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organique, l'azote nitrique et les sels ammoniacaux sont parfaitement utilisés (surtout les azotates) et que parmi les composés azoztés organiques, seules les substances qui renferment une fonction amide telles que: l’'asparagine, l'Urée etc. peuvent être assimilées sous l’action de l'énergie solaire, les amines et les acides aminés n'étant pas en milieu aseptique. Boussingault a montré aussi que l’azote atmosphérique n’est pas utilisé par les végétaux supérieurs, mais Hellriegell et Wilfarth disent que les végétaux qui assimilent l’azote atmosphérique n’effectuent cette assimilation qu'indirectement par l'intermédiaire de microorganismes, formant avec eux une association symbiotique.

L'alimentation minérale exclusive fut méconnue jusqu’en 1840. A cette époque Liebig affirma leur nécessité absolue et en 1842 Wiegmann et Polstorff, appliquant la méthode des cultures sur sable, faisaient connaître le rôle essentiel des principes minéraux dans la végétation. Les études de Sachs, Knop, Stochmann, Nobbe, Oltmanns, ont démontré qu’en outre de l’hydrogène, de l’oxygène, de l'azote et du carbone sont indispensables pour un développement normal du végétal: le phosphore, le soufre, le potassium, le calcium, le magnésium. En outre, suivant les espèces, tel élément devra être dominant. D’après les travaux de G. Bertrand, la présence de Manganèse au moins à l’état de traces, est nécessaire pour l'organisme végétal ou animal, dans lesquels il joue un rôle essentiel dans les phénomènes d’oxydation. Le bore interviendrait aussi utilement dans la croissance des végétaux, d’après Agulhon.

Bertrand se demande si les six corps simples énoncés plus haut sont suffisants; si d’autres corps que l'analyse chimique n’a pas permis de déceler encore, ne sont pas moins nécessaires et si ces substances ne se trouvent pas à l’état d'impuretés dans ces composées chimiques. Chez les végétaux inférieurs, les recherches

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ont été beaucoup plus nombreuses et plus précises, en raison de la rapidité avec laquelle ces êtres se développent, en raison aussi des conditions expérimentales et encore en raison de ce fait que l’apport de l’aliment réalisé par la minime quantité de matière ayant servi à l’ensemencement, peut être considéré comme négligeable. Les recherches mémorables de Raulin effectuées de 1864—1870 sur les stérigmatocystis et qui servent de modèle pour l’étude du développement des champignons, montrent que la moindre modification apportée à la composition du liquide dont il se servait (Liquide de Raulin) amenait des modifications dans le corps du champignon soumis à ces expériences. La composition de ce liquide est si bien choisie que les stérigmatocystis s’y développent en formant une culture pure, abondante et que tous les autres microorganismes y sont détruits. Raulin reconnut indispensables au développement de cette moissure les éléments suivants: Phosphore, soufre, Potassium, Magnesium, Fer, Zinc, Silicium et Calcium. Comme ici il n’y a pas d’assimilation chlorophyleienne, il faut au Stérigmatocystis un aliment hydrocarboné, qui lui apportera le carbone nécessaire — et Raulin choisit le saccharose. L’azote a été fourni sous la forme des sels ammoniacaux (azote, phosphate et sulfate d’ammonium) et la fixation d’azote se fait d’après lui, sous l'influence de l’énergie apportée par l'aliment hydrocarboné.

La partie la plus intéressante des travaux de Raulin fut lexplication du rôle des éléments secondaires (Fer, Zinc) qui agissent d’après lui comme catalyseurs. Ces résultats ont été contestés par Coupin et par Lepierre mais par contre ils ont été confirmés par Javillier et ce dernier a constaté que 0,8 gr. de Zinc par litre, permettent de doubler la récolte. D’après Javillier le zinc, fixé par les cellules du sférigmatocystis réduirait les dépenses d’entretien en hydrates de Carbone

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et en azote ammoniacal, en faveur de la construction de nouveaux tissus.

Dans les cendres les proportions de soufre et de magnesium diminuent, tandis que celles de phosphore, de silicium et de fer augmentent.

. G. Bertrand a montré que la manganèse dans la proportion d’un décimilliardème augmente la récolte de plus de la moitié. Bertrand et Javillier ont montré aussi que le cuivre, le glucinium, l’uranium et le Cadmium se comportent de même. Pour les bactéries, qu’elles soient aérobies ou anaérobes, les milieux de culture, solides ou liquides doivent contenir: des matières azotées, des matières hydrocarbonées et des sels minéraux, parce que les microbes sont constitués par ces trois catégories de substances. Lorsqu'on fait l’analyse des cendres de ces microorganismes, on y constate toujours la présence du soufre, du potassium, du magnesium et du phosphore. Et ces éléments sont indispensables au développement normal des levures, des moissures et des végétaux supérieurs.

Pichard et plus tard Deheran signalèrent l’action favorisante des sels de chaux sur le développement des bactéries nitrifiantes. Ce fut Pasteur qui imagina de cultiver les bactéries dans des solutions salines, les sels étant fournis par des cendres de levûre. En se basant sur ces observations Cohn a préparé un milieu chimique défini constitué par des corps simples en quantités variables, suivant l’espèce du microbe étudié. Très variable est la nature des aliments azotés organiques choisis. L’aliment azoté peut être: la peptone ou ses produits de désintégration (acides aminés, asparagine, leucine) ou bien des corps azotés déjà minéralisés (nitrates et sels ammoniacaux). Arnaud et Charrin (1891) s'étaient servis de milieux contenant des sels minéraux et de l’asparagine.

Ouichinsky (1893) a employé pour les microbes de la diphtérie et du choléra des milieux synthétiques contenant: glycérine, lactate d’ammonium et asparagine. Il faut reconnaître que ces milieux ont été créés pour les besoins bactériologiques et non pour l’étude chimique, des milieux de cultures.

Pour le bacille tuberculeux on trouve dans la littérature de nombreuses formules de milieux, parce que comme dit Grimbert, il y a presque autant de manières de préparer ces milieux, qu’il y a de laboratoires et d'autre part qu’à côté des bactériologistes, des chimistes ont étudié ce bacille.

D'une manière générale les milieux sont constitués par du bouillon de viande glycériné-peptoné, Chlorure de potassium, Phosphate dipotassique, du monophosphate de magnésium, du glucose, des dextrines, de l’urée.

Liebig y décela de la créatine et créatinine, de l’acide inosique, de l’acide sarcolastique. Gautier y trouva toute une série de ptomaines: Xantocréatine, chrystocréatinine, amphycréatinine, pseudoxanthine etc.

En Allemagne, dans le laboratoire de Koch on a reconnu comme éléments minéraux indispensables: le phosphore, le potassium, le magnésium, le chlore sous la forme de chlorure de sodium; l’aliment azoté était fourni sous la forme minérale ou organique et l’alimentation hydrocarbonnée était assurée par la glycérine à laquelle furent ajoutés tantôt des sucres, tantôt des acides organiques ou des alcools polyatomiques, mais la glycérine a été reconnue indispensable.

En même temps des recherches méthodiques et précises furent poursuivies en France par: Calmette, Massol et Breton (1909). Ces auteurs ont étudié la valeur alimentaire des diverses substances azotées ajoutées aux milieux chimiques définis, contenant soit de la glycérine, soit du glucose, soit les deux. Comme aliment azoté, ils préconisent la peptone (10 gr. p. #) l’asparagine, ou la succi-

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nimide (2.5 gr. p. %) et comme substance ternaire la glycérine (40 p. %) le glucose (10 gr. p. %) en remplacement de la glycérine. Avec le glucose seul la récolte est diminuée de moitié, mais son addition à la glycérine double presque le rendement.

Baudran (1909-1910) cultive le bacille tuberculeux dans des Glycérophosphates: de potassium, de sodium, de Calcium, de Magnésium, additionnés d’Albumose et de Glycérine. La présence de Glycerophosphateé de Fer ou de Manganèse modifie la morphologie et la virulence du bacille. À. Delille, Mayer, Schæffer et Terroine (1912— 1913) procédant par voie analytique, constatent, contrairement à Raulin, que la culture sur bouillon de viande sans peptone est faible, parfois nulle, que les solutions de peptone additionnées de sels et de glycérine donnent une récolte dont la richesse varie avec la nature de la péptone employée: moyenne avec la peptone de Chapoteaut et la peptone de Vitte, très pauvre avec la peptone de soie et, qu’en général, le rendement est inférieur à celui obtenu avec le bouillon peptoné. Enfin ils ont obtenu avec de la peptone préparée avec la chair musculaire soit par action diastasique, soit par l’acide chlorhydrique une récolte très abondante, même si on ajoute de la peptone commerciale et ils expliquent ces résultats d’après la teneur de la peptone en acides aminés (peptone de soie d’abord, puis peptone de Vitte et après peptone de Chapoteaut).

Partant de ces résultats, ils composèrent un bouillon de viande synthétique auquel ils ajoutent: des sels minéraux, des ac. aminés, des matières extractives, puis du Glucose, de la glycérine et de l’inosite comme substances ternaires et il se produisit un voile épais au bout de 15 jours (milieu 104).

En 1915, ils préparèrent un autre milieu plus simple (milieu 164), mais qui donne des cultures aussi belles et aussi rapides en 8 jours. Ce milieu contient les mêmes

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sels minéraux, du glycocolle (acide monoaminé) comme substance azotée et l’arginine (acide diaminé) en remplacement des substances extractives. Donc, en résumé, le bacille tuberculeux contrairement aux plantes vertes, assimile très bien les acides aminés. Sauton partant d’un milieu chimique contenant du soufre, du phosphore, du potassium, du magnésium et du fer, constate que la culture est impossible en l’absence de phosphore et de potassium, (celui-ci ne peut pas être remplacé par du sodium, du lithium et du calcium, mais on peut lui substituer en partie du rubidium).

Récemment (1922) À. Borrel, de Coulon, Bæœz et Gutmaud ont composé un milieu renfermant également comme celui de Frouin, de la Glycérine et du Glucose mais riche en substances minérales. Après 20 jours ils ont obtenu une culture moyenne de 0,5 gr. à 1 gr. sur 140 cm de liquide dans les boîtes de Roux.

Lobstein (1922) a composé un milieu chimique très simple et suffisant pour donner une culture abondante.

C’est le milieu préférable pour les chercheurs qui veulent étudier les modifications chimiques qui se passent dans la composition des microorganismes en fonction des variations du milieu nutritif.

Tels sont les principaux milieux chimiquement définis pour le développement de microorganismes, mais à notre avis il n’en existe pas de meilleur que celui établi par Raulin pour le Sterigmatocystis quand on n’a en vue que la richesse de la récolte.

RECHERCHES PERSONNELLES Composition du milieu

Les recherches que j'ai entreprises pour choisir un milieu favorable pour obtenir une culture suffisante, sans

me préoccuper d’un rendement maximum, m’ont amené à cette conclusion que le milieu de M. Lobstein est le meilleur pour la culture du Grassbacillus IT.

Ce milieu relativement simple est constitué par: du phosphore, du soufre, du potassium, par de l'acide citrique, du magnésium, de la glycérine et de l’asparagine dans les proportions suivantes:

Phosphate monopotassique ........ 150%6r.

Sulfate de magnésium ............ L »

ACider CHEQUE A far fes GR Re 1 > ASDATADINE NA ARTE MUR 10 > Glycérine neutre (D—1,26) ........ 40 »

au OS SN CEE Re —1000 cm >»

L’acide citrique est ajouté, comme le dit Lobstein pour empêcher la précipitation du phosphate trimagnésique.

Je me suis servi pour la préparation de ce milieu de corps chimiquement purs.

Le liquide nutritif était réparti dans des ballons de 500 cm° à raison de 50 cm liquide nutritif par ballon. Il était stérilisé à l’autoclave à 120° pendant vingt minutes.

Après stérilisation, le liquide a été ensemencé avec une parcelle de voile d’une culture âgée de 8 à 10 jours, provenant d’une culture de Grassbacillus race. Sartory, adaptée à ce milieu.

Les ballons ensemencés ont été placés à l’étuve à 36°-37°.

Le développement de la culture a été rapide et abondant: au troisième jour la couche bacillaire couvre la surface du liquide et grimpe légèrement sur les parois du ballon; au 8-% jours le voile est épais, gaufré et au 20° jour, la récolte moyenne par ballon (moyenne de 3 ballons) a été de 0,42 gr. de bacille sec. Si on diminue l'acidité du milieu par de l’hydrate de soude au lieu d’hy-

drate de potasse et en quantité suffisante pour avoir une acidité de 15 p. %, on constate que la récolte est légèrement diminuée.

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Influence de la réaction du milieu.

La réaction du milieu est acide. L’acidité calculée en présence de phénolphtaleine, comme indicateur, jusqu’à coloration rose-pàle—32 cm de liqueur normale de potasse. La concentration en ions H calculée par la méthode électrométrique, avec l’appareil Vlés-Velinger est égale à Ph—6,6.

Cette détermination est plus précise, parce que la présence des corps dits «tampons» (asparagine et phosphate) s’oppose à des brusques changements d’acidité ou d’alcalinité, et, par suite à un brusque changement de teinte de l’indicateur.

Le Comité de «L’American Public Health Association» en 1898, indique de neutraliser en présence de phénol-phtaleine le bouillon de viande (glycérine peptonée) et recommande d’ajouter ensuite 15 cm° d’hydrate de soude, ou plus exactement d’ajouter une quantité de soude telle qu'après stérilisation, il soit nécessaire d’employer 15 cm* d’acide chlorhydrique normal pour neutraliser 1 litre de liquide nutritif.

Nicolle conseille d'ajouter de la soude jusqu’au virage de phénol-phtaleine plus 10 cm* hydrate de soude pour %o.

On a reconnu que les milieux synthétiques donnent de bons résultats lorsqu'ils sont acides.

Bezançcon, Philibert et Baudin fixent l'acidité maxima à 0,70 p. % exprimée en acide phosphorique (soit 14 cm* acide phosphorique normal).

Au contraire le milieu de Baudran est neutre et celui préconisé par Delille, Mayer, Schæffer et Terroine pos-

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sède une alcalinité de 4 em° de soude normale par litre, de même que certains milieux de Calmette, Massol et Breton.

Donc la réaction optima pour les milieux synthétiques est variable avec la constitution du milieu.

Toutes mes recherches ont été faites avec le mi-lieu de Lobstein dont nous avons indiqué plus haut la formule. J’ai expérimenté sur des milieux soit neutres, soit alcalins dont l’alcalinité était égale à 5, 15 et 30 cm° de liqueur normale de potasse par litre, soit acides dont l'acidité était égale à 10, 15, 20 et 30 cm* de liqueur normale par litre en présence de phénolphtaleine comme indicateur. Dans tous ces essais, j'ai utilisé la solution de potasse normale. L’ensemencement a été effectué le même jour, avec la même quantité äu bacille adapté à ce milieu et âgé de 10 jours. Les résultats obtenus sont indiqués dans le fableau I. Des résultats inscrits dans ce tableau, on peut tirer la conclusion suivante: Le développement des bacilles est plus marqué sur les milieux acides et le développement maximum a lieu dans les solutions contenant de 15 à 17 cm de liqueur normale par litre. En présence d’un excès de potassium (sous la forme de potasse) il y a une diminution de récoltes.

Cette diminution est peut-être en fonction de l’hydrolyse de l’asparagine en présence de fortes alcalinités, ce qui a pour résultat de dégager de l’ammoniaque qui intoxique les bacilles; c’est l’opinion de M. Lobstein.

Sur le milieu alcalin on voit que, au fur et à mesure qu'on augmente l’alcalinité, la croissance des bacilles est en retard. Il est donc démontré que les deux limites d’acidité et d’alcalinité entre lesquelles le bacille peut se développer dépendent de plusieurs facteurs et surtout de la composition du milieu.