquide ainsi obtenu puis on l’étend avec 6 à 8 cm? d’eau distillé, on ajoute 2 à 3 cm* d’une solution saturée de nitrate d’ammonium et on porte la fiole dans un bain-marie bouillant. Après 15 minutes, on introduit dans la fiole 6 à 8 cm d’une solution à 5% molybdate d’ammonium, on agite et on laisse séjourner 10 minutes dans le bain-marie.

Le précipité formé se rassemble au fond de la fiole, une partie surnage et grimpe le long des parois. On laisse refroidir, puis on abandonne quelques minutes pour que le précipité se rassemble au fond et on procède à la filtration.

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3) Filtration.

L'appareil de filtration modifié par nous comme il est indiqué dans la figure n° 2 est relié à une trompe à eau, on fait fonctionner celle-ci par l'intermédiaire du tube C en faisant descendre progressivement le tube T vers le fond de la fiole E, en ayant soin d’entrainer le moins possible de précipité.

On lave ensuite la fiole avec 5 cm? d’alcoo!l à 50° on laisse se déposer le précipité, on décante et on filtre.

On fait ainsi 5 lavages avec l’alcool à 50° en rinçant chaque fois les parois de la fiole et laissant se déposer le précipité avant de faire fonctionner la trompe à l’eau. Finalement on enlève le bouchon C et à l’aide d’une pissette on lave avec de l’alcool à 50° l’extrémité du Tube T et les parois intérieures de l’entonnoir du filtre d'amiante.

4) Dissolution du précipité.

On enlève le bouchon D, on le lave ainsi que la tige du filtre par l’alcool à 50°, puis on remplace la première fiole en pyrex (250 cm°) par une autre propre.

On dissout le précipité dans la fiole E par quelques cm d’ammoniaque diluée de 4 volumes d’eau, on remet l’appareil en communication avec la trompe à eau ouverte très modérément, pour que le passage de la solution ammoniacale soit lent. Le précipité étant dissous on lave avec soin 2 à 3 fois la fiole E avec de la solution d’ammoniaque au 1/4 en faisant passer chaque fois le liquide dans la fiole en pyrex. On lave aussi 2 fois le bouchon C et le filtre d’amiante avec la solution d’ammoniaque, puis on lave 2 à 3 fois à l’eau distillée: la fiole E, le bouchon C, le filtre et la tige du filtre d'amiante.

5) Titrage du phosphomolybdate d’'ammonium.

Dans la solution de phosphomolybdate d’ammonium contenue dans la fiole en pyrex, on ajoute 5 gouttes d’une solution alcoolique de phénolphtaleine à 1 %, on

OU

porte à l’ébullition jusqu’à coloration rose faible, puis on ajoute 10 cm d’une solution de soude N/25 on porte de nouveau à l’ébullition pendant 10 minutes, on ajoute 10 cm* d’une solution d’acide sulfurique N/25, on porte de nouveau à l’ébullition pendant 2 minutes, et on fait le titrage de l’acide sulfurique en excès par une solution de soude N/25 jusqu’à ce que la coloration rose obtenue persiste pendant 5 minutes. Le nombre de cm° de soude versés correspond à la quantité de soude combinée à l’acide phosphomolybdique. En multipliant ce nombre par le facteur 0.0448 on obtient le poids de phosphore (exprimé en milligrammes) contenu dans la prise d’essai.

LM

Méthode de dosage du phosphore, nucléinique, du phos-

phore lipoidique, du phosphore organique soluble,

du phosphore. minéral soluble et du phosphore mi-

néral insoluble.

Méthodes indiquées par Javillier et ses élèves.

Javillier et H. Allaire en 1925 indiquent une méthode générale pour le dosage de phosphore: lipoiïdique, organique soluble, nucléinique, minéral soluble et insoluble sur la même prise d’essai elle se résume ainsi: La substance à l’état de poudre fine est introduite dans une fiole spéciale de 90 cm? en verre dépoli, à large ouverture, renfermant des billes de verre, puis traitée par 75 em° d’un mélange d’alcoo!l à 96° (2 parties), et d’éther (1 partie), on bouche le flacon et on le soumet à un mouvement continu autour de son axe à l’aide d’un dispositif approprié; grâce à ce mouvement et aux chocs multipliés des billes de verre, la poudre cède au solvant les lipoïdes et l'extraction est totale, si, après filtration, on répète la même opération.

À la fin, il reste un liquide renfermant tous les lipoides et une poudre qui contient le phosphore nucléinique et le phosphore minéral soluble et insoluble. Le

ER

liquide éthero-alcoolique est distillé dans le vide, le résidu est déshydraté par de l’alcool absolu. Le résidu provenant de la distillation dans le vide de l'alcool absolu, est extrait par l’éther anhydre, et ensuite par de la benzine. Sur le résidu éther-benzénique, on effectue le dosage de phosphore lipoïdique. La poudre après séparation des lipoïdes est traitée par une solution de chlorure de sodium à 15 p. %, afin de dissoudre les substances nucléiniques et les phosphores minéraux solubles. Pour y réussir, la poudre est projetée dans 25 cm* d’une solution bouillante de Nacl à 15 p. % contenue dans un vase à précipitations chaudes et maintenue à l’ébullition 10 minutes.

On introduit ensuite la poudre et le liquide dans une fiole jaugée de 50 cm° et l’on complète à 50 cm avec de la solution de chlorure de sodium à 15 p. %, on agite le mélange et on laisse en contact pendant 6 heures en agitant de temps en temps.

On prélève 25 cm? du filtrat dans un tube à centrifuger. Aux 25 cm° du filtrat, on ajoute lentement et en agitant 10 gouttes d’acide chlohydrique 1 p. 2. Il se forme un précipité contenant les substances nucléiniques et pour entraîner ce précipité au fond, on ajoute quelques gouttes d’une solution d’azotate d'argent à 5p. % qui, formant un précipité de chlorure d’argent augmente la masse du précipité et facilite la formation d’un dépôt au fond du tube par une centrifugation de 10 minutes.

Le précipité est dissous dans l’acide nitrique concentré; cette solution est versée en totalité dans un matras de Kjeldahl et soumise à la destruction nitrique. L’acide phosphorique obtenu est dosé d’après la méthode de Copaux.

La méthode préconisée par Javillier et H. Allaire permet-elle d'extraire la totalité des lipoïdes? On peut répondre par la négative. C’est la conclusion qui se dégage des critiques faites par Lemeland à la méthode de